铁死亡抑制剂在制备抑制阿霉素所致心脏毒性药物中的应用的制作方法

本发明涉及铁死亡抑制剂ferrostatin-1在与抗肿瘤药物阿霉素联合使用时，能显著减轻阿霉素造成的心脏毒性。

背景技术：

阿霉素(doxorubicin，dox)属于蒽环类抗肿瘤抗生素，具有抗瘤谱广，抗瘤作用强，疗效确切等特点，广泛地用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，如急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、软组织肉瘤和卵巢癌等。与其他抗肿瘤药物类似，阿霉素一方面对癌变的细胞具有强烈的损伤作用，另一方面对正常的细胞和组织也具有毒害，可以引起脱发、骨髓抑制和心脏毒性等毒副反应。其中，阿霉素最大的毒副作用是不可逆的心脏毒性。临床表现轻者为心律失常，重者为心肌炎或心力衰竭。这不仅极大地影响了患者的生存质量，也使阿霉素的临床应用受到了极大的限制。

阿霉素对心脏的毒性是通过累积和剂量依赖的方式引起心肌损害，但其导致心肌损伤的机制仍未完全明了。目前研究认为与活性氧的过量产生、脂质的过氧化反应、dna的损伤和肿瘤抑制蛋白的累积等有关。近年来越来越多的证据表明，使用阿霉素导致的心脏铁过载在其心脏毒性的发生发展中起着极其重要的作用。目前唯一批准应用于临床的抗阿霉素心脏毒性保护剂右丙亚胺(dexrazoxane,dxz)就是一种铁螯合剂。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供铁死亡抑制剂ferrostatin-1在制备治疗阿霉素心脏毒性药物中的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种铁死亡抑制剂在制备治疗阿霉素心脏毒性的药物中的应用，该铁死亡抑制剂为ferrostatin-1。

在发明过程中，发明人发现fer-1能够显著降低接受大剂量阿霉素(20毫克/公斤体重)注射的小鼠的死亡率。进一步通过中剂量阿霉素(10毫克/公斤体重)注射小鼠模型证实，ferrostatin-1能明显抑制铁过载导致的铁死亡，改善心脏功能，但并不改变小鼠的组织铁含量。该研究结果为ferrostatin-1改善阿霉素心肌病提供了理论依据，特别是对相关药物研发提供了基础。

铁死亡抑制剂ferrostatin-1在治疗阿霉素心脏毒性时，其用法和用量为：隔天腹腔注射ferrostatin-1(1毫克/公斤体重)，7天为一疗程。

本发明发现了铁死亡抑制剂ferrostatin-1可用于制备治疗阿霉素心脏毒性的药物，扩大了阿霉素的临床应用。

就铁螯合剂而言，过去几十年来的研究一直认为铁在其中只是参与到了细胞凋亡或者坏死的病理生理过程中。随着细胞生物学技术手段的发展，越来越多的新型细胞死亡形式被逐渐发现，其中就包括了铁死亡。铁死亡(ferroptosis)是一类铁依赖的细胞死亡途径，不同于凋亡、坏死、自噬等其他死亡途径。铁死亡表现为细胞脂质过氧化水平和标志基因ptgs2表达量升高，可特异性被铁离子螯合剂抑制。ferrostatin-1(fer-1)是目前公认的铁死亡抑制剂；作为含有n-环己基的化合物，ferrostatin-1与细胞膜磷脂双分子层有较高亲和性，能有效清除细胞膜脂质过氧化，但其不改变铁的含量，从而能够规避铁螯合剂导致的许多临床副作用。至今尚无铁死亡及其抑制剂在阿霉素心脏毒性方面作用的报道。

即，铁螯合剂通过减低组织的铁含量来抑制铁死亡；而fer-1直接抑制铁导致铁死亡的脂质过氧化过程，它本身是不改变铁的含量的(图4)。临床上，铁螯合剂的使用往往由于过度影响必需微量元素铁的含量而导致副作用。使用fer-1能够既抑制铁死亡，又不改变铁含量。

阿霉素心肌病是各个非常复杂的病理生理过程，已知的参与其中的死亡方式就有凋亡、坏死、程序性坏死、自噬等，本发明鉴定出一种新的细胞死亡方式(铁死亡)也参与到其中，它的抑制剂可以降低阿霉素对心脏的毒性。

综上所述，本发明提供了铁死亡抑制剂在治疗阿霉素心脏毒性中的应用，所述铁死亡抑制剂ferrostatin-1可用于制备治疗抗癌药物阿霉素心脏副作用的药物。本发明经体内实验论证，ferrostatin-1通过抑制阿霉素所导致的铁死亡过程，从而降低阿霉素心脏毒性引起的致死性，具有显著的保护作用。本发明为以铁死亡为靶点的铁过载疾病的治疗提供了理论依据，特别是对阿霉素心肌病的药物研发提供了基础，具有临床实用性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为存活率方面fer-1对小鼠dox心脏毒性的保护作用示意图。

图2为fer-1逆转dox导致的小鼠心脏铁死亡示意图，分别以心脏ptgs2mrna(a)和血清丙二醇mda(b)为指标。

图3为fer-1逆转dox导致的小鼠心力衰竭示意图，分别以心脏心房钠尿肽(anp)mrna(a)，脑钠尿肽(bnp)mrna(b)和肌球蛋白重链7(myh7)mrna(c)为指标。

