本发明属于总皂苷提取技术领域，尤其涉及一种岩生忍冬总皂苷提取方法。
背景技术：
岩生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.et Thomson.)为忍冬科忍冬属常绿藤木植物。主要分布于甘肃(临潭)、宁夏南部、四川西部、云南西北部、西藏(林芝、错那)。生于高山灌丛草甸、流石滩边缘、林缘河滩草地或山坡灌丛中，。味淡，微甘，性寒。清热解毒，疏风通络。用于温病发热，热毒血痢，痈肿疮疡，风湿热痹，关节红肿热痛。以其茎、叶、花入药，具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆等功效。皂苷是一类由糖体和苷元缩合而成的结构复杂的化合物。传统定义皂苷基于它们的表面活性，许多皂苷具有洗涤作用，其水溶液振摇能产生大量持久性肥皂样泡沫。皂苷化合物通常分子量较大，极性也大。总皂苷为结构极为相似的类似物，如糖的种类、苷元均相同，只是糖连接的位置和次序不同。近十年来从天然资源中发现的皂苷中约有310余种显示出多种生物活性，如抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、免疫调节、保肝活性等。
综上所述，皂苷化合物通常分子量较大，极性也大，难以提取。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种岩生忍冬总皂苷提取方法，旨在解决皂苷化合物通常分子量较大，极性也大，难以提取的问题。
本发明是这样实现的，一种岩生忍冬总皂苷提取方法，所述岩生忍冬总皂苷提取方法乙醇回流提取的最优条件为：80％乙醇，料液比为1:14，70℃下回流105min。
进一步，所述岩生忍冬总皂苷对维氏气单胞菌CGMCC3700株抑菌活性最高，MIC值为0.48mg/mL；对其余肠沙门氏菌肠亚种CGMCC1.10754和大肠杆菌ATCC25922等13种标准菌株的MIC值分布在7.6875mg/mL-61.5mg/mL之间。
本发明提供的岩生忍冬总皂苷提取方法，由MIC试验结果可知岩生忍冬总皂苷对本次试验中的致病菌都具有一定程度的抑制能力。其中，对总皂苷最为敏感的菌株为维氏气单胞菌CGMCC3700株，浓度为0.246g/mL的总皂苷浸膏溶液在稀释倍数为512倍时，即浓度为0.48mg/mL的时候仍对其具有抑制生长的能力。除了维氏气单胞菌CGMCC3700株，总皂苷对其余几种菌株的MIC值都在稀释倍数为4-32倍之间，即药物浓度在7.6875mg/mL-61.5mg/mL之间。
试验得出最佳提取条件中提取时间为105min，本试验设计并没有涉及到时间低于105min时的提取率。可能当温度低于105min时存在更优的条件。本试验正交设计法设计影响总皂苷提取率的实验因素时没有设置回流次数这一因素。缩短单次回流时间，增加回流次数，可能进一步增加提取率，还需要进一步的研究。现在很多人选择乙醇回流提取后样品直接通过大孔树脂纯化与富集中药成分。本试验考虑到药液浓度可能比较高，先进行萃取，除去了部分脂溶性物质和其他一些杂质，有助于提高大孔树脂吸附率。现在大部分试验选择应用于提取植物中皂苷成分的AB-8大孔树脂。
随着抗生素的应用不断增多，兽医临床中耐抗生素药物的致病菌株不断增加。传统中兽医中，忍冬历来就被用于清热解毒，民间更是有夏季直接将忍冬藤泡水饮用的习惯。从MIC试验中可看出岩生忍冬中的皂苷成分对14种标准菌株均具有一定的抑菌活性，对岩生忍冬在川西北畜禽疾病防控具有进一步研究的价值。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明通过正交试验设计考察乙醇浓度(％)、温度(℃)、时间(min)、料液比(W/V)对岩生忍冬中总皂苷的提取的影响。以总皂苷的浸膏率为评判标准，得出乙醇回流的最优条件为：80％乙醇，料液比(W/V)为1:14，70℃下回流105min。该条件下浸膏率可达9.84％。用微量稀释法检测总皂苷抑菌活性，结果表明岩生忍冬总皂苷提取物对14种病原菌均有一定程度的抑制作用。其中，对维氏气单胞菌CGMCC3700株抑菌活性最高，MIC值为0.48mg/mL。对其余13种菌株的MIC值分布在7.6875-61.5mg/mL。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1试验材料
