一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法与流程

本发明涉及干细胞
技术领域：
，特别是指一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法。
背景技术：
：至今世界上用于人体疾患治疗和美容的干细胞主要为造血干细胞和间充质干细胞，后者主要来源于胎盘/脐带、骨髓和脂肪组织。间充质干细胞最初在骨髓中发现，间充质干细胞凭借其高度的自我更新和多向分化潜能，易于分离培养和扩增，无致瘤性及伦理道德问题，易于外源基因转染和表达，易于获得、移植且可避免排斥反应等诸多优势，逐渐成为干细胞研究领域的焦点，并具有重要的研究和应用前景，特别在细胞治疗和基因治疗中有重要的临床应用价值。间充质干细胞在体内外能够大量扩增，在特定的诱导环境下，可分化为皮肤、脂肪、毛发、骨骼、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝脏、心肌和内皮等多种组织细胞。从而可用来唤醒休眠的内源性干细胞和功能细胞，修复受损的细胞，替换衰老的细胞和增补死亡和缺失的细胞。连续不断地传代培养可导致干细胞发生不同程度的分化和老化，降低他们的优势，这些弱点已构成了大规模生产、保存和临床使用的重大挑战。其二，间充质干细胞可以合成和分泌大量的细胞因子如细胞生长因子，血管诱导因子，免疫调节因子，炎性损伤因子等，从而来重塑皮肤的质地和外观，增强肌力和体力，恢复智力和记忆，调节细胞的代谢和功能。同样，衰老的间充质干细胞不但增殖分化能力下降，而且也会引起不同程度的副反应如炎症反应、促瘤生长、易发生凋亡等。为了发扬间充质干细胞的优势和避免其可能的劣势，我们通常采用低传代的间充质干细胞来作为应用的对象，绝对避免使用衰老和病变的干细胞。大量的研究表明这些低传代的成体干细胞可用于抗衰老、治未病、防止和修复病变引起的组织器官损伤。近年来干细胞在美容整形等领域应用广泛：自体间充质干细胞在美容中最早应用在整形外科中，如用于去疤痕、填皱纹、增肤质、祛色斑、修损伤、抗衰老和丰胸等，它已成为应用较多的一种干细胞美容技术。而传统上所谓的干细胞美容术，一般都是直接注射干细胞针剂。这种注射用干细胞的来源主要是异体的胎盘/脐带或自体的脂肪/皮肤干细胞，但是这些干细胞的获取纯化、培养扩增、冻存运输和注射应用都需要一系列昂贵的仪器设备、苛刻的GMP洁净条件和熟练的专业技术人员。此外，操作流程和工艺非常复杂，不宜长期保存和快速运输，这就大大阻碍了干细胞的产业化和相关产品的推广和使用。目前怎样高效地冻存、干燥和复苏大量的间充质干细胞也面临着许多技术问题。如常规细胞冻存液含有DMSO和异种血清，对细胞有毒，可引起过敏和可能排斥反应，不利于干细胞在美容和医疗等方面的推广应用。其二鲜活的干细胞由于操作复杂、数量小，耗时长，运送使用受限，也不利于干细胞在美容和医疗等方面的推广应用。再者常规的含血清的干细胞培养液易引起细胞的分化和老化，不能保障大规模干细胞培养的质量，也不利于干细胞在美容和医疗等方面的推广应用。最后，怎样复活冷冻的干细胞和保持其内在的活性成分也是急需解决的问题。技术实现要素：本发明提出一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法，解决了现有技术中细胞冷冻技术存在的细胞毒副效应、异源血清可能导致过敏和排斥反应、冷冻后无活的干细胞以及干细胞中的活性成分不能完好保留的问题。本发明的技术方案是这样实现的，一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：1)收集：收集传代数为2～8代之间的优质人间充质干细胞；2)间充质干细胞的培养：用无血清的培养基扩增和传代人间充质干细胞；3)间充质干细胞的冻存：使用细胞冻存保护液将传代人间充质干细胞冷冻至-80度；4)冻干粉的制备：将步骤3)中处理后的人间充质干细胞制备成冻干粉；5)添加复活液：向步骤4)制备的冻干粉中添加复活液。优选的，步骤3)中所述细胞冻存保护液包含活性成分物质及含量如下：海藻糖0.1-10.0g/100ml，右旋糖酐0.1-20.0g/100ml，多聚精氨酸0.1-10mg/100ml，甘露醇0.1-5.0g/100ml，羟乙基淀粉0.1-5.0g/100ml，泊洛沙姆(P188)0.1-5.0g/100ml，丙三醇0.1-10.0g/100ml，蔗糖0.1-5.0g/100ml(0.25mol/L)，聚乙烯吡咯烷酮0.1-5.0g/100ml，其余为注射用水和无血清的基础培养基。