图4为fer-1腹腔注射1周后小鼠心脏非血红素铁含量示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

1.材料和方法

1.1实验动物

6周龄spf级c57bl/6雄性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，spf环境饲养。标准饲料ain-76a(铁含量50mg/kg，researchdiets，inc)适应喂养2周后，按体重随机分组，每组6～8只。

1.2药物及处理

化合物单体fer-1和阿霉素(dox)均购自selleck公司。阿霉素溶于生理盐水，fer-1溶于含2％(v/v)二甲基亚砜dmso的生理盐水中，fer-1的浓度为100微克/毫升。阿霉素分别以20毫克/公斤体重(致死试验)和10毫克/公斤体重一次性腹腔注射；fer-1以1毫克/公斤体重的剂量隔日腹腔注射。阿霉素处理一周后，5％水合氯醛腹腔麻醉小鼠，心脏采血，分离血清，并收集心脏组织(液氮保存)。

1.3rna提取和荧光定量实时pcr

trizol(lifetechnologies)法提取细胞和组织的rna，具体操作按说明书进行。nanodrop1000spectrophotometer上检测rna纯度(od260/od280≈1.9-2.1)及rna浓度(ng/μl)，调整rna浓度到1μg/μl。

2.0μgrna经dnase(promega)处理后，m-mlv反转录酶(promega)和oligo(dt)18primer(takarabioinc.)进行反转录。cfx96real-timesystem(bio-rad)中进行荧光定量实时(real-timepcr)检测mrna水平各相关基因表达，检测体积为10ul，试剂采用iqsybrgreensupermix(bio-rad)，引物序列如下：

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forwardgctgaaagcagaaagagattatc

reversetggagttcttctcttctggag。

mrna水平的变化，如图2(a)与图3(a、b、c)所述。

1.4心脏非血红素铁水平测定

将心脏组织块称重后加入1毫升组织消化液(3m盐酸300ml/l，和0.61m(10％)99.735g/l三氯醋酸，溶解后超纯水定容到1升)，65℃消化不少于50小时，中间震用震荡器震动三次，每次不少于10分钟，确保组织消化完全，之后用组织消化液定容至1.5毫升。在96孔板中每孔加入200微升铁显色液工作液(铁显色液储液：饱和醋酸钠溶液：超纯水＝1:5:5)，加入10毫升样品，充分混匀，室温显色10分钟。在535nm波长读吸光度值(酶标仪)，将组织消化液设为空白，根据铁标准液的吸光度计算组织非血红素铁含量(图4)。

1.5血清丙二醛(mda)测定

采用硫代巴比妥比色法测定丙二醛(mda)，严格按照试剂盒说明书操作，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。mda是脂质过氧化产物，用于指示铁死亡的发生与程度(图2b)。

1.6统计方法

全部数据采用均数±标准误(mean±sem)表示，使用graphpadprism(version6.0,graphpadsoftware；sandiego,ca,usa)统计学软件进行统计学分析。p＜0.05代表差异有显著性，具有统计学意义。

2.结果

2.1ferrostatin-1挽救阿霉素导致的小鼠死亡

6周龄的c57bl/6雄性小鼠标准膳食均衡2周后随机分成2组，同时腹腔注射20毫克/公斤体重阿霉素，一组隔天腹腔注射ferrostatin-1(1毫克/公斤体重)，另一组腹腔注射等剂量的生理盐水，每日定时观察小鼠是否死亡。

结果显示，ferrostatin-1干预组的存活率显著高于生理盐水对照组，提示ferrostatin-1在体内水平能抑制阿霉素导致的细胞损伤与死亡。

2.2ferrostatin-1抑制阿霉素导致的心脏衰竭和铁死亡

6周龄的c57bl/6雄性小鼠标准膳食均衡2周后随机分成3组，第一组为对照组，腹腔注射生理盐水，二、三组均腹腔注射阿霉素(10毫克/公斤体重)。阿霉素注射前24小时和注射后24小时第三组腹腔注射ferrostatin-1(1毫克/公斤体重)。阿霉素注射48小时后解剖小鼠，检测心脏组织损伤标记物(心房钠尿肽，脑钠尿肽和肌球蛋白重链7mrna水平)，ptgs2mrna水平，nadph水平，血清丙二醛(mda)水平，以及心脏非血红素铁含量。

结果显示，阿霉素联用ferrostatin-1能明显抑制被阿霉素显著上调的心脏组织损伤标记物，提示其对心脏毒性的保护作用。

同时，第二组即单阿霉素注射组心脏组织ptgs2mrna水平，nadph水平及血清丙二醛(mda)水平显著上调，说明阿霉素能在体内诱导脂质过氧化和铁死亡。联用ferrostatin-1能明显抑制这些指标，说明ferrostatin-1在体内水平能抑制阿霉素导致的铁死亡。

最后，阿霉素与ferrostatin-1联合处理组(第三组)同阿霉素单独处理组(第二组)相比，心脏非血红素铁含量没有明显差异，说明ferrostatin-1抑制铁死亡的同时，并不影响机体的铁代谢水平。

基于上述实验，ferrostatin-1抑制铁过载导致铁死亡是治疗阿霉素心脏毒性的治疗方法。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110>浙江大学

<120>铁死亡抑制剂在制备抑制阿霉素所致心脏毒性药物中的应用

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