一种基于低温快速成型的组织工程支架及制备方法与流程

本发明涉及生物材料与组织工程技术领域，尤其涉及一种基于低温快速成型的组织工程支架及制备方法。

背景技术：

传统的组织工程支架制备技术包含有:纤维粘接技术、溶液浅铸/颗粒滤出技术、气体发泡技术、相分离技术、乳液冷冻干燥技术等。但是这些传统技术都有共同的缺点：孔径不一致，孔隙的形状不规则，孔隙间的连通性不足，可重复性差。相比之下，作为快速成型技术的一种，3D打印技术制备的组织工程支架具有独特优势：支架个性化、孔径尺寸可调节、孔隙率可控、孔隙联通性好，并可设计孔的形状，以及构建复杂空间结构。此外，3D打印技术具有优良的可重复性和生产效率，尤其可根据需求模拟天然组织的结构。

熔融沉积成型(Fused Deposition Modeling，FDM)是目前制作组织工程支架较常用的方法。FDM是将低熔点丝状材料通过加热器的挤压头熔化成液体，使熔化的热塑材料丝通过喷头挤出，挤压头沿零件的每一截面的轮廓准确运动，挤出半流动的热塑材料沉积固化成精确的实际部件薄层，覆盖于已建造的零件之上，并在1/10s内迅速凝固，每完成一层成型，工作台便下降一层高度，喷头再进行下一层截面的扫描喷丝，如此反复逐层沉积，直到最后一层，这样逐层由底到顶地堆积成一个实体模型或零件。采用该技术构建组织工程支架首先要解决材料问题，因材料加工时要经过熔融挤压程序且材料必须为丝状，熔融沉积制造工艺几乎不能使用天然的聚合物，也不适于部分粘度大的合成物。同时，材料在堆积凝固过程中会阻碍微孔的形成，而微孔是促进细胞吸附的重要因素之一。

目前熔融沉积成型技术通常采用聚己内酯(polycaprolactone，PCL)作为原料来制备组织工程支架。PCL是一种常用的具有生物相容性和生物可降解性的高分子材料，其可塑性强且生物力学强度高，但是因为不易于降解，因此不适合用于组织工程骨或者软骨的构建。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(glycolic acid，PLGA)因其具有良好的生物可降解性、生物相容性等，己被美国食品药品管理局FDA广泛的应用于生物医学领域。但是，现有技术中通常采用电纺丝技术制备PLGA三维支架，而熔融沉积打印PLGA支架的成功率很低。这是由于纯PLGA材料在高温熔融(例如150～220℃)后粘度较大，容易堵塞打印喷嘴，且PLGA的结晶度低，打印出的纤维不易成型，容易发生塌陷和向两侧弥散，使临近纤维之间产生粘连导致孔径闭合，例如孔径通常小于100μm。如果为了避免粘连而减小纤维直径，则打印出的纤维强度不够，不能成行。如果增大纤维直径，例如300～600μm，也不能有效避免粘连现象，还容易因为塌陷而出现极小的孔径。为了避免上述情况，只能在设计时考虑增加纤维间距，因此熔融沉积成型采用高温打印出的PLGA支架的孔径通常大于500μm。即使能够用尽可能细的纤维，打印出尽可能合理的孔径300μm，但是其重复性很低，而且材料的脆性大，生物力学强度低，无法满足软骨支架的修复要求。

综上所述，现有技术中熔融沉积成型在高温下打印的纯PLGA支架存在孔径尺寸过大(>500μm)或者过小(<100μm)的缺陷，不易于准确控制3D打印PLGA支架的微观结构，且缺少内部微孔，不适于细胞在支架上的吸附和增殖。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，针对现有熔融沉积成型的纯PLGA支架孔径过大或过小且形态不规则的缺陷，提供一种复合赋形剂的基于低温快速成型的组织工程支架及制备方法。

本发明第一方面，提供了一种基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，配置PLGA溶液；

(2)在所述PLGA溶液中加入氯化钠颗粒得到打印浆料，其中氯化钠颗粒与PLGA的质量比为1:2～2:1；

(3)将所述打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在20～30℃温度及100～300kPa的气压下准备打印；

(4)将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，以3～6mm/s的速度打印出含有氯化钠颗粒的支架本体；

(5)去除含有氯化钠颗粒的支架本体中的有机溶剂；

(6)将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡，待氯化钠溶出后干燥得到所述基于低温快速成型的组织工程支架。

在根据本发明所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，所述制备方法还包括在步骤(6)之后执行的以下步骤(7)：

将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶溶液中，制备水凝胶细胞混合悬液，将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述组织工程支架上，直至水凝胶细胞混合悬液渗透入所述组织工程支架的孔隙结构中并覆盖组织工程支架表面。

在根据本发明所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，所述水凝胶为聚氨基类水凝胶；所述步骤(7)进一步包括：

将聚氨基类水凝胶与磷酸缓冲盐溶液在4～6℃充分搅拌溶解后形成水凝胶溶液，其中聚氨基类水凝胶的质量分数为4％～12％；

将水凝胶溶液与骨髓间充质干细胞悬液在18～22℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为5×10⁵～2×10⁶/ml；

将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述组织工程支架上，置于离心管中，在4℃以180～220rpm/min离心10～20分钟；取出离心后的组织工程支架置于37℃环境下保存。

在根据本发明所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，所述聚氨基类水凝胶为通过以下方法制备的RGD-PEG-PELG-KGN：