1.1试验药材：
岩生忍冬，采自四川省阿坝州红原县，经西南民族大学兽医学药理实验室陈朝喜副教授鉴定为忍冬属岩生忍冬。取其茎叶，样品经自然风干后粉碎备用。
1.2试验菌株：
供试菌株为14种标准菌株，由西南民族大学兽医药理实验室保存并提供。
1.3仪器及试剂：
试验仪器：SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)、DLSB-10L/20低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司)、旋转蒸发仪RE-3000(上海亚荣生化仪器厂)、DHP-9162电热恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)、立式高压蒸汽灭菌器、索式提取器、DZF-6030A真空干燥箱、电子分析天平、超净工作台、分液漏斗、移液枪(200L、1000L)。
试验试剂：MH肉汤培养基、石油醚、正丁醇(分析纯)、乙醇(10％、20％、30％...90％)、浓硫酸(分析纯)、甲醇(分析纯)、去离子水。
2方法与步骤
2.1试验步骤：采药乙醇回流浸提石油醚萃取正丁醇萃取大孔树脂精制总皂苷微量肉汤稀释法测定MIC。
2.2试验方法
2.2.1正交设计法
正交设计是利用一套规格化的表格来科学合理的安排多因素多水平试验的设计方法。依据正交性从全面试验中挑选出具有代表性的点进行试验，这些代表性的点具有“均匀分散，齐整可比”的特点。这样可以节省人、财、物和时间，是一种高效、快速、便捷、经济的试验方法，也是现代提取中药成分时常用的设计方法之一。本次试验为四因素三水平试验，故选用表L9(43)设计正交试验。因素水平的设计见表1。
表1乙醇回流提取总皂苷因素水平的设计
注：A乙醇浓度(％)B温度(℃)C时间(min)D料液比(W/V)
2.2.2乙醇回流提取
乙醇回流提取是指用乙醇溶液浸提药材成分，浸提液被加热，溶剂馏出后又被冷凝回浸出器中浸提药材。这样周而复始，直至药材中的有效成分被浸提完全。温度、时间、料液比、乙醇浓度是乙醇回流的重要影响因素，故在此四个因素各设置三个水平，优选提取条件。以总皂苷的浸膏率为提取率评判标准：浸膏率(％)＝浸膏质量/岩生忍冬干重×100％。
2.2.3液液萃取
萃取是利用各种组分(包括目的产物)在两个不相混溶的液相中的溶解系数差异很大，萃取剂有较高的溶解能力，而萃余项溶解度较低。使溶质部分从萃取剂内转移到以原溶剂为主的萃余项内，从而达到分离目的。本试验先后经两步萃取，第一步是石油醚-水相萃取，取水层，弃去溶解有酯类的石油醚层，起到脱脂的作用；第二步是正丁醇-水相萃取，取溶解有皂苷的水饱和正丁醇层。
萃取后将水饱和正丁醇层减压旋蒸、烘干。以浸膏率作为评判标准，选出乙醇回流的最佳条件。再分别称取3组重5g药物做平行试验，检测提取工艺的可靠性和重复性，收集这三组平行试验的浸膏产物(共2.22g)，备用。同时在此最优条件下提取10g岩生忍冬，得浸膏(1.38g)备用。
2.2.4大孔树脂法
大孔树脂(macroporous resin)又称全多孔树脂，树脂表面有大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴，通过其巨大的比表面积产生较大的范德华引力或产生氢键，从低浓度的溶液中吸附有机物而工作。树脂孔径直接影响不同大小分子的出入，而使树脂的吸附具有一定的选择性。不同的有机化合物因其在树脂上经一定时间吸附作用后，由相应溶剂洗脱，收集的洗脱液中富集大量有机物质从而达到分离精制的目的。具有吸附容量大、速度快、稳定性高、选择性好、脱色能力强等特点，目前已应用于工业制造、废水处理、原子能工业、冶金工业。由于其种种优点，近年来大孔树脂被广泛应用于中药成分的提取分离。已有用大孔树脂对远志、知母、常春藤中总皂苷进行纯化的报道。本试验中选用NKA-9大孔树脂，取30mL去离子水溶解烘干后的浸膏，3000rpm离心15min后取上清液减压旋蒸。水溶浸膏，将溶液上大孔树脂(干重5g)柱，充分吸附反应5h，以10％乙醇浓度为梯度，自10％至90％各取80mL乙醇溶液洗脱大孔树脂吸附物质，收集40％、50％、60％、70％乙醇洗脱液，装入同一圆底烧瓶，减压旋蒸，烘干后得精制总皂苷浸膏2.46g。
