哌克昔林和奥沙利铂联合用药在治疗胃癌和结直肠癌方面的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及哌克昔林和奥沙利铂联合用药在治疗胃癌和结直肠癌方面的应用。

背景技术：

胃癌和肠癌是世界范围内常见的胃肠道肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中居首位，是全球范围内致人死亡的主要病因之一，并且临床治疗存在很大的困难。

研究表明，合适的联合用药能够发挥协同增效的作用，实现更好的治疗目的。但是，药物品种偏多，不同药物之间的相互作用也是各不相同的，配合不好甚至可能影响药物疗效或毒性增加。因此，癌症治疗方面的联合用药药物的筛选研究具有重要的意义。

哌克昔林是一种钙离子通道拮抗剂，具有抑制Ca2+内流作用，能舒张血管平滑肌，明显扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，对心绞痛效果较好，临床主要用于治疗心绞痛。同时临床上也用于室性心律失常，尤其是对其他抗心律失常药无效的患者，本品往往能奏效。进一步研究发现，哌克昔林还可以抑制细胞内脂肪酸的分解代谢及促进自噬，有研究表明，哌克昔林可以在一定程度上杀死白血病细胞。目前，未见有哌克昔林应用于胃癌和肠癌等其他疾病领域的报道。

另外，奥沙利铂是一类铂类抗癌药，目前也未见有哌克昔林和奥沙利铂联用的相关研究和报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有胃癌和肠癌治疗药物的不足以及哌克昔林应用的局限，提供一种新的抗胃癌和肠癌用药方案。

本发明的目的是提供哌克昔林和奥沙利铂联用在制备防治胃癌和/或肠癌的药物方面的应用。

本发明另一目的是提供一种包含有哌克昔林和奥沙利铂的治疗胃癌和/或肠癌的药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究显示，哌克昔林对胃癌和结直肠癌具有很好的防治效果，因此可应用于胃癌和结直肠癌的防治。而且进一步研究显示，哌克昔林和奥沙利铂联用可以实现对胃癌和/或肠癌的协同增效治疗作用，显著提高对胃癌和/或肠癌的治疗效果。

因此，哌克昔林和奥沙利铂联用在制备防治（包括预防和/或治疗）胃癌和/或肠癌的药物方面的应用，都在本发明的保护范围之内。

其中，优选地，所述肠癌为结直肠癌。

优选地，所述胃癌为Ι到Ⅳ期胃癌。

更优选地，所述胃癌为Ⅳ期胃癌。

更优选地，所述结直肠癌为Ι到Ⅳ期结直肠癌。

更优选地，所述结直肠癌为Ⅳ期结直肠癌。

另外，所述治疗胃癌和/或肠癌的药物是指抑制胃癌细胞和/或肠癌细胞的生长、增殖和/或克隆形成能力，抑制胃癌细胞和/或肠癌细胞的侵袭和/或转移，和/或诱导胃癌细胞和/或肠癌细胞的凋亡的药物。

优选地，所述胃癌细胞为人胃癌细胞HGC27或MGC803；所述肠癌细胞为人结肠癌细胞HCT 116或人结肠腺癌细胞DLD-1。

一种包含有哌克昔林或其盐、以及奥沙利铂的防治胃癌和/或肠癌的药物，也在本发明的保护范围之内。

进一步地，所述药物还可以包括其药学上可接受的载体等。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了哌克昔林及其盐对胃癌和结直肠癌的治疗作用，能够显著抑制胃癌和结直肠癌细胞的生长和增殖，诱导胃癌和结直肠癌细胞的凋亡，并抑制其转移，对结胃癌和直肠癌具有显著的疗效，可应用于胃癌和结直肠癌的防治方面。同时，首次研究证明了哌克昔林和奥沙利铂联合用药对胃癌和结直肠癌具有更显著的治疗效果，实现了协同增效的作用。