以aPEG-NH₂为大分子引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物aPEG-PELG₁₃；

在aPEG-PELG₁₃的两端分别连接RGD肽以及小分子化合物KGN构成RGD-PEG-PELG-KGN。

在根据本发明所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，制备聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的步骤具体为：

将aPEG-NH₂与甲苯混合后在120～140℃下共沸除水，抽干甲苯后，按照1:1.2～1:1.8的质量比加入γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐，并溶解于干燥的DMF中在22～26℃且氮气保护条件下反应72～120h，然后用冰乙醚沉降2～4次，并在室温条件下真空干燥后得到aPEG-PELG₁₃。

在根据本发明所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，制备RGD-PEG-PELG-KGN的步骤具体为：

将aPEG-PELG₁₃溶于DMF中配制浓度为0.1～0.15g/ml的聚氨基酸DMF溶液；再将KGN溶于DMF中配制浓度为0.03～0.04g/ml的KGN溶液，用EDC/NHS活化后在冰水浴中缓慢滴加到聚氨基酸DMF溶液中，其中aPEG-PELG₁₃和KGN的用量比为(4.3～5)：1，搅拌反应2～4h，用截留量为3000的透析袋在水中透析2～4天后冻干得到aPEG-PELG-KGN待用；

将aPEG-PELG-KGN、CRGD和偶氮二异丁腈以(79～82)：(58～62)：(3～4)的质量比溶于DMF溶液中，放入安全瓶中在液氮条件下冻实后用高压油泵抽15～25min，充入氮气保护，融化后再抽15～25min，重复3次以除去其中的氧气，氮气保护加热到65℃搅拌反应3天，用乙醚沉降，抽干后用截留量为3000的透析袋透析2～4天后冻干得到RGD-PEG-PELG-KGN。

在根据本发明所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，优选地，所述aPEG-PELG₁₃和KGN的用量比为(4.54～4.55)：1。

在根据本发明所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，优选地，aPEG-PELG-KGN、CRGD和偶氮二异丁腈的用量比为80:60:3。

在根据本发明所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，所述水凝胶为胶原或壳聚糖。

本发明第二方面，还提供了一种基于低温快速成型的组织工程支架，采用如前任一项所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法制得。

本发明的上述技术方案具有如下优点：

1、本发明通过添加赋形剂实现了PLGA材料的低温打印，克服了高温熔融打印PLGA支架造成的孔径尺寸过大(>500μm)或者过小(<100μm)的缺陷，制得的PLGA支架的孔径为300～350μm左右，是最佳组织工程软骨支架，易于存留细胞，同时具有更好的表面活性，能促进细胞增殖，同时兼备良好的生物力学性能。

2、本发明还对低温打印PLGA支架的工艺进行了大量研究，得出PLGA与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，并且PLGA与氯化钠颗粒按照1:2～2:1的质量比配制时，可以成功地打印出形态完整的三维支架，并且通过将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，可以得到最佳的力学性能及降解速度。

3、本发明通过将水凝胶与快速成型制备的具有孔隙结构的医用高分子支架复合，制得的基于低温快速成型的组织工程支架既具有医用高分子材料良好的机械强度，又能通过水凝胶保持高的水分含量，在支架内部及表面为骨髓间充质干细胞的物质交换以及向软骨细胞分化提供良好的微环境。

4、本发明的水凝胶优选采用温度敏感性水凝胶材料，可在液态下与支架复合，并在37℃环境下转变成凝胶状，进而在医用高分子材料制成的三维立体的支架本体内形成水分含量较高的三维交联多孔网状结构，为骨髓间充质干细胞的生长提供环境。

5、本发明的水凝胶优选为聚氨基酸水凝胶RGD-PEG-PELG-KGN，通过在aPEG-PELG₁₃的两端连接具有细胞粘附作用的RGD以及具有成软骨作用的小分子化合物KGN，构建具有成软骨和促进细胞增殖作用的成软骨水凝胶体系。

附图说明

图1为根据本发明第一实施例的基于低温快速成型的组织工程支架的结构示意图；

图2为根据本发明第二实施例的基于低温快速成型的组织工程支架的结构示意图；

图3a和3b分别为PLGA对照组和实验组PN11的实物照片；

图4a-4h为根据本发明的激光共聚焦显示结果图；

图5为PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组PN12的抗压强度测试结果图；

图6为PLGA对照组、实验组PN11、实验组PN21和实验组PN12的支架的CCK8检测结果图；

图7a和7b分别为聚氨基酸水凝胶合成的中间产物及最终产物的核磁谱图；

图8是四种聚氨基酸所形成的水凝胶的相位转变图；

图9是四种聚氨基酸所形成的水凝胶的流变图；

图10是aPEG-PELG₁₃和RGD-PEG-PELG-KGN两种聚氨基酸的体外降解实验结果图；

图11是RGD-PEG-PELG-KGN所形成的水凝胶在体外KGN的释放曲线；

图12为根据本发明的PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN21在接种骨髓间充质干细胞后的CCK8检测结果图；

图13a-13b为根据本发明的PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN21的糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原蛋白的检测结果；

图14a-14d分别为根据本发明的PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN21的RT-PCR结果显示的软骨相关基因表达结果图；

图15为根据本发明的PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN21的抗压强度测试结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明经过大量研究和摸索，提供了一种全新的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架的低温打印方法，在PLGA材料中添加赋形剂氯化钠(NaCl)颗粒以降低PLGA粘度，增强PLGA在3D打印过程的可塑性。