海藻糖是由两个葡萄糖分子以a，a，1，1-糖苷键构成非还原性糖，自身性质非常稳定，海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压、干燥失水、强紫外线辐射等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。它作为新一代的超级保湿因子成为化妆品市场消费的一个热点。它可以降低溶液中蛋白质的水化作用，干燥时则能取代水或作为玻璃样稳定剂。右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌-1226(Leuconostocmesenteroides)发酵合成的一种高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血浆代用品之一。临床上常用的有中分子右旋糖酐(Dextran70，平均分子量6万-8万，美国Baxter公司)，主要用作血浆代用品，用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。多聚精氨酸有4-9个精氨酸组成，是一种具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，可有效携带比其分子质量大数十倍的外源性疏水大分子进入细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。丙三醇和甘露醇可用来保证冻干过程的顺利进行和调节渗透压，这些保护基上的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。很多糖类如蔗糖和多元醇被用于溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质的稳定剂，它们既是有效的低温保护剂又是很好的冻干保护剂。泊洛沙姆188(Poloxamer188)是聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物的非专利名，平均分子量：7680～9510，可作为一种高分子药用辅料，为非离子型表面活性剂，具有较佳的乳化能力和安全性，5％的泊洛沙姆188可有效改善固体脂质纳米粒的吸收，从而提高其口服生物利用度。P188稳定由于多种原因引起的细胞膜缺陷。还具有对抗氧化的应激和炎症反应的作用。中羟乙基淀粉的平均分子量为70,000-80,000道尔顿。适应症为血容量补充药。并增加细胞膜负电荷，使已聚集的细胞解聚，降低全身血粘度，抑制血管内红细胞聚集作用，用于改善微循环障碍，临床用于低血容量性休克，如失血性、烧伤性及手术中休克等；血栓闭塞性疾患。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，分子量：MW：58000，不参与人体新陈代谢，又具有优良的生物相容性，对皮肤、粘膜、眼等不形成任何刺激。从生物学的观点来看，PVP的分子结构特色类似于用简单的蛋白质模型的那种结构，在快速冷冻和复苏过程中能更有效地保护细胞。优选的，步骤5)中所述复活液包含活性成分物质及含量如下：海藻糖0.1-10.0g/100ml，丙三醇0.1-8g/100ml，泊洛沙姆(P188)0.1-5.0g/100ml，维生素C0.01-0.1g/100ml，注射用水与冻干前的水含量相等。优选的，步骤2)中所述无血清的培养基采用申请号为CN2017100038074的培养基。优选的，步骤4)冻干粉的制备方法：a、在100级安全柜和GMP细胞培养间中消化、离心和清洗低传代数的人间充质干细胞；b、在100级安全柜中打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的清洗液，在0.75ml的脐带间充质干细胞培养液中加入0.25ml的特殊无DMSO和血清的冻存保护液，混匀移至一无菌的收集管中平衡20min，然后-80度直接冻存；c、将-80℃冻存的干细胞保存液抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干粉，4℃保存。优选的，所述无血清的基础培养基为DMEM和F12按溶液体积比1∶1的比例混合均匀而成。本发明的有益效果：1)本发明的冷冻保护液，不含对细胞有毒副作用的DMSO，也不含有可能引起免疫反应的异种血清和蛋白。