本发明提供了哌克昔林和奥沙利铂联合用药治疗胃癌和结直肠癌的新方案，不仅为胃癌和结直肠癌的治疗提供了一种新的治疗药物和治疗途径，还为哌克昔林的应用提供了新的领域。

附图说明

图1为哌克昔林处理胃癌和结直肠癌细胞后存活细胞比例。

图2为哌克昔林对胃癌和结直肠癌细胞成瘤的影响。

图3为哌克昔林对胃癌和结直肠癌细胞增殖影响。

图4为哌克昔林对胃癌和结直肠癌细胞转移的影响。

图5为哌克昔林对胃癌和结直肠癌细胞侵袭的影响。

图6为哌克昔林单用或联合奥沙利铂处理胃癌和结直肠癌细胞后存活细胞比例。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 哌克昔林对胃癌和结直肠癌细胞及其成瘤的影响

1、实验材料

（1）药物：哌克昔林在临床上常用其马来酸盐，本实施例以马来酸哌克昔林为实验药物。

马来酸哌克昔林的化学结构式如下所示：

（2）癌细胞：

胃癌细胞：人胃癌细胞HGC27和MGC803；

结直肠癌细胞：人结肠癌细胞HCT 116和人结肠腺癌细胞DLD-1。

（3）市购的细胞凋亡试剂盒。

2、实验分组

（1）对照组：空白对照，即癌细胞不经过任何药物处理。

（2）实验组：使用马来酸哌克昔林处理癌细胞。

3、流式细胞术检测马来酸哌克昔林对胃癌和结直肠癌细胞凋亡的影响

（1）我们在十二孔板中铺好结直肠癌细胞，待其贴壁后，加入0μM（即对照）、3μM、4μM（或5μM）的马来酸哌克昔林处理细胞24h，然后通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。

具体方法如下：

1）将对数生长期的HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞用胰酶消化后，取1~2×10⁵细胞均匀铺到十二孔板中。

2）待细胞贴壁后，更换成含有不同浓度马来酸哌克昔林的培养基，孵育24h。

3）消化细胞之后，根据凋亡检测试剂盒的方法处理细胞，Annexin V和PI染色完成之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

（2）实验结果

结果如图1所示，图1中显示的百分比为Annexin V和PI双阴性（即存活细胞）比例，使用马来酸哌克昔林处理后，胃癌和结直肠癌细胞的死亡数明显增加，表明哌克昔林能够诱导胃癌和结直肠癌细胞凋亡。

4、马来酸哌克昔林对成瘤的影响

（1）在六孔板中铺好胃癌和结直肠癌细胞，待其贴壁后，加入0μM 、1μM 和2μM 马来酸哌克昔林处理胃癌和肠癌细胞，观察马来酸哌克昔林对HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞克隆形成的影响。

具体方法如下：

1）取对数生长期的HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞，用胰酶将细胞消化，取每孔500个细胞均匀铺到六孔板中。

2）待细胞贴壁后，更换含有不同浓度马来酸哌克昔林的培养基，继续37℃培养箱中孵育细胞。

3）孔板中的出现肉眼可见的克隆时，终止培养，吸去培养基，用PBS小心清洗。

4）甲醇固定后用结晶紫染色，在空气中风干。

5）倒置显微镜中拍照。

（2）实验结果

结果如图2所示，胃癌和结直肠癌细胞经过马来酸哌克昔林处理后，克隆形成数目明显下降，表明哌克昔林可以显著抑制胃癌和结直肠癌细胞成瘤。

实施例2 哌克昔林对胃癌和结直肠癌细胞增殖的影响

1、实验材料

（1）药物：同实施例1。

（2）癌细胞：同实施例1。

（3）市购的MTS试剂盒。

2、通过MTT方法检测马来酸哌克昔林处理后HGC27和MGC803细胞，以及HCT 116和DLD-1细胞活性

（1）在96孔板中铺好胃癌和结直肠癌细胞，待其贴壁后，加入含有0μM 、5μM、10μM、20μM马来酸哌克昔林的培养基处理细胞，然后在24h、48h、72h通过MTT方法检测HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞活性。

具体方法如下：

1）将对数生长期的HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞用胰酶消化后，取4×10³细胞均匀铺到96孔板中。