因此，本发明第一实施例提供的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将PLGA溶于有机溶剂中得到PLGA溶液，其中PLGA与有机溶剂的质量比为1:6～1:8(例如1:6、1:7或1:8)。优选地，PLGA的重均分子量(Mw)为80000～200000gmol^-1(例如80000、100000、120000、150000或200000gmol^-1)，更优选为100000gmol^-1)。本发明的低温打印方法尤其适用于重均分子量(Mw)为80000～100000gmol^-1的PLGA材料，可以避免高温加热造成的材料性质改变。该步骤中采用的有机溶剂优选但不限于：氯仿、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

(2)在所述PLGA溶液中加入NaCl颗粒得到打印浆料，其中NaCl颗粒与PLGA的质量比为1:2～2:1(例如1:2、1:1或2:1)，更优选为1:1～1:2。NaCl颗粒的粒径为35～40μm，优选采用400目筛网过滤得到的直径为37μm左右的NaCl颗粒。

(3)将所述打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在室温如20～30℃(例如20、22、25、28或30℃)以及100～300kPa(例如100、150、200、250或300kPa)的气压下准备打印。

(4)将纤维直径设置为200～300μm(例如200、210、230、250、280或300μm)，纤维间距设置为300～350μm(例如300、310、320、330、340或350μm)，以3～6mm/s(例如3、4、5或6mm/s)的速度打印出含有NaCl颗粒的支架本体。

(5)去除含有NaCl颗粒的支架本体中的有机溶剂；优选地，可将打印出的支架本体在37℃烘箱干燥24～48h(例如24、28、30、36、40或48h)。

(6)将含有NaCl颗粒的支架本体置入水中浸泡，待NaCl溶出后干燥得到所述基于低温快速成型的组织工程支架。优选地，可将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡10～48h(例如10、15、20、30、40或48h)。

请参阅图1，为根据本发明第一实施例的基于低温快速成型的组织工程支架的结构示意图。如图1所示，上述第一实施例的方法制得的基于低温快速成型的组织工程支架由具有孔隙结构的支架本体1构成。该支架本体1包括由熔融沉积得到的多层PLGA纤维构成，相邻层的PLGA的纤维方向互成90°，且每层PLGA纤维的纤维直径为200～300μm(例如200、210、220、250、280或300μm)，纤维间距为300～350μm(例如300、310、320、330、340或350μm)。当添加赋形剂后，制得的支架本体1的孔隙结构既包括熔融沉积成型构成的三个维度上连通的一级孔隙结构，又包括纤维内部由赋形剂构成的孔径为35～40μm的二级微孔结构(图中未示出)。因此，本发明通过添加赋形剂解决了高温打印PLGA支架孔径过大或过小且形态不规则的缺陷，并且通过溶出NaCl得到微孔结构，有利于细胞的吸附和生长。本发明制得的组织工程支架还可以通过软件精确地控制内部连通孔的孔隙率和孔结构，且支架制备工艺的重复性好，从而可以获得个性化的具有特定生物力学和形貌特性的组织工程支架。

本发明还在熔融沉积成型制成的支架本体上复合水凝胶以进一步提高支架性能。本发明第二实施例提供的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，与第一实施例基本相同，区别在于还包括以下步骤：

(7)将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶溶液中，制备水凝胶细胞混合悬液，将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述组织工程支架上，直至水凝胶细胞混合悬液渗透入所述组织工程支架的孔隙结构中并覆盖组织工程支架表面。该水凝胶可以为胶原、壳聚糖或聚氨基类水凝胶，更优选为聚氨基类水凝胶。

聚氨基酸作为药物医学领域的一个重要材料，可降解且降解产物无毒副作用，是理想的生物医用水凝胶材料。聚氨基酸类水凝胶具有良好的生物相容性，聚赖氨酸已被较深入的研究，现可用于手术缝合线的材料和药物控制释放体系。氨基酸的降解在体内主要是由于各种酶的存在而引发的，通过调节聚氨基酸中各种氨基酸的比例就可以控制聚氨基酸在体内的降解速度。当采用聚氨基类水凝胶时，上述步骤(7)进一步包括：

(a)将聚氨基类水凝胶与磷酸缓冲盐溶液在4～6℃充分搅拌溶解后形成水凝胶溶液，其中聚氨基类水凝胶的质量分数为4％～12％(例如4％、6％、8％、10％或12％)，更优选为8％。

(b)将水凝胶溶液与骨髓间充质干细胞悬液在18～22℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为5×10⁵-2×10⁶/ml。由于聚氨基类水凝胶为温度敏感性水凝胶，所以制得的水凝胶溶液在18～22℃时为液态，可与骨髓间充质干细胞悬液混合得到水凝胶细胞混合悬液。

(c)将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于组织工程支架上，即前述支架本体1上，置于离心管中，在4℃以180～220rpm/min(例如180、190、200、210或220rpm/min)离心10～20分钟；取出离心后的组织工程支架置于37℃环境下保存，得到最终的组织工程支架。该步骤中可以将水凝胶细胞混合悬液200μl滴加于支架本体1上，置于EP管中，在4℃下离心，直至水凝胶细胞混合悬液充分渗透入到支架本体的孔隙结构中并覆盖支架本体表面。之后置于37℃环境下，水凝胶转变成凝胶状，进而在医用高分子材料制成的三维立体的支架本体内形成水分含量较高的三维交联多孔网状结构，为骨髓间充质干细胞的生长提供环境。

