一种治疗缺血性脑中风的Tat‑SPK2肽及其应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种治疗缺血性脑中风的tat-spk2肽及其应用。

背景技术：

脑中风又称脑卒中或脑血管意外，是一组以脑部缺血或出血性损伤症状为主要临床表现的疾病，主要分为出血性脑中风(脑出血及蛛网膜下腔出血)和缺血性脑中风(脑梗塞及脑血栓形成)两大类，其中以缺血性脑中风最为常见。该病发病急、病死率高，是世界上最主要的致死性疾病之一。中风的死亡率和年龄呈正相关，目前我国已进入老年化社会，其发病率及对国人的影响将有进一步增加的趋势，因此研究中风尤其是缺血性脑中风的病理机制及治疗防护一直是医药界的重点课题。

细胞膜的主要成分鞘脂类及其代谢物在膜受体介导的细胞信号传导通路中起重要作用，鞘氨醇磷酸酯(sphingosine1-phophate，s1p)是一种重要的神经鞘磷脂，调节多种细胞过程，包括细胞增殖、生存、神经元迁移和血管生成等。鞘氨醇激酶1(spk1)和鞘氨醇激酶2(spk2)均能催化鞘氨醇的磷酸化，生成s1p。最近研究发现，spk2在脑缺血和心肌缺血中产生保护作用，spk2参与了大蒜素在体和离体抗脑缺血作用，spk2也介导心肌和脑缺血预适应。总之，研究spk2蛋白对防治缺血性脑中风的作用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种tat-spk2肽及其在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种治疗缺血性脑中风的tat-spk2肽，所述tat-spk2肽的氨基酸序列为ygrkkrrqrrrggsgdgllyevlnglldrpd，如seqidno:1所示。

所述tat-spk2肽在制备治疗人类缺血性脑中风药物中的应用。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，所述tat-spk2肽又可叫做tat-鞘氨醇激酶2多肽，其中，所述tat的氨基酸序列为ygrkkrrqrrr，spk2实质上是指取自spk2蛋白210～227位的氨基酸序列sgdgllyevlnglldrpd，tat与spk2之间由2个甘氨酸连接(gg)。

发明人最近的研究发现，自噬能够介导异氟醚、缺氧和缺血预适应的神经保护作用，spk2则参与异氟醚和缺氧预适应激活自噬，过表达spk2激活自噬，对神经细胞缺血缺氧损伤具保护作用。

现有技术中已知spk2是一种含有bh3功能域的蛋白，其具有引起细胞凋亡的作用，当bh3域中的leu-219突变为ala时，其诱导凋亡的作用明显减弱。有研究证实，含bh3功能域的bad和bnip3亦可通过干扰beclin-1和bcl-2/bcl-xl之间的相互作用来介导自噬。而本发明的发明人猜测，spk2可通过其bh3功能域与bcl-2相互作用，解离beclin-1和bcl-2，激活自噬，从而产生对神经细胞缺血缺氧损伤的保护作用；但当bh3域中的leu-219突变为ala时，spk2则丧失激活自噬的作用。因此，本发明打破现有技术的偏见，特异性地选取了spk2的210～227位的bh3结构域的序列，再结合tat穿膜序列组成tat-spk2肽用以治疗人类缺血性脑中风。

为此，发明人根据spk2的bh3功能域设计并合成了tat-spk2和tat-l219a多肽：tat-spk2n端11个氨基酸由tat穿膜序列组成，中间由2个甘氨酸连接，c端18个氨基酸序列为spk2的210～227位的bh3结构域的序列。对照肽tat-l219a的氨基酸序列与tat-spk2肽基本一致，但其bh3结构域中的leu-219突变为ala。发明人建立了小鼠短暂局灶性大脑中动脉脑缺血(tmcao)模型及离体培养的ht-22海马神经细胞株和小鼠原代皮层神经元缺糖缺氧再灌注(ogd/r)模型，研究了tat-spk2肽对体内和体外脑缺血模型的保护作用。所述tat-spk2肽可根据现有的多肽合成技术通过生物技术合成公司来合成，在已知多肽的氨基酸序列的前提下，多肽的合成属于常见的现有技术。

使用方法：对于治疗人类的缺血性脑中风来说，tat-spk2肽的给药方式可以为静脉注射或静脉滴注，剂量为200μg～4mg/kg/d(指每天，每千克人体重量的给药剂量为200μg～4mg)。