采用海藻糖、蔗糖和右旋糖酐等调节渗透压防止对细胞膜的破坏；用泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮保护细胞膜和有关的蛋白质，用多聚精氨酸和丙三醇利于细胞内水分子的通透和避免冰晶的形成。2)本发明的冷冻复活液和高效的复活技术，由双蒸水、海藻糖、透明质酸、P188和维生素C组成，采用二步复活法，现用冷冻前干细胞冻存液总体积的三分之一的复活液快速溶解2分钟，继而再将另三分之二的复活液加入，将细胞外高渗恢复到等渗状态，从而避免细胞水化而引起的突然肿胀，保证细胞的高效复活。3)本发明的干细胞冷冻保护液和复活液，能最大程度地防止干细胞在冷冻干燥和复苏过程中多种原因造成的细胞损伤和死亡，从而能保持干细胞的存活，进行正常的生理代谢和各种功能，同时也最大程度地保存了各种细胞因子的活性，有利于干细胞冻干粉用于美容抗衰老等大健康领域。4)本发明的干细胞冷冻保护液和复活液体系成分简单清晰，无批次之间的差异，重复性好；可高效地获得大量优质的人间充质干细胞冻干粉，最大程度保护间充质干细胞的活性；防止了冷冻干燥和复苏过程中干细胞的损伤和死亡，确保了间充质干细胞冻干前后生物学特性保持不变；为细胞治疗和美容提供高纯度和高活力的干细胞建立了实用的技术平台。5)本发明的干细胞冷冻保护液和复活液中的一些成分本身就是皮肤美容和抗衰老的有效成分，如海藻糖和透明质酸可保湿防紫外、维生素C可美白，聚乙烯吡咯烷酮可保护皮肤。这样有助于干细胞冻干粉更有效地用于美容抗衰老。6)本发明采用了培养体系(CN2017100038074)，用于体外大规模培养人间充间质干细胞，这种培养基不含动物来源的血清，因此可以控制感染风险，具有改善细胞的生理代谢和增殖生长潜能和防止干细胞分化和衰老的功效。7)本发明所制备的冻干粉有效地保存了人间充质干细胞中的各种具有生物活性的细胞因子、细胞膜成分、多种酶和核酸，可以有效地解决干细胞活性成分保存期有限这一瓶颈，为人间充质干细胞的产业化应用提供了坚实的技术保障。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明原代和第8代人脐带间充质干细胞在我们研发的无血清无分化扩增培养基中的生长状态；图2为人脐带间充质干细胞的冻干粉，每管1ml干细胞冻干保护液，含有2百万间充质干细胞；图3为冻干粉状的间充质干细胞在不同复活液作用后的形态表现，只有本发明公开的复活也具有一定的复活干细胞的效果，注射用水和生理盐水都不能有效复活动感后的干细胞；图4为流式细胞仪检测复苏传代后的细胞表面标志物，结果显示冻干前后的人脐带间充质干细胞的标志物无任何差异。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例一一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：1)收集：收集传代数为2～8代之间的优质人间充质干细胞；2)间充质干细胞的培养：用无血清的培养基扩增和传代人间充质干细胞；所述无血清的培养基采用申请号为CN2017100038074的培养基；3)间充质干细胞的冻存：使用细胞冻存保护液将传代人间充质干细胞冷冻至-80度；所述细胞冻存保护液包含活性成分物质及含量如下：序号活性成分含量(％)1海藻糖0.1g/100ml2右旋糖酐0.1g/100ml3多聚精氨酸0.1mg/100ml4甘露醇0.1g/100ml5羟乙基淀粉0.1g/100ml6泊洛沙姆(P188)0.1g/100ml7丙三醇0.1g/100ml8蔗糖0.1g/100ml(0.25mol/L)9聚乙烯吡咯烷酮0.1g/100ml其余为注射用水和无血清的基础培养基，基础培养基为DMEM和F12按溶液体积比1∶1的比例混合均匀而成；4)冻干粉的制备：将步骤3)中处理后的人间充质干细胞制备成冻干粉；冻干粉的制备方法：a、在100级安全柜和GMP细胞培养间中消化、离心和清洗低传代数的人间充质干细胞；b、在100级安全柜中打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的清洗液，在0.75ml的脐带间充质干细胞培养液中加入0.25ml的特殊无DMSO和血清的冻存保护液，混匀移至一无菌的收集管中平衡20min，然后-80度直接冻存；c、将-80℃冻存的干细胞保存液抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干粉，4℃保存；5)添加复活液：向步骤4)制备的冻干粉中添加复活液，间充质干细胞冻干粉的复活液可使冻干粉中60％以上的间充质干细胞复活，复苏后的含有活细胞的液体可以直接用于机体，此冻存保护液的成分如下：海藻糖0.1g/100ml，丙三醇0.1g/100ml，泊洛沙姆(P188)0.1g/100ml，维生素C0.01g/100ml，注射用水与冻干前的水含量相等。