本发明中的聚氨基类水凝胶可以采用全新合成的RGD-PEG-PELG-KGN，并提供了以下制备方法：

(1)以端氨基的烯丙氧基聚乙二醇(aPEG-NH₂)为大分子引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物(aPEG-PELG₁₃)。具体为：将aPEG-NH₂与甲苯混合后在120～140℃(例如120、130或140℃，优选为130℃)下共沸除水，抽干甲苯后，按照1:1.2～1:1.8(例如1:1.2、1:1.5或1:1.8，优选为1:1.5)的质量比加入γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐(NCA)，并溶解于干燥的DMF中在22～26℃(例如25℃)且氮气保护条件下反应72～120h，然后用冰乙醚沉降2～4次(例如2、3或4次，优选3次)，并在室温条件下真空干燥后得到aPEG-PELG₁₃。经检测，产物的产率为65％～75％。

优选地，该步骤中端氨基烯丙基聚乙二醇aPEG-NH₂可通过以下方法合成：

将分子量为2000的aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾混合，加入二氯甲烷后在室温下搅拌反应，然后用饱和食盐水洗涤，将下层有机相依次进行干燥、过滤、沉降、抽滤，得白色粉末固体。aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾的用量比最优选为20:9.5:1.68。

将白色粉末固体、氯化铵和氨水溶解，室温下搅拌反应5天，将反应物依次进行萃取、饱和食盐水洗涤、干燥、沉降，得到aPEG-NH₂。为了确保反应能顺利进行，所述白色粉末固体的用量优选为15～20g，氯化铵的用量优选为15～20g，氨水的用量优选为800～1000mL。

萃取和沉降影响着产物的收率，在一些实施例中，萃取所用的溶剂为二氯甲烷，沉降所用的溶剂为乙醚和二氯甲烷组成的混合溶剂，并且沉降三次。按照上述方法进行萃取和沉降确保产物的收率达到了85％以上。

(2)在aPEG-PELG₁₃的两端分别连接RGD肽(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)，以及小分子化合物KGN(Kartogenin)构成RGD-PEG-PELG-KGN。其中RGD肽具有细胞粘附作用，小分子化合物KGN具有成软骨作用，使得最终制成的聚氨基类水凝胶RGD-PEG-PELG-KGN同时具有成软骨和促进细胞增殖作用，适用于软骨修复。该步骤具体包括：

a、将aPEG-PELG₁₃溶于DMF中配制浓度为0.01～0.015g/ml(例如0.1、0.12或0.15g/ml)的聚氨基酸DMF溶液；再将KGN溶于DMF中配制浓度为0.03～0.04g/ml的KGN溶液，用EDC/NHS活化后在冰水浴中缓慢滴加到聚氨基酸DMF溶液中，搅拌反应2～4h，用截留量为3000的透析袋在水中透析2～4天(优选3天)后冻干得到aPEG-PELG-KGN待用；为了确保反应能够顺利进行，成功将KGN连接到聚氨基酸一端，本发明还对各组分的用量进行了研究。经过大量研究发现，所述aPEG-PELG₁₃和所述KGN适宜的用量比为(4.3～5)：1，优选为(4.54～4.55)：1。更优选地，该步骤中aPEG-PELG₁₃和KGN的用量比为(4.54～4.55)：1。在EDC/NHS活化中，EDC和NHS的用量比为(1.6～1.7)：1.2。

b、将aPEG-PELG-KGN、CRGD和偶氮二异丁腈(AIBN)以(79～82)：(58～62)：(3～4)的质量比溶于DMF溶液中，放入安全瓶中在液氮条件下冻实后用高压油泵抽15～25min，充入氮气保护，融化后再抽15～25min，重复3次以除去其中的氧气，氮气保护加热到65℃搅拌反应3天，用乙醚沉降，抽干后用截留量为3000的透析袋透析2～4天(优选3天)后冻干得到RGD-PEG-PELG-KGN。CRGD是一个基于二硫键循环的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子环形肽。CRGD和偶氮二异丁腈在DMF溶液中与aPEG-PELG-KGN的烯丙基发生反应，在修饰有KGN的聚氨基酸上又成功修饰上了RGD，得到了连接有两种功能分子的聚氨基酸：RGD-PEG-PELG-KGN。为了保证反应能够顺利进行，本发明还对各组分的用量进行了研究。通过大量研究发现，所述aPEG-PELG-KGN、CRGD、偶氮二异丁腈的用量比为(79～82)：(58～62)：(3～4)，最优选的用量比为80:60:3。

采用上述制备方法制得的功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN的结构为：

本发明以聚谷氨酸乙酯为基质的温度敏感型水凝胶，通过试管倒置法和流变学表征了其凝胶转变温度和流变学行为。其临界凝胶浓度为10wt％，因为其快速的体内成胶能力，具有良好的生物可降解性和生物相容性。

请参阅图2，为根据本发明第二实施例的基于低温快速成型的组织工程支架的结构示意图。如图2所示，该第二实施例制得的基于低温快速成型的组织工程支架包括：具有孔隙结构的支架本体1，以及复合在支架本体1的孔隙结构中以及支架本体1表面的水凝胶2，该水凝胶2中混合有骨髓间充质干细胞3。实验证明，本发明采用上述纤维直径和纤维间距参数制备的PLGA复合水凝胶支架，可以获得更好的力学性能。并且本发明采用的纤维间距较一般熔融沉积成型制备的支架纤维间距大，从而有利于水凝胶的进入。