本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要体现在：

1.tat-spk2肽能显著的减少缺血造成的神经元损伤，在动物实验中减少脑梗塞面积20～30％，具有显著的神经保护作用。

2.对于治疗人类的缺血性脑中风来说，所使用的tat-spk2剂量较小，推测毒性较小，相对安全。

3.由于tat-spk2诱导自噬产生抗脑缺血的神经保护作用，考虑到自噬在心肌缺血和某些神经退行性疾病中的有利作用，tat-spk2可能对心肌缺血如心肌梗塞及其它神经退行性疾病如帕金森病(parkinson’sdisease)、亨亭顿舞蹈病(huntington’sdisease)、老年性痴呆(alzheimer’sdisease)等也有治疗作用。

附图说明

附图1为小鼠tmcao模型的脑切片ttc染色对比图；

附图2为附图1的脑梗塞面积定量分析，横坐标表示给药剂量，纵坐标表示脑梗塞面积；

附图3为脑含水量测定对比图，横坐标表示给药剂量，纵坐标表示脑含水量；

附图4为ht22细胞经tat-spk2或tat-l219a肽处理1h后未进行ogd处理与进行ogd处理6h的细胞存活力对比图；

附图5为原代神经元经tat-spk2或tat-l219a肽处理3h后未进行ogd处理与进行ogd处理4h的细胞存活力对比图。

具体实施方式

下面及实施例对本发明作进一步描述：

实施例：一种治疗缺血性脑中风的tat-spk2肽及其应用

所述tat-spk2肽从n端到c端的氨基酸序列为ygrkkrrqrrrggsgdgllyevlnglldrpd。本实施例还涉及tat-spk2肽在制备治疗人类缺血性脑中风药物中的应用。对于治疗人类的缺血性脑中风来说，tat-spk2肽的给药方式可以为静脉注射或静脉滴注，剂量为200μg～4mg/kg/d(指每天，每千克人体重量的给药剂量为200μg～4mg)。

根据spk2的bh3功能域设计并合成了tat-spk2和tat-l219a多肽(中肽生化有限公司，纯度95％)：tat-spk2n端11个氨基酸由tat穿膜序列(ptd)组成，中间由2个甘氨酸连接，c端18个氨基酸序列为spk2210～227位的bh3结构域的序列。对照肽tat-l219a的氨基酸序列与tat-spk2肽基本一致，但其bh3结构域中的leu-219突变为ala。建立了小鼠短暂局灶性大脑中动脉脑缺血(tmcao)模型及离体培养的ht-22海马神经细胞株和小鼠原代皮层神经元缺糖缺氧再灌注(ogd/r)模型，研究了tat-spk2多肽对体内和体外脑缺血模型的保护作用。

spk2蛋白210－227位氨基酸序列：sgdgllyevlnglldrpd，如seqidno:2所示；

tat-spk2肽的氨基酸序列：ygrkkrrqrrrggsgdgllyevlnglldrpd，如seqidno:1所示；

tat-l219a肽的氨基酸序列：ygrkkrrqrrrggsgdgllyevanglldrpd，如seqidno:3所示；

下面分别提供动物实验、细胞实验以及毒副作用的有关情况：

一、动物实验

小鼠短暂局灶性大脑中动脉脑缺血(tmcao)模型的建立：icr小鼠，雄性，体重25～30g，清洁级。小鼠腹腔注射4％水合氯醛(400mg/kg)麻醉，背位固定，颈正中切口，分离右侧颈总、颈内、颈外动脉，颈总动脉打活结，颈外动脉近心端结扎，远心端用医用线结扎阻断血流，在颈外动脉剪一小口，将线栓(doccolcorporation)经颈外动脉插入颈内动脉，打开远心端丝线，将线栓缓缓推入1cm左右至大脑中动脉起始端，结扎固定丝线，缺血2h后，拔出线栓实现再灌，结扎缝合。

脑梗塞面积测定：小鼠缺血再灌24h后处死并完整取脑，切为5片，每片厚2mm。脑片用1％(1g溶于100ml生理盐水)的氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(ttc)染色，37℃避光染色10min，每隔3～4分钟摇晃数次，使染色均匀。正常组织呈红色，梗塞组织为白色。用immagej软件计算脑梗塞面积所占百分比。

脑含水量测定：ttc染色后，称取大脑湿重，置于烘箱烘干，称量干重，计算含水量＝(湿重-干重)/湿重100％。

在体实验设计：小鼠随机分成3组：模型组(tmcao)、tat-spk2两个剂量组2mg/kg、4mg/kg。tat-spk2各剂量组腹腔注射给药30min后行tmcao，模型组给予等容量生理盐水(ns)后30min后行tmcao。缺血2h，再灌注24h后取脑进行ttc染色，测定脑梗塞面积和脑含水量。