复活液的配制：取80ml的注射用水，加入海藻糖0.1克、丙三醇O.1克、泊洛沙姆0.1克、维生素C10.01克，充分混匀后以0.22um滤膜的滤器过滤，最后用注射用水补齐到100ml即可，作为冷冻间充质干细胞的复活液于4度冰箱待用。实施例二一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：1)收集：收集传代数为2～8代之间的优质人间充质干细胞；2)间充质干细胞的培养：用无血清的培养基扩增和传代人间充质干细胞；所述无血清的培养基采用申请号为CN2017100038074的培养基；3)间充质干细胞的冻存：使用细胞冻存保护液将传代人间充质干细胞冷冻至-80度；所述细胞冻存保护液包含活性成分物质及含量如下：序号活性成分含量(％)1海藻糖9g/100ml2右旋糖酐15g/100ml3多聚精氨酸5mg/100ml4甘露醇5g/100ml5羟乙基淀粉5g/100ml6泊洛沙姆(P188)3g/100ml7丙三醇4g/100ml8蔗糖5g/100ml(0.25mol/L)9聚乙烯吡咯烷酮5g/100ml其余为注射用水和无血清的基础培养基，基础培养基为DMEM和F12按溶液体积比1∶1的比例混合均匀而成；4)冻干粉的制备：将步骤3)中处理后的人间充质干细胞制备成冻干粉；冻干粉的制备方法：a、在100级安全柜和GMP细胞培养间中消化、离心和清洗低传代数的人间充质干细胞；b、在100级安全柜中打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的清洗液，在0.75ml的脐带间充质干细胞培养液中加入0.25ml的特殊无DMSO和血清的冻存保护液，混匀移至一无菌的收集管中平衡20min，然后-80度直接冻存；c、将-80℃冻存的干细胞保存液抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干粉，4℃保存；5)添加复活液：向步骤4)制备的冻干粉中添加复活液，间充质干细胞冻干粉的复活液可使冻干粉中60％以上的间充质干细胞复活，复苏后的含有活细胞的液体可以直接用于机体，此冻存保护液的成分如下：海藻糖2g/100ml，丙三醇2g/100ml，泊洛沙姆(P188)2g/100ml，维生素C0.01g/100ml，注射用水与冻干前的水含量相等。复活液的配制：取80ml的注射用水，加入海藻糖2克、丙三醇2克、泊洛沙姆2克、维生素C0.01g克，充分混匀后以0.22um滤膜的滤器过滤，最后用注射用水补齐到100ml即可，作为冷冻间充质干细胞的复活液于4度冰箱待用。实施例三一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：1)收集：收集传代数为2～8代之间的优质人间充质干细胞；2)间充质干细胞的培养：用无血清的培养基扩增和传代人间充质干细胞；所述无血清的培养基采用申请号为CN2017100038074的培养基；3)间充质干细胞的冻存：使用细胞冻存保护液将传代人间充质干细胞冷冻至-80度；所述细胞冻存保护液包含活性成分物质及含量如下：其余为注射用水和无血清的基础培养基，基础培养基为DMEM和F12按溶液体积比1∶1的比例混合均匀而成；4)冻干粉的制备：将步骤3)中处理后的人间充质干细胞制备成冻干粉；冻干粉的制备方法：a、在100级安全柜和GMP细胞培养间中消化、离心和清洗低传代数的人间充质干细胞；b、在100级安全柜中打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的清洗液，在0.75ml的脐带间充质干细胞培养液中加入0.25ml的特殊无DMSO和血清的冻存保护液，混匀移至一无菌的收集管中平衡20min，然后-80度直接冻存；c、将-80℃冻存的干细胞保存液抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干粉，4℃保存5)添加复活液：向步骤4)制备的冻干粉中添加复活液，间充质干细胞冻干粉的复活液可使冻干粉中60％以上的间充质干细胞复活，复苏后的含有活细胞的液体可以直接用于机体，此冻存保护液的成分如下：海藻糖10.0g/100ml，丙三醇8g/100ml，泊洛沙姆(P188)5.0g/100ml，维生素C0.1g/100ml，注射用水与冻干前的水含量相等。