本发明将水凝胶2与低温快速成型制成的支架本体1复合，一方面具有医用高分子材料良好的机械强度，另一方面由于水凝胶是水分含量较高的三维交联多孔网状结构，接种后骨髓间充质干细胞3呈圆形局限于陷窝内，可以为干细胞的物质交换以及向软骨细胞分化提供良好的微环境。

需要特别指出的是，本说明书的数值范围表示该数值范围的上限值、下限值以及处在该数值范围之内的任何数值或者子范围。因此，如果没有特别说明，在本说明书中涉及数值范围时就不再详细列举包含在该数值范围内的具体数值。

实施例1

1、将重均分子量(Mw)为100000gmol^-1的PLGA与氯仿按照1:7的质量比混合得到PLGA溶液。

2、在所述PLGA溶液中加入NaCl颗粒得到打印浆料，其中PLGA与NaCl颗粒的质量比为1:1，NaCl颗粒为经过400目筛网过滤得到的NaCl颗粒。

3、将打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在室温如24℃以及200kPa的气压下准备打印。

4、将纤维直径设置为300μm，纤维间距设置为300μm，以4mm/s的速度打印出含有NaCl颗粒的圆柱形的支架本体。该圆柱形的直径为9mm，厚度为2mm。

5、将支架本体在37℃烘箱干燥48h。

6、将烘干后的支架本体置入水中浸泡48h，待NaCl溶出后干燥得到支架本体。

实施例2至10

除了下表格1的内容之外，实施例2至10以与实施例1基本相同的方式进行。

实施例11

除包括实施例1的步骤1-6外，还包括在支架本体上复合水凝胶的步骤：

(1)制备聚氨基类水凝胶RGD-PEG-PELG-KGN：

制备引发剂aPEG-NH₂:从海安石油购买的双键PEG(aPEG)，M＝2000，20g；加入对甲苯磺酰氯(M＝190，9.5g)和KOH(M＝56.1，1.68g)固体，摩尔比为1:5:3加入到500mL圆底烧瓶中，加入250mL二氯甲烷，室温搅拌反应五天，用饱和食盐水洗涤三到五次，将下层有机相放入锥形瓶中干燥过夜，然后用G4漏斗过滤，用乙醚/二氯甲烷沉降三次，用真空油泵抽干12h，得白色粉末固体18.7g。取15g制得的白色固体样品加入1L圆底烧瓶中，加入15g氯化铵，用800mL氨水溶解，室温条件下搅拌反应5d，用二氯甲烷萃取，将萃取液用饱和食盐水洗涤3次，干燥过夜，用乙醚/二氯甲烷沉降三次，制备氨基PEG，aPEG-NH₂。

制备单体谷氨酸乙酯NCA(ELG-NCA)：称取L-谷氨酸20g，量取乙醇30mL，在冰浴条件下充分混合，缓慢逐滴滴加8mL浓硫酸。室温下搅拌过夜，直至悬浮液变澄清。冰浴下用乙醇42mL和三乙胺42mL的混合溶液中和反应液，冷却至室温，离心(11000rmp，5min)得到白色固体。用水和乙醇重结晶得到白色晶体γ-乙基-L-谷氨酸酯。产率61％。

在缓慢通入氮气保护气的条件下，在250mL三口瓶中加入100mL干燥的四氢呋喃，调节气流量，稳定缓慢鼓泡。然后加入3.22g的γ-乙基-L-谷氨酸酯和1.98g的三光气，放于55-60℃的油浴中搅拌反应，等体系变得澄清后，室温下继续氮气鼓泡3min，然后倒入600mL正己烷中沉降，并置于-20℃使沉淀完全。弃上清液，收集底层无色粘稠液体，用100mL乙酸乙酯溶解，再用50mL冰的氯化钠水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，用G4漏斗滤去无水硫酸镁，滤液转移到反应瓶中，在真空条件下抽干乙酸乙酯，得到白色晶体γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐，产率为66％。

制备聚合物aPEG-PELG₁₃:取10g aPEG-NH₂放入安瓶中甲苯共沸除水的方法除去样品总残存的水分，抽干后放入15.075gNCA,以150mL DMF为溶剂，氮气保护条件下在25℃反应5天，用乙醚/二氯甲烷沉降两次，制得聚合物aPEG-PELG₁₃。并在室温条件下真空干燥24小时，得到最终产物mPEG-PELG₁₃，产率为65％。

制备aPEG-PELG-KGN：将KGN通过酯化反应连接到聚氨基酸材料aPEG-PELG₁₃的末端氨基上，具体做法：取2.5g aPEG-PELG₁₃溶于25mL DMF中，将0.55g KGN溶于15mL DMF中，用EDC/NHS(1.66g/1.20g)活化40min,在冰水浴中缓慢滴加到聚氨基酸DMF溶液中，搅拌反应3d，用截留量为3000的透析袋在水中透析三天，每6小时换一次水。冻干待用。

制备RGD-PEG-PELG-KGN：取2.0g aPEG-PELG-KGN和1.5g CRGD，75mg AIBN溶于DMF溶液中，放入安全瓶中在液氮条件下冻实后用高压油泵抽20min，充入氮气保护，融化后再抽20min，重复3次以除去其中的氧气，氮气保护加热到65℃搅拌反应3天，用乙醚沉降，抽干后用截留量为3000的透析袋透析三天，冻干得到RGD-PEG-PELG-KGN待用。