二、细胞实验

原代鼠皮层神经元培养：在水合氯醛麻醉下取e15-17的胎鼠，无菌条件下取脑皮层组织，迅速置于冰浴的pbs液中，仔细剔除脑膜及血管，将组织剪碎，加入2.5％胰酶37℃消化7min，加入0.5mg/ml的dna酶，37℃5min。用含10％胎牛血清的dmem终止消化，pbs洗三次，1000×g离心5min沉淀细胞，沉淀加含10％胎牛血清的dmem制成细胞悬液，通过细胞筛网。1000×g离心5min沉淀细胞，沉淀加神经元培养基nbm(含2％b27，1％双抗，2mml-glutamine)重悬，倒置显微镜下计数，将细胞悬液接种于预先用多聚赖氨酸涂布的培养板中，置37℃、5％co2条件下培养，培养8～12d用于实验。

ht-22(小鼠海马神经细胞株)细胞培养：ht-22细胞用含10％胎牛血清，100u/ml链霉素，100u/ml青霉素的dmem培养基在37℃，5％co2/95％空气下培养。

神经细胞缺糖缺氧/再灌注(ogd/r)模型：将神经细胞移去正常培养液，换入不含葡萄糖的hbss溶液(140mmnacl,3.5mmkcl,12mmmgso4,5mmnahco3,1.7mmcacl2,0.4mmkh2po4,10mmhepes)，放入专用的缺氧罐，通以95％n2～5％co2混合气体15min，以保证形成稳定的缺氧环境。之后将密封的缺氧培养气室置于37℃环境中6h(ht-22)、4h(原代神经元)后，恢复正常培养基，置37℃、5％co2条件下继续培养24h。

cck8检测细胞活力：培养在96孔板的细胞，每孔100μl细胞培养液加入10μlcck8试剂，并设置对照孔，混匀，37℃培养箱孵育2h，酶标仪450nm测吸光度。

离体实验设计：ht-22细胞实验分组：⑴正常对照组：持续通以95％o2～5％co2混合气；⑵ogd模型组；⑶tat-spk2+ogd组和⑷tat-l219a+ogd组：不同剂量的tat-spk2或tat-l219a，预处理1h，行ogd6h/再灌24h，cck8检测。

原代皮层神经元实验分组：⑴正常对照组；⑵ogd模型组；⑶tat-spk2+ogd组和⑷tat-l219a+ogd组：不同剂量的tat-spk2或tat-l219a预处理3h，行ogd4h/再灌24h，cck8检测。

数据统计与分析：数据均以mean±sd(表示平均值±标准差)表示，统计分析采用单因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05为统计学差异有显著性。

三、实验结果

1、tat-spk2对小鼠tmcao模型的保护作用：在tmcao小鼠模型，tat-spk22mg/kg和4mg/kg显著减小tmcao再灌后脑梗塞面积，梗死面积减小约20％～30％(与模型组相比p<0.001，参见图1、图2)，降低脑含水量(p<0.01，图3)。表明tat-spk2对缺血性脑中风具有一定的防治作用。

图1脑切片ttc染色。tcc染色后梗塞区显示白色。图2脑梗塞面积定量分析。图3脑含水量测定。mean±sd,*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

2、tat-spk2对神经细胞ogd/r损伤的保护作用：在ht-22细胞中，ogd/r增加神经细胞死亡率(p<0.001)，10μmtat-spk2肽相较于ogd/r组显著增加细胞存活力，而tat-l219a则缺乏这种保护作用(图4，p<0.05)；在原代神经元中，相较于ogd/r组或tat-l219a处理组，tat-spk2在0.01－0.1μm组也能够增加细胞存活力(图5，p<0.05，p<0.01或p<0.001)。表明tat-spk2对ogd/r引起的神经细胞损伤具有保护作用。

图4tat-spk2肽保护ht22细胞ogd/r损伤。ht22细胞经tat-spk2或tat-l219a肽处理1h后进行ogd处理6h，细胞存活力用cck8检测。图5tat-spk2肽保护原代神经元ogd/r损伤。原代神经元经tat-spk2或tat-l219a肽处理3h后进行ogd处理4h，细胞存活力用cck8检测。mean±sd,n＝3.*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。

四、实验结论

tat-spk2肽在小鼠tmcao模型可显著减小脑梗塞面积，减轻脑水肿，tat-spk2肽亦对抗离体培养的神经细胞缺糖缺氧损伤，提示tat-spk2肽对缺血性脑中风具有一定的防治作用。

五、tat-spk2的毒性资料

本实验所用tat-spk2肽剂量较小，为2～4mg/kg腹腔注射，初步预试显示，tat-spk2腹腔注射40mg/kg(治疗剂量的10～20倍)时，动物未出现明显不良反应。因此，可以认为tat-spk2肽治疗缺血性脑中风毒性较小，相对安全。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>苏州大学

<120>一种治疗缺血性脑中风的tat-spk2肽及其应用

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<212>prt

<213>人工序列

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