复活液的配制：取80ml的注射用水，加入海藻糖10.0克、丙三醇8克、泊洛沙姆5.0克、维生素C0.1g，充分混匀后以0.22um滤膜的滤器过滤，最后用注射用水补齐到100ml即可，作为冷冻间充质干细胞的复活液于4度冰箱待用。脐带来源间充质干细胞(UC-MSCs)的分离培养。无菌取剖宫产新鲜脐带约10cm，生理盐水洗去脐带残留血液，剪成2-3cm的小段，再次漂洗，纵行剖开脐带，剔除1条脐静脉、两条脐动脉，剥离华通胶。用眼科剪将华通胶剪碎成1mm3的小组织块，转移至细胞培养瓶中，加入特殊的无血清干细胞培养基(见专利申请号CN2017100038074)、其它成分为100U/ml青霉素、100mg/L链霉素和的DMEM/F12培养液，于5％CO2、37℃的培养箱中静置培养。倒置显微镜每天观察细胞生长情况：间充质干细胞形态呈梭形、纺锤形，局部可成集落生长。接种培养5-7d左右细胞形成片状融合达90％，呈旋涡状生长(图1A)，传到8代后细胞生长能力无变化，细胞在增殖传代过程中形态也无明显变化(图1B)。说明这种特殊的无血清干细胞培养基确实能使间充质干细胞保持无分化良好的扩增。待细胞长至85-90％融合时用胰蛋白酶/EDTA消化液消化制成1X106/ml细胞悬液，用上述冻存保护液冻存。UC-MSCs的冻干粉的制备。冻干粉的制备在100级GMP车间中进行，收集第4～8代融合度`为85％的UC-MSCs，用胰蛋白酶/EDTA消化液消化细胞，细胞变圆刚脱离培养版面时终止消化，用PBS清洗2遍，1000rp/min，离心5min。离心后，取前处理后的200万UC-MSCs/0.75mlDMEM/F12与保护液按体积比3∶1混合1份保护剂终质量分数为5％聚乙烯毗咯烷酮、10％海藻糖、10％右旋糖酐、6％羟乙基淀粉、6％P188、5％丙三醇、5％蔗糖、5％甘露醇和0.01％多聚精氨酸充分均匀。在冷冻干燥过程干细胞一般会受到冰晶损伤、溶质损伤和干燥脱水损伤。先将间充质干细胞依次在冻干保护液中平衡后，逐渐恢复到等渗状态，可以减小渗透压变化对细胞膜的损伤；即先可在4℃下平衡20min，然后快速置入-80度低温冰箱冷冻。将上述-80度的脐带间充质干细胞(2×106/ml)以及冷冻保护液置于-60℃平衡1小时，然后快速装入冻干机的干箱内，此时冻干机干箱的温度控制在-40℃左右(制品冻结到共晶点以下)，随后使得冻干机冷凝筒的温度迅速达-50--55℃，对冻干机干箱抽真空，使其真空度达10Pa使制品升华干燥，控制搁板温度在-55--35℃，时间14持续小时；最后制品解吸干燥，温度-30-20℃，时间在10小时内，真空度低于10Pa，使含水量小于3％，出箱包装(图2)。制备出的冻干粉外观无缺损，表面平整，体积与冻结时的体积基本相等，颜色均匀一致，溶解度好，澄明度好，稳定性好，不易受到污染，保质期长。冻干粉状的UC-MSCs的复苏MSCs的冻干及复苏：冻干粉3个月后复苏细胞，采用二步复活法：1)从包装箱中取出冻干管，现用冷冻前干细胞冻存液总体积的三分之一的37度复活液快速溶解1分钟，将细胞外高渗恢复到等渗状态，从而避免细胞水化而引起的突然肿胀，2)继而再将另三分之二的复活液加入，直接放入37℃水浴箱中融化，保证细胞的高效复活。继而，用PBS洗涤2遍，取100ul用胎盘兰染色，统计活细胞数。其余的细胞置入特殊的无血清(CN2017100038074)的DMEM/F12培养瓶内，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长到85％汇合度时，消化离心后用流式细胞仪检测鉴定。冻存3个月后再复苏，镜下可见细胞饱满，边缘整齐，形态完整，细胞成活率为65％～70％(图3A)。传代后生长良好，与冻存前基本一致，图3B显示细胞汇合度为90％时的细胞生长状态。相反，用与冷冻干燥前相等的注射用水(图3C)或医用的生理盐水(图3D)复苏冻干粉状的人脐带间充质干细胞，绝大多数都死亡，不能存活生长。用流式细胞仪检测复苏传代后的细胞表面标志物，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD29-PE、PDGFR，CD90-PE、SCa-1，CD-44PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-PE各10ul，充分混匀，室温下反应30min，每管加入1.5mlPBS，1000rpm/min离心5min，弃上清，每管加入100ulPBS，流式细胞仪检测。