(2)RGD-PEG-PELG-KGN与磷酸缓冲盐溶液在4℃充分搅拌溶解后形成水凝胶溶液，其中RGD-PEG-PELG-KGN的质量分数为8％。将水凝胶溶液与骨髓间充质干细胞悬液在20℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为1×10⁶/ml。将水凝胶细胞混合悬液滴加于支架本体上，置于离心管中，在4℃以200rpm/min离心15分钟；取出离心后的支架本体置于37℃环境下，得到最终的组织工程支架。

实施例12至13

除了下表格1的内容之外，实施例12至13以与实施例11基本相同的方式进行。

实施例14至15

除了下表格2的内容之外，实施例14至15以与实施例11基本相同的方式进行。

实施例16至17

实施例16-17与实施例11基本相同，区别仅在于在实施例16中以胶原作为水凝胶；实施例17中以壳聚糖作为水凝胶。

本发明对通过熔融沉积打印出的PLGA支架进行了研究，其中将实施例1打印出的PLGA/NaCl复合支架，在去除NaCl之后标记为PN11，同样，实施例2标记为PN21，实施例4标记为PN12。并且，以常规高温熔融沉积(参数：打印温度为180℃、纤维直径为300μm以及纤维间隔为300μm)打印出的PLGA支架作为PLGA对照组。

1、大体观察结果

请参阅图3a和3b，分别为PLGA对照组和实验组PN11的实物照片。从图中可以看到，采用高温熔融沉积打印出的PLGA支架孔径较大，且出现纤维坍塌和粘连现象，同时纤维排列也不规整。而本发明通过添加赋形剂制备的PLGA/NaCl复合支架不仅成功打印出孔径适中的支架，而且纤维排布规整，外形完好。

2、电镜下观察支架的表面形貌

请参阅图4a-4d，分别对应PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组PN12的电镜照片。图4e-4h，分别对应PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组12的纤维表面放大图。从图中可以看到，虽然4组样品的纤维直径和纤维间隔均设置为300μm。但是由于打印所采用的材料成分不同，工艺不同，导致纤维形态有较大的差异。如图4a中可以看到，高温熔融沉积打印的支架纤维粗细不均，且存在粘连和孔径坍塌的现象。本发明改进后的PLGA/NaCl复合支架纤维排列规则，有利于细胞生长。如图4b至4d中所示，随着添加的NaCl比例的升高，材料的粘度降低，采用同样打印参数制备的PLGA/NaCl复合支架的纤维逐渐变细。从图4f至4h中还可以看到，PLGA/NaCl复合支架表面随着NaCl所占质量分数的増长而变得更加粗糙，且表面出现了更多微孔，这些微孔平均直径在5～10μm左右，粗糙度是因为NaCl在复合支架打印纤维内聚集所引起的，而微孔是因为部分外露的NaCl结晶溶解所致，因为NaCl结晶部分所溶解部分的质量损失与NaCl所占质量分数的比例完全吻合。PLGA对照组的质量损失相对大于添加有NaCl的PLGA/NaCl复合支架。这些表面和内部的微孔有利于营养物质运送和代谢产物排出，同时这些微孔有助于细胞贴附。此外，实验证明，PLGA对照组的降解要比PLGA/NaCl复合支架的降解更快。因此，本发明通过加入NaCl，能够有效抑制支架的降解，促使支架的降解速度与软骨修复速度相匹配。

3、3D打印支架的去赋形剂质量丢失比

为了检测3D打印支架赋形剂NaCl浸泡水后的去除情况，支架分别浸泡在双蒸水中48小时后取出。进行前后质量对比分析。结果显示：去除赋形剂以后的支架的质量丢失与NaCl在复合支架中的质量分数是完全吻合的，提示NaCl已经完全溶解，支架的主要成分为PLGA。

4、力学强度测试

请参阅图5，为PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组PN12的抗压强度测试结果图。如图所示，实验组的PLGA/NaCl复合支架即使在去除NaCl颗粒后也具有较高的抗压强度，可达6～8MPa，明显高于PLGA对照组的2.4MPa的检测结果。并且随着NaCl比例的提高，材料的抗压强度反而增加。当PLGA/NaCl的质量比为1:2时，该抗压强度高达22MPa，并不适用于作为软骨修复支架使用，可考虑作为骨修复支架使用。因此，软骨修复用支架最佳的PLGA/NaCl的质量比为2:1～1:1。

5、细胞增殖实验

通过CCK-8实验，发现上述4种支架在体外培养过程中均支持MSCs细胞的增殖，细胞培养液的OD值逐渐增高。请参阅图6，为PLGA对照组、实验组PN11、实验组PN21和实验组PN12的支架的CCK8检测结果图。其中各组支架在接种骨髓间充质干细胞复合培养1、3、7天后，在培养液内加入200μl CCK-8工作液进行检测。因为孔径原因，PLGA/NaCl复合支架的细胞保留度明显高于纯PLGA支架，且PLGA/NaCl复合支架的表面粗糙程度高于PLGA支架，因此更利于细胞增殖。故在1，3，7天PLGA/NaCl复合支架的细胞增殖明显高于纯PLGA支架，尤其是实验组PN11细胞增殖最为明显(图6中n＝3，*p<0.05，#与同时间点纯PLGA组相比p<0.05)。

