一种自体美容微针制剂的制备方法及其应用与流程

本发明属于美容微整形技术领域，具体的说是一种自体美容微针制剂的制备方法及其应用。

技术背景

面部抗衰老是目前美容外科越来越热门的课题。随着生命科学的发展和医学的进步，在预防和抗衰老方面取得了一定的进展。面部衰老最直接的体现是在皱纹和色斑的表现上，除皱和祛斑成为人们越来越关注的话题。

随着人们生活水平的提高，人们对精神生活水平有了更高的要求，对气质外形的要求，对美的要求越来越高。面部年轻化是通过各种方法延缓和抵御面部皮肤的衰老，使面部保持甚至恢复年轻化外貌。微针注射技术因其微创、无痛，且恢复快和效果好的优点，受到了广大爱美人士的青睐。

成纤维细胞是真皮组织中的主要细胞，具有很强的分裂、增殖能力，还能够分泌胶原等细胞外基质蛋白以及细胞生长因子，分泌的基质蛋白能够有秩序的重建皮肤组织，恢复其原来的整体性，对除皱和淡化疤痕，增加皮肤的光滑性有很好的促进作用。内皮祖细胞促进微血管的形成，改善皮肤的供血和营养状态，同时又能协助免疫细胞带走代谢产物，对色斑和黯沉肌肤有改善作用。免疫细胞能够吞噬代谢产物，并能够分泌丰富的白细胞介素、转化生长因子及各类生长因子等，包括TGF-β、EGF、FGF、IL-2等，能够促进细胞和组织的修复，还能消除色素沉着，促进伤口愈合，不留疤痕。而自体PRP含有丰富的血小板和各类细胞因子，能够加速成纤维细胞、血管内皮细胞对皮肤组织的修复作用。

但是现有的富血小板血浆（PRP）等美容制剂，其除皱的效果不够明显，特别是对色斑的淡化效果较差。因此，进一步提高美容制剂的除皱和淡化色斑效果，是目前需要解决的问题。

技术实现要素：

为解决现有技术的问题和缺陷，本发明目的在于提供一种有效的自体美容微针制剂及其制备方法，从而达到有效的除皱和淡化色斑，改善肤质的效果。

为实现上述目的，本发明所提供的自体美容微针制剂，包含自体外周血来源的PRP，外周血单个核细胞（PBMCs）经过培养获得的循环成纤维细胞、内皮祖细胞和免疫细胞，以及自体血浆。

为实现上述目的，一种自体美容微针制剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1）：离心自体外周血，获得自体血浆层与细胞层；

步骤2）：自体血浆层经过离心浓缩后得到富血小板血浆，保持其未激活状态，并对血浆和富血小板血浆进行低温储存。

步骤3）：细胞层进一步分离获得人外周血单个核细胞；

步骤4）：将分离的人外周血单个核细胞置于含有活化细胞因子溶液的细胞培养基中，进行诱导培养；

步骤5）：培养12-36h，离心收集细胞，用新鲜含有活化细胞因子溶液的细胞培养基重悬细胞，继续培养；

步骤6）：培养至100-140h，收集细胞，用自体血浆重悬细胞并加入保存的富血小板血浆，即得到本自体美容微针制剂。

优选的，所述步骤1中，具体包括以下步骤：采集自体外周静脉血，300 ~ 500 g、室温离心10 ~ 20分钟，离心结束后，使用巴氏吸管收集血浆层放入新的离心管中。

优选的，所述步骤2中，将含有血小板的自体血浆1000 ~ 2000 g，室温离心10 ~ 20分钟。将上层血清收集到新的离心管中，与下层沉淀分离（分离时保留底层3-5ml血清在管中不取出）。管中剩余的3-5ml血浆与血小板沉淀重悬得浓缩PRP。

优选的，所述步骤3中，用生理盐水对倍稀释下层血细胞，加入含淋巴细胞分离液的离心管中，500 ~ 800 g，离心15 ~ 25分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，即得到外周血单个核细胞PBMCs。

优选的，所述步骤4中，细胞培养基为基础培养基。

优选的，所述步骤4中，重悬后初始培养的PBMCs的密度为0.5 ~ 2.0 ×10⁶/ml。

优选的，所述步骤4中，活化细胞生长因子溶液配制方法为，每ml细胞培养基中加入30μl活化细胞生长因子。

优选的，所述步骤4中，活化细胞因子为碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和干细胞生长因子。

优选的，所述步骤6中，收集细胞主要包括循环成纤维细胞，内皮祖细胞，免疫细胞。

此外，本发明还提供了所述美容微针制剂的保存和使用方法，包括：本美容微针制剂的保存温度为2-8℃。本美容微针制剂可以应用于医美产品，使用在皮肤表面，使用剂量为0.1-3ml/cm²。

本发明的优点在于：

（1）本发明采用自体细胞和PRP，制备方法简单，成本低廉，安全性更高。

（2）本发明采用活化细胞因子溶液处理细胞，诱导培养了循环成纤维细胞对皮肤组织的重建，恢复其整体性，并能分泌胶原蛋白，恢复皮肤弹性，起到填充和祛除的效果；

（3）本发明采用活化细胞因子溶液处理细胞，诱导培养了内皮祖细胞，能发挥促进皮肤局部的微循环，改善皮肤营养状态，同时又能协助免疫细胞带走代谢产物，对黯沉、色斑肌肤问题具有很好的效果。

