本发明涉及胎盘细胞外基质的制备方法，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：组织与器官的功能丧失是人类健康的主要障碍。理论上，组织与器官的再生可以克服这些障碍。有机体内固有的细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)可以引导器官发育、修复和生理再生。目前，细胞外基质去细胞的方法主要有三种：(一)血管灌流法；(二)酶学法；(三)化学脱细胞剂清洗法。这些去细胞的方法常常有下述的缺点：(一)脱细胞时间长；(二)组织去细胞化不完整；(三)异体组织抗原残留；(四)细胞外基质生物成分和物理性能受到损害。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种胎盘细胞外基质的制备方法，该制备方法不仅简单易操作，而且脱细胞时间短，同时获得的外基质去细胞化完整、无异体组织抗原残留、生物成分和物理性能不会受到损害。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种胎盘细胞外基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：step1：将新鲜胎盘速冻并保存在-80℃环境中，冻存48h以上；step2：将冻存的胎盘取出，室温融化；step3：将融化的胎盘组织分离，并在研磨机上研磨成组织碎块，大小为0.1mm～2mm；step4：对研磨得到的组织碎块进行去细胞、病毒灭活和漂洗处理；step5：将处理后的组织碎块预先放置在-20℃～-80℃环境中过夜，或者迅速浸在干冰中，然后将组织碎块放置于冻干机内冻干24h～48h，即得胎盘细胞外基质。前述的制备方法，其特征在于，在step4中，前述去细胞、病毒灭活和漂洗处理在室温下进行，具体的过程如下：(1)将组织碎块浸于浓度为0.2％～2％的sds溶液中，持续搅拌混匀30min～60min；(2)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为0.3％～3％的tritonx-100溶液中，持续搅拌混匀1h～24h；(3)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为1％～5％的nacl溶液中，持续搅拌混匀30min～60min；(4)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为0.2％～2％的过氧乙酸溶液中，持续搅拌混匀15min～30min；(5)将经上述处理后的组织碎块浸于去离子水中，持续搅拌混匀30min～60min；(6)重复步骤(1)至步骤(5)，重复两次。前述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，前述sds溶液的浓度为1％。前述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，前述tritonx-100溶液的浓度为2％。前述的制备方法，其特征在于，组织碎块浸于浓度为2％的tritonx-100溶液中后，持续搅拌混匀4h。前述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，前述nacl溶液的浓度为3％。前述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，前述过氧乙酸溶液的浓度为1％。本发明的有益之处在于：(1)本发明的制备方法结合了三种组织器官脱细胞方法，简单易操作，脱细胞时间大大缩短，生物成分和物理性能不会受到明显损害，最大程度保留了各种细胞反应因子和伤口愈合因子，富含胶原蛋白、弹力纤维蛋白和gags，有益于生产扩大化；(2)本发明的制备方法因为将组织预先加工成碎块，所以去细胞化完整，无异体组织抗原残留。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。第一部分：制备胎盘细胞外基质step1：冻存将新鲜胎盘速冻并保存在-80℃环境中，冻存48h以上，保证彻底冰冻。新鲜胎盘取自于人体。step2：融化将冻存的胎盘取出，室温融化。step3：研磨将融化的胎盘组织分离，并在研磨机上研磨成组织碎块，组织碎块的大小为0.1mm～2mm。step4：去细胞、病毒灭活和漂洗对研磨得到的组织碎块进行去细胞、病毒灭活和漂洗处理，在室温下进行，具体的过程如下：(1)将组织碎块浸于浓度为1％的sds溶液中(sds溶液的浓度在0.2％～2％范围内均可)，持续搅拌混匀30min(可适当延长至60min)，在这个过程中sds可高效溶解细胞并且不会对细胞外基质造成明显的损害；(2)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为2％的tritonx-100溶液中(tritonx-100溶液的浓度在0.3％～3％范围内均可)，持续搅拌混匀4h(时间可控制在1h～24h)，在这个过程中tritonx-100作为非离子型除垢剂，因其不含电荷，故对蛋白结构影响最小；(3)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为3％的nacl溶液中(nacl溶液的浓度在1％～5％范围内均可)，持续搅拌混匀30min(可适当延长至60min)，在这个过程中高渗溶液nacl可裂解细胞膜和杀菌；(4)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为1％的过氧乙酸溶液中(过氧乙酸溶液的浓度在0.2％～2％范围内均可)，持续搅拌混匀15min(可适当延长至30min)，在这个过程中过氧乙酸完成了对病毒的灭活处理；(5)将经上述处理后的组织碎块浸于去离子水中，持续搅拌混匀30min(可适当延长至60min)，在这个过程中去离子水可清除剩余的化学物质；(6)重复步骤(1)至步骤(5)，重复两次。step5：冻干将处理后的组织碎块预先放置在-20℃～-80℃环境中过夜(或者迅速浸在干冰中)，然后将组织碎块放置于冻干机内冻干24h～48h，即得胎盘细胞外基质，冻干的细胞外基质可进一步加工成各种形状的制品以满足市场和临床的需要。第二部分：对制备得到的胎盘细胞外基质进行质量评价1、去细胞化完整程度为检验组织去细胞化的完整程度，我们将去细胞化的组织制作成切片标本并进行h.e.色，显微镜下没有观察到明显残留的细胞核。结论：采用本发明的方法制备得到的胎盘细胞外基质去细胞化完整，无异体组织抗原残留。2、去细胞后细胞外基质所保留的生物成分经检测，用本发明的方法去细胞后的组织保留了各种细胞反应因子和伤口愈合因子：tgfb1100毫微克bfgf1400毫微克egf200毫微克pdgf200毫微克igf1800～900毫微克vegf800毫微克胶原蛋白300～400微克弹力纤维蛋白300～350微克gags20微克结论：因为化学处理组织的时间大大缩短，所以采用本发明的方法制备得到的胎盘细胞外基质生物成分和物理性能没有明显受到损害，最大程度保留了各种细胞反应因子和伤口愈合因子，富含胶原蛋白、弹力纤维蛋白和gags，有益于生产扩大化。4、水溶性经检测，采用本发明的方法制备得到的胎盘细胞外基质不溶于水。5、储存时间经检测，采用本发明的方法制备得到的胎盘细胞外基质可储存在4℃环境下，储存时间长达两年。综上所述，采用本发明的方法制备得到的胎盘细胞外基质不仅去细胞化完整、无异体组织抗原残留，而且生物成分和物理性能没有明显受到损害，最大程度保留了各种细胞反应因子和伤口愈合因子，富含胶原蛋白、弹力纤维蛋白和gags，可以进一步加工成各种用于临床再生医学、组织修复、生物打印、制药、卫生保健、美容、食品等领域。第三部分：上述胎盘细胞外基质的应用采用本发明的方法制备得到的胎盘细胞外基质不溶于水，并且去细胞化完整、无异体组织抗原残留、生物成分和物理性能没有明显受到损害，所以其可制成膜片、流性软基质、微颗粒、粉剂、膏剂、海绵状制品等剂型，以满足临床上不同的需要，其主要应用在组织工程、人工器官、损伤与修复和再生医学中，用来吸引炎症细胞、促进血管生成、促进组织再生、促进分泌细胞因子、改善伤口愈合过程。此外，采用本发明的方法制备得到的细胞外基质，其还可以与各种生长因子、细胞因子、蛋白质、抗体、多肽、氨基酸、核苷酸等结合或混合，制成应用在临床再生医学、组织修复、生物打印、制药、卫生保健、美容、食品等领域。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12