上述结果提示，相比纯PLGA打印的支架，低温3D打印技术可对PLGA/NaCl支架的孔径及孔隙率进行精确控制。所得到的PLGA/NaCl复合支架为高分子聚合物材料，无细胞毒性，生物相容性好，具有良好的机械强度，显著优于纯PLGA支架；3D打印PLGA/NaCl支架孔径300～350μm左右，易于存留细胞，同时具有更好的表面活性，能明显利于细胞粘附以及增殖。

本发明还对前述制备的新型水凝胶RGD-PEG-PELG-KGN的性能进行了分析。为了进行对比，本发明分别制备了以下试样：

PPG：aPEG-PELG₁₃；PPG-K：aPEG-PELG-KGN；

R-PPG：RGD-PEG-PELG₁₃；R-PPG-K:RGD-PEG-PELG-KGN。

其中，aPEG-PELG₁₃和aPEG-PELG-KGN分别按照实施例11中提及的方法制备，RGD-PEG-PELG₁₃的制备方法如下：

步骤(1)、按照实施例11的方法制得aPEG-PELG₁₃。

步骤(2)、将aPEG-PELG₁₃ 2.0g、天冬氨酸1.5g和偶氮二异丁腈75mg溶于N,N-二甲基甲酰胺中，放入安全瓶中在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽20min，充入氮气保护，融化后再抽20min，重复3次(在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽20min，充入氮气保护，融化后再抽20min为一个循环)以除去其中的氧气，然后氮气保护下加热至65℃并进行搅拌，反应3天后，所得产物用乙醚沉降，抽干后用截留量为3000的透析袋透析3天，得到RGD-PEG-PELG₁₃。

1、样品表征

对实施例11制得的水凝胶产物及中间产物进行核磁表征。该测试使用的是Bruker AV400 NMR核磁共振谱仪，溶剂使用氘代三氟乙酸(TFA-d)，0.01％(v/v)四甲基硅烷(TMS)为内标。如图7a和7b所示，分别为中间合成的聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物(aPEG-PELG₁₃)及最终产物RGD-PEG-PELG-KGN的核磁谱图，RGD-PEG-PELG-KGN的聚合度(DP)通过比较侧链甲基和聚乙二醇上的亚甲基(-CH₂CH₂O)的积分面积得到的，计算结果表明实际得到的聚合度和投料比基本吻合，证明了聚合物的成功制备。

2、水凝胶相图检测：

聚合物溶液的凝胶转变温度通过试管倒置法测试。首先，使用RGD-PEG-PELG-KGN，并配制好浓度为6wt％，8wt％，10wt％，12wt％的聚氨基酸溶液，在0℃充分溶解。然后将聚氨基酸溶液0.5mL转移到直径为11mm的小管，放置在水浴中。整个测试过程的升温速率为1℃/min，每个温度下保持10分钟。在某个温度下，倒置试管，如果聚氨基酸溶液在30秒内不发生流动，则认为其发生了凝胶转变。每个样品平行测试三次。

采用上述方法对上述制得的总计四种聚氨基酸分别进行检测，其水凝胶的相位转变图如图8所示。从图8中可以看出，本发明制得的aPEG-PELG-KGN、RGD-PEG-PELG-KGN以及RGD-PEG-PELG₁₃都可以在不同的温度发生溶液向胶态的转变，且相转变温度随着聚氨基酸浓度的增加而降低。而且，从图中可以看出，8wt％的功能化聚氨基酸溶液具有较适宜的液-胶转变温度：33℃，因此该浓度的功能化聚氨基酸凝胶更适合生物体内应用。

3、动态流变学分析：

使用MCR 301流变仪(Anton Paar)，测试条件为应变幅度为1％，角频率为1rad/s，升温速率为0.5℃/min。对上述制得的四种聚氨基酸按照上述方法进行动态流变学分析，其分析结果如图9所示。

通过动态流变学分析可以得到储能模量G′，当储能模量随着温度骤然增大时，所对应的温度极为凝胶的相转变温度。aPEG-PELG₁₃以及3种功能化aPEG-PELG₁₃溶液的储能模量在20℃左右时突然增加，表明其由溶液转变为凝胶状态。8wt％四种溶液在10～50℃的升温过程中，aPEG-PELG₁₃以及三种功能化聚氨基酸水凝胶的储能模量按照从大到小的顺序依次为：aPEG-PELG₁₃，aPEG-PELG-KGN，RGD-PEG-PELG-KGN，RGD-PEG-PELG₁₃。

4、体外降解实验：

水凝胶在体内的降解主要是通过表面的溶蚀和聚合物的降解来实现的。体内环境除了有多种酶以及其他因子可能促进降解，因此为了更好的模拟体内降解的过程，我们在降解环境中加入蛋白酶K溶液。首先将聚氨基酸分别溶解于水中，在0℃充分溶解，制备成8wt％的聚合物溶液。然后取0.5mL置于2ml玻璃瓶中，在37℃放置10分钟，使其成胶。加入3mL浓度为4U/mL的蛋白酶K，和0.05mol的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.6)；空白的Tris-HCl缓冲溶液作为对照组，然后在设定的时间间隔内，取出降解介质后对凝胶进行称重，然后加入新的降解介质。实验平行进行三次。