2.2.5测定抗菌活性:微量肉汤稀释法
制备标准菌液：复活标准菌株。轻摇0.5号麦氏浊度标准管，无菌操作将被测定的肉汤培养物加到与标准管相同直径(大小)的无菌试管中。以无菌操作向被测定试管加入无菌蒸馏水，直到浓度与所要求的标准管的浓度相同。
制备药液：取10mL亚甲基二砜溶解精制总皂苷浸膏。在注射器上安装一次性0.22μm(尼龙66)孔径的针式过滤头在超净工作台中过滤制得药液。
配置MH肉汤培养基：参照CLSI(2013版)指导原则和执行标准，配置MH肉汤，高压灭菌。采取微量肉汤稀释法测定总皂苷提取物对14种标准菌株的体外抑制能力。
取14个96孔细胞培养板，每板的第12孔作为阴性对照。将MH肉汤按照每孔100μm加入96孔板，然后每板第一孔加入100μm药液，吹打三次。对药液进行2倍稀释，即从第一孔吸取100μm液体加入第二孔，吹打三次，照此重复直至最后一孔，第12孔为阴性对照，不用弃去100μm液体。加完药物后加稀释好的标准菌液，每一板AB、CD、EF、GH排的前1-11孔加入相同菌液100μm。第12孔不加菌液，作为空白对照。另取多西环素代替总皂苷制成的药液，做阳性对照。置恒温培养箱中37℃培养隔夜，在空白对照不长细菌的情况下观察各孔培养液中细菌生长情况，以抑制细菌生长的最高稀释浓度作为岩生忍冬总皂苷提取物的最小抑菌浓度(MIC)。
2.2.6皂苷的检验
每次在将制得的浸膏溶解之后，需对皂苷进行检验。本实验同时采取两种方法对皂苷进行定性检验：方法1：水溶液强烈震荡，产生持久性泡沫(2min不散)；方法2：硫酸：甲醇(1:1)试剂检验。喷后加热，不同皂苷元可显红褐色、紫色、黄色或黑色，所显颜色与温度无关。
3结果与分析
表2醇提总皂苷L9(43)正交试验结果
注：K表示总和，k表示平均数，R表示极差
表33组平行试验结果
注：表示平均数
表4精制总皂苷对14种病原菌的MIC试验结果
表5阳性对照药物多西环素的质控范围
正交试验结果如表2所示，R值：料液比>温度＝时间>乙醇浓度，可知这四个因素中对总皂苷得率影响最大的因素为料液比，其次是温度和时间，影响最小的因素是乙醇浓度。各因素最佳条件分别为A2、B1、C1、D1，即用80％乙醇，料液比为1:14(即取用5g药材和70mL80％乙醇溶液)时，70℃下回流105min，所得浸膏率为最高。在9个实验组中，1号组所得浸膏率最高，为14.2％。随后我们依照正交设计所得最优条件进行了三组平行试验，试验结果见表3。平均浸膏率为14.7％，高于正交试验中1号试验组，且重复率较高。得出结论A2B1C1D1试验结果较为稳定，故此组合为最优提取条件。
由MIC试验结果可知岩生忍冬总皂苷对本次试验中的致病菌都具有一定程度的抑制能力。其中，对总皂苷最为敏感的菌株为维氏气单胞菌CGMCC3700株，浓度为0.246g/mL的总皂苷浸膏溶液在稀释倍数为512倍时，即浓度为0.48mg/mL的时候仍对其具有抑制生长的能力。除了维氏气单胞菌CGMCC3700株，总皂苷对其余几种菌株的MIC值都在稀释倍数为4-32倍之间，即药物浓度在7.6875mg/mL-61.5mg/mL之间。
试验得出最佳提取条件中提取时间为105min，本试验设计并没有涉及到时间低于105min时的提取率。可能当温度低于105min时存在更优的条件。本试验正交设计法设计影响总皂苷提取率的实验因素时没有设置回流次数这一因素。缩短单次回流时间，增加回流次数，可能进一步增加提取率，还需要进一步的研究。现在很多人选择乙醇回流提取后样品直接通过大孔树脂纯化与富集中药成分。本试验考虑到药液浓度可能比较高，先进行萃取，除去了部分脂溶性物质和其他一些杂质，有助于提高大孔树脂吸附率。现在大部分试验选择应用于提取植物中皂苷成分的AB-8大孔树脂。
随着抗生素的应用不断增多，兽医临床中耐抗生素药物的致病菌株不断增加。而我国的天然植物资源无疑是一个巨大的宝藏。传统中兽医中，忍冬历来就被用于清热解毒，民间更是有夏季直接将忍冬藤泡水饮用的习惯。从MIC试验中可看出岩生忍冬中的皂苷成分对14种标准菌株均具有一定的抑菌活性，具有进一步研究的价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。