结果如图4，与冻干前的人脐带间充质干细胞的标志物无任何差异。脐带间充质干细胞冻干粉中细胞因子的含量人间充质干细胞通过规模化培养，在数量上可达到医疗美容所需要的水平。ELISA免疫组化试剂盒(R&DSystems公司)检测结果显示冻干前后间充质干细胞合成和分泌的一些细胞因子没有明显差异，主要的如：碱性成纤维生长因子(FGF-b)，胰岛素样的生长因子(IGF-1)，血小板生长因子(PDGF)，角质细胞生长因子(KGF)，表皮细胞生长因子(EGF)，肝细胞生长因子(HGF)等，结果如下表所示每毫升100万个间充质干细胞在冻干前后所含不同细胞因子的量。这说明本发明的冷冻保护液和复苏液不但能够完好的保护细胞，而且能有效地防止蛋白酶的激活和降解细胞因子，从而使冻干的间充质细胞能够较长期而更方便的保存，在应用上更有利于产业化和推广。大量研究表明在功能上，间充质干细胞可提供人体细胞所需要的各种脂质和核酸，它们还含有许多细胞因子(蛋白质)。如表皮生长因子能促进表皮细胞新陈代谢，快速代谢老化角质，修复痘印，细化皱纹，增强自身肌肤的保水及锁水能力，具有增强肌肤弹性、减少皱纹，防止肌肤衰老和渗透滋养等作用。IGF是人体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂，对维持与细胞分化有关蛋白质水平十分重要，与一些生长因子合用能促进细胞分裂和成熟。IGF-1还参与创伤愈合的过程。实验证明，损伤的神经、肌肉和肉皮细胞中IGF-1浓度增加IGF-1还参与创伤愈合的过程。FGF-b促进真皮细胞的增殖、分化，改善细胞生活微环境，促进受损皮肤的修复和细化皱纹，恢复细胞活力，内源性调节胶原蛋白让皮肤充盈有弹性，焕发健康光泽，可用于问题性皮肤的深层修复和除皱。KGF是角质细胞伸张因子，其主要功能有：促进表皮角质细胞生长，修复受损细胞，加速细胞的新陈代谢，通过KGF角皮层成纤维修复因子专一性的角皮修复后，增加皮肤的免疫力和抵抗力，使肌肤回复健康，亮白状态。VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生，促进内皮细胞增殖，同时可增加血管通透性使内皮细胞迁移，使肌肤白里透红。HGF可以激活Bcl-2基因表达并抑制Bax蛋白向线粒体膜表面移位，维持线粒体膜内外的电化学梯度、阻止线粒体内的细胞色素c漏出，从而抑制凋之相关蛋白caspase-3和caspase-9的活性，产生抗细胞凋亡作用；HGF可以刺激血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶一1以及c-met在血管内皮细胞和血管平滑肌细胞表达，并显着增加ets-1的mRNA表达和转录活性，从而在新生血管形成过程中发挥重要作用。NGF主要作用是：1)在机体发育过程中促使神经系统生长发育；2)在机体成熟后对正常神经细胞有营养保护作用；3)神经损伤(如脑血管意外和脑外伤)后可促使神经元再生和功能恢复；4)提高学习和记忆功能。PDGF有下述功能：1)修复皮肤的微血管系统，为皮肤提供充足营养。皮肤衰老一个重要的原因就是皮下血管萎缩，从而导致皮肤供血不足，故细胞缺乏营养，致使皱纹的产生。许多生长因子参与血管生成的生理调节。它们各自在其中起至关紧要作用。其中PDGF的再生血管功能对于延缓衰老有明显疗效。2)促进胶原蛋白的合成，有效延缓衰老。PDGF可以成功促进胶原蛋白的生成。通过PDGF生成的胶原蛋白比直接涂抹或食用胶原蛋白更能有效延缓皮肤衰老。3)PDGF是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力，促进纤维母细胞的生成，从而使皱纹自然长平。每毫升100万个间充质干细胞在冻干前后所含不同细胞因子的量因此，常规细胞冻存液含有DMSO和异种血清，对细胞有毒，可因其过敏和可能排斥反应，不利于干细胞在美容和医疗等方面的推广应用。其二鲜活的刚获得干细胞由于操作复杂、数量小，耗时长，运送使用受限，也不利于干细胞在美容和医疗等方面的推广应用。再者常规的含血清的干细胞培养液易引起细胞的分化和老化，不能保障大规模干细胞培养的质量，也不利于干细胞在美容和医疗等方面的推广应用。而本发明人间充质冻干粉的制备方法所制备的冻干粉有效地保存了人间充质干细胞中的各种具有生物活性的细胞因子和其他细胞成分，保存期可延长到2年，有效地解决干细胞产品的数量、质量和保存期有限多种瓶颈，为人间充质干细胞产业化应用提供了坚实的技术保障。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3