2）待细胞贴壁后，更换含有不同浓度马来酸哌克昔林的培养基。

3）加入药物24h、48h、72h后，按1:10比例加入MTS试剂，37℃孵育2h后，用酶标仪检测490nm吸光值。

（2）实验结果

结果如图3所示，胃癌和结直肠癌细胞经过马来酸哌克昔林处理后，细胞活性明显下降，表明哌克昔林可以显著抑制胃癌和结直肠癌细胞增殖。

实施例3 哌克昔林对胃癌和结直肠癌细胞转移的影响

1、实验材料

（1）药物：同实施例1。

（2）胃癌细胞：同实施例1。

（3）有预包被基质胶和无预包被基质胶的Transwell小室。

2、通过Transwell小室检测马来酸哌克昔林处理后，对HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞侵袭和迁移的影响

（1）在六孔板中铺好胃癌和结直肠癌细胞，待其贴壁后，加入0μM 、3μM 和4μM （或5μM）马来酸哌克昔林处理胃癌细胞48h，加入0μM、4μM和6μM马来酸哌克昔林处理肠癌细胞48h，再通过Transwell小室检测马来酸哌克昔林处理后HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞侵袭和迁移的影响。

具体方法如下：

1）将对数生长期的HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞用胰酶消化后，取6×10⁵细胞均匀铺到六孔板中。

2）待细胞贴壁后，更换含有不同浓度马来酸哌克昔林的培养基。

3）加入药物处理后，胰酶消化细胞，PBS清洗后，用无血清培养基重悬计数。

4）取200μl细胞悬液，分别含有细胞数为1×10⁵加到无预包被基质胶和有包被基质胶的Transwell上室，在下室中加入600μl含100%血清的培养基。

5）37℃培养箱中培养细胞48h，取出小室，甲醇固定后用结晶紫染色，用棉签去除上室中残余细胞后，在空气中风干。

6）倒置显微镜中拍照。

（2）实验结果

结果如图4和图5所示，胃癌和结直肠癌细胞经过马来酸哌克昔林处理后，迁移和侵袭到下室中的细胞数目明显下降，表明哌克昔林可以显著地抑制胃癌和结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，且该抑制效果呈浓度依赖性。

实施例4 马来酸哌克昔林和奥沙利铂联合用药

1、实验材料

（1）药物：马来酸哌克昔林、奥沙利铂。

（2）胃癌细胞：人胃癌细胞HGC27和MGC803；结直肠癌细胞：人结肠癌细胞HCT 116和人结肠腺癌细胞DLD-1。

（3）市购的细胞凋亡试剂盒。

2、实验分组

（1）对照组：空白对照，即胃癌和结直肠癌细胞不经过任何药物处理。

（2）单独用药组1：使用马来酸哌克昔林处理胃癌和结直肠癌细胞。

（3）单独用药组2：使用奥沙利铂处理胃癌和结直肠癌细胞。

（4）联合用药组：先后使用奥沙利铂和马来酸哌克昔林处理胃癌和结直肠癌细胞。

3、流式细胞术检测马来酸哌克昔林、奥沙利铂和两者联用对胃癌和结直肠癌细胞凋亡的影响

（1）在十二孔板中铺好胃癌和结直肠癌细胞，待其贴壁后，加入0μM（即对照）和20μM（胃癌）、40μM（肠癌）的奥沙利铂，24h后再加入4μM的马来酸哌克昔林，两者联用处理细胞24h，然后通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。

具体方法如下：

1）将对数生长期的HGC27和MGC803细胞、HCT 116和DLD-1细胞用胰酶消化后，取1~2×10⁵细胞均匀铺到十二孔板中。

2）待细胞贴壁后，更换成含有0μM和20μM奥沙利铂的培养基孵育胃癌细胞；更换含有0μM和40μM奥沙利铂的培养基孵育肠癌细胞。孵育24h后再加入含4μM马来酸哌克昔林的培养基共同孵育24h。

3）消化细胞之后，根据凋亡检测试剂盒的方法处理细胞，Annexin V和PI染色完成之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

（2）实验结果

结果如图6所示，图6中显示的百分比为Annexin V和PI双阴性（即存活细胞）比例，哌克昔林或奥沙利铂均可以杀伤一定比例的胃癌和结直肠癌细胞，而两者联合用药组的存活细胞比例显著减少。

结果表明，在奥沙利铂使用基础上加用哌克昔林，相对于单独用药组能更显著地诱导胃癌和结直肠癌细胞的凋亡，显示了哌克昔林与奥沙利铂协同联合使用显著提高了胃癌和结直肠癌的治疗效果，实现了协同增效的治疗作用。