采用上述方法对未修饰的聚氨基酸aPEG-PELG₁₃和功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN分别进行检测，其检测结果如图10所示。从图10中可以看出，不含蛋白酶K，仅用Tris-HCl缓冲溶液作为降解液的aPEG-PELG₁₃和RGD-PEG-PELG-KGN凝胶组仅分别有15.1％和14.5％的质量损失，而蛋白酶K处理组在第16天，aPEG-PELG₁₃和RGD-PEG-PELG-KGN凝胶组的质量损失高达85.5％和76.4％。这和蛋白酶K能有效促进酰胺键和酯键的降解有关，同时也说明聚氨基酸水凝胶在不加入细胞培养或者体外无酶环境中具有良好的稳定性。

其次，水凝胶必须具有合适的降解时间，降解太快不利于包裹的种子细胞增殖和分化，降解太慢不利于新生组织的长入，修饰了KGN和RGD的聚氨基酸的降解速度大大减缓，比未修饰的聚氨基酸更适宜体内使用。

5、体外释放能力检测：

本发明研究了制得的功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN所形成的凝胶在体外KGN的释放行为，以此说明本发明制得的功能化聚氨基酸的结构对药物释放速率的影响。

检测方法为超微量紫外光分光光度计法，控制凝胶浓度在8.0wt％。

对照组：未加蛋白酶K；实验组：加入蛋白酶K。

如图11所示，随着时间的推移，对照组和实验组检测出的KGN的含量均持续上升，这说明对照组和实验组都表现出持续的释放KGN能力，从而证明本发明制得的功能化聚氨基酸以凝胶形式应用时能持续释放KGN，从而起到治疗作用。

对比对照组和实验组的数据可以看出，实验组的释放速度和释放出的KGN总量都显著优于对照组。若是将KGN简单地包裹于聚氨基酸凝胶中，那么KGN和凝胶之间的作用力是简单的分子间的束缚力，它是一种低水平的作用力，释放速度一定快。而本发明是将KGN通过共价键结合到聚氨基酸上，作用力强，因此凝胶中KGN的释放需要破坏酰胺键和酯键，加入蛋白酶K可以破坏聚氨基酸的结构，故对照组和实验组的数据有显著差别。

本发明还按照实施例11的方法将在实验组PN11上复合水凝胶和骨髓间充质干细胞，形成双相支架(水凝胶-KGN/PLGA 3D打印生物支架)。本发明还将等量的骨髓间充质干细胞接种于同样方法制得的RGD-PEG-PELG-KGN水凝胶上，作为水凝胶对照组。并在PLGA对照组上接种上等量的骨髓间充质干细胞。

1、CCK8检测细胞增殖结果

请参阅图12，为根据本发明的PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN11在接种骨髓间充质干细胞，复合培养1、3、7天后的CCK8检测结果图。如图12所示，细胞在水凝胶对照组以及实验组PN11中增殖最快，而且分布均匀。

2、软骨相关基因表达结果

为进一步检测支架的成软骨骨诱导能力，将上述PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN11的支架在成软骨诱导培养基中培养三周后进行Ⅱ型胶原蛋白(COL2)的检测，以及软骨相关基因的检测。在诱导2周(14天)和3周(21天)两个时间点分别留取培养基的上清液，离心后用ELISA检测试剂盒分析上述各种蛋白含量。同时对支架进行RT-PCR检测，测定不同诱导条件下软骨基质和成软骨基因的表达。请参阅图13a-13b，为根据本发明的PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN11的糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原蛋白的检测结果。图14a-14d分别为根据本发明的PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN11的RT-PCR结果显示的软骨相关基因表达结果图。其中图14a为II型胶原蛋白(Col II)，图14b为丝氨酸(AGC)，图14c为碱性磷酸酶(ALP)I型胶原蛋白(Col I)，图14d为I型胶原蛋白(Col I)，其中n＝3，*p<0.05，#与同时间点PLGA对照组相比p<0.05。结果显示在各时间点，接种了骨髓间充质干细胞的水凝胶对照组(即聚氨基酸水凝胶)和实验组PN11(即聚氨基酸水凝胶复合PLGA/NaCl支架)的软骨基质分泌均高于纯PLGA对照组，且随着体外培养时间增加，基质分泌增加。软骨特异性基因COLII和AGC表现出与软骨基质分泌相似的升高趋势。此外，软骨细胞肥大基因ALP和COL I仅有轻微升高，没有生物学意义。

3、生物力学分析

为了检测实验组PN11(即聚氨基酸水凝胶复合PLGA/NaCl支架)是否符合骨软骨修复的力学要求，对实验组PN11、PLGA对照组和水凝胶对照组进行生物力学检测。请参阅图15，为根据本发明的PLGA对照组、水凝胶对照组和实验组PN11的抗压强度测试结果。如图所示，实验组PN11和PLGA对照组的力学强度明显高于水凝胶对照组，且与天然骨软骨的力学强度相似(5-10MPa)，因此可以为骨软骨修复提供良好的生物力学支撑。

上述实验结果表明，骨髓间充质干细胞(MSCs)在本发明提供的聚氨基酸水凝胶复合PLGA/NaCl支架中具有和聚氨基酸水凝胶中相似的成软骨能力；鉴于聚氨基酸水凝胶复合PLGA/NaCl支架既能提供良好的生物力学性能，又利于MSCs的增殖和成软骨诱导，我们认为聚氨基酸水凝胶复合PLGA/NaCl支架可以作为一种新型的修复骨软骨缺损的生物力学支架。