（4）本发明采用活化细胞因子溶液处理细胞，诱导培养了免疫细胞，免疫细胞能够吞噬代谢产物，并能够分泌丰富的白细胞介素、转化生长因子及各类生长因子等，包括TGF-β、EGF、FGF、IL-2等，能够促进细胞和组织的修复，还能消除色素沉着，促进伤口愈合，不留疤痕。

（5）自体PRP含有丰富的细胞因子，能够加速成纤维细胞、血管内皮细胞对皮肤组织的修复作用。

（6）本发明使用这四种物质作为美容微针制剂，它们之间的相互作用，进一步提升了皮肤组织重建、除皱、淡化色素、改善肤色等功能。

附图说明

附图1：为实例1分离的外周血单个核细胞图片；

附图2：为实例2和3培养到第3天和第5天的细胞图片；

附图3：为实例3细胞流式表型分析结果；

附图4：为实例4受试者使用本美容微针制剂前的皮肤照片；

附图5：为实例4受试者使用本美容微针制剂十八天后的皮肤照片；

具体实施方式

下面以实例来说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实例1

本实例1是分离自体PRP以及外周血单个核细胞PBMCs：

在无菌条件下用20ml注射器采集患者外周静脉血20ml，用肝素钠抗凝。将抗凝的外周血转移到50ml离心管中，400g，离心15分钟，离心结束后，使用巴氏吸管收集血浆层转移至新的15ml离心管，吸取至细胞层上1-2毫米为止。将含有血小板的自体血浆1500g，15分钟。将上层血浆收集到新的15ml离心管中，与下层沉淀分离（分离时保留底层3-5ml血浆在管中不取出）。管中剩余的3-5ml血浆与血小板沉淀重悬得浓缩PRP。将浓缩PRP与剩余血浆置于-80℃保存；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按照1:2的比例加入离心管中，680g/分钟，离心20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为500g/分钟，410g/分钟，均离心7分钟，得到外周血单个核细胞（PBMCs）。

实例2

本实例2是在体外诱导成纤维细胞、内皮祖细胞和免疫细胞：

将分离的PBMCs用活化细胞初始培养基（含有活化细胞因子溶液）重悬，控制细胞密度在1×10⁶cells/ml，将细胞移入T75培养瓶中，摇匀，放置于CO2培养箱中饱和湿度、37℃、5%CO2浓度培养。

培养2天后，500g/分钟，离心6分钟，收集细胞，将细胞沉淀用活化细胞初始培养基（含有活化细胞因子溶液）重悬，并转移到T75培养瓶中，摇匀，放置于CO2培养箱中饱和湿度、37℃、5%CO2浓度继续培养。

实例3

实例3是对上述培养的细胞进行质量检测

对培养第3天的细胞进行形态学、纯度、细胞表型检测、细胞数量、活率、无菌、内毒素等。具体操作包括以下步骤：取0.5ml细胞液采用细胞计数仪计数，台盼蓝染色计细胞活率，流式细胞仪检测细胞表型（CD45、CD3、CD56、CD34、CD31、CD42b、波形蛋白（Vimentin））；离心收集细胞上清液，采用梅里埃全自动微生物检测系统检测细菌和真菌，LONZA支原体检测试剂盒检测常见支原体，鲎试剂检测内毒素。经检测，在第3天，细胞数量为2.72×10⁷cells（n=20），台盼蓝染色计细胞活率达到92.6%（n=20），细胞表型检测CD34+细胞达到0.8%，其中内皮祖细胞占到84.7%，循环成纤维细胞占到20.8%，免疫细胞的比例为59.2%（n=20）、全自动微生物分析仪检测细菌、真菌均为阴性（n=20），肺炎支原体检测结果为阴性（n=20），内毒素含量≤0.5EU/ml（n=20）。

实例4

本实例4是用自体血浆重悬细胞并加入自体PRP，制备本美容微针制剂。

培养5天后，500g/分钟，离心6分钟，收集细胞；将收集的细胞用生理盐水洗涤2次，500g/分钟，离心6分钟，弃去上清液。

将37℃迅速解冻的自体血浆900g，离心10分钟，上清液即为用于微针制剂制备的自体血浆；用该自体血浆将洗涤好的细胞重悬，定容到9ml，将冻存的PRP置于37℃水浴锅中复苏，取3ml复苏后的PRP加入到细胞悬液中，摇床振荡20分钟后将其转移到2支5ml冻存管中，每管5ml，此即为本美容微针制剂。剩余制剂转移到2ml细胞冻存管内密封，-20℃保存6个月留样待查。

实例5

本实例是用招募受试者试用本微针制剂。

招募20名年龄30-60岁的中国女性受试者，试用本美容微针制剂，告之每位受试者本美容微针制剂的整个研究过程，并签署知情同意书。

对20名受试者面部采用微针注射本美容微针制剂9-10ml，根据受试者面部情况，评估各部位注射剂量；其中法令纹部位左右各注射0.5-1.5ml，泪沟部位左右各注射0.2-1ml，木偶纹部位左右各注射0.3-1.2ml，鼻根部位注射0.1-0.5ml，全部面部皮肤注射3-6ml。连续观察一个月，期间不使用其他护肤产品，正常活动，注意防晒。如图例所示，图3为使用前的皮肤照片，图4为使用本美容微针制剂后一个月后的皮肤照片，通过对比可知，注射本美容微针制剂后，皮肤变得白皙光洁，细纹大量减少。