miR‑647在制备治疗胃癌的药物中的用途的制作方法

本发明涉及一种mir-647，具体涉及mir-647在制备治疗胃癌的药物中的用途。

背景技术：

mirnaagomir是经过特殊化学修饰的mirna类似物，通过模拟mirna进入mirisc复合物来调节靶mrna的表达而发挥作用。与普通的mirnamimics相比，agomir在动物体内具有更高的稳定性和mirna促进效果，而且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。在动物实验中可以用全身或局部注射、吸入、喂药等方法进行给药，作用效果持续时间可长达6周。已有不少mirnaagomir相关研究成果发表。本研究用于动物实验的agomir-647购自广州市锐博生物科技有限公司(产品编号：mir40003317-1-10)。目前尚无该agomir-647的实验研究成果报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对胃癌临床治疗疗效尚不理想而提供了一种治疗胃癌的药物组合物，本发明提供了mir-647在制备治疗胃癌的药物中的用途，本发明提供了agomir-647在制备治疗胃癌的药物中的用途。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括mir-647类似物agomir-647。所述agomir-647为体外合成的经化学修饰的mir-647类似物。

本发明提供了mir-647在制备治疗胃癌的药物中的用途。

本发明提供了agomir-647在制备治疗胃癌的药物中的用途。具体来讲是提供了agomir-647在制备抑制胃癌转移的药物中的用途。

本发明通过基础实验在细胞和动物水平首先证实mir-647对srfmrna的转录后抑制作用，并发现其可间接抑制转移相关的重要骨架蛋白、srf下游分子ii型肌球蛋白a(myh9)的表达。

本发明的有益效果在于：本发明通过胃癌组织qpcr和原位杂交等证实mir-647在胃癌中表达下调并与患者淋巴结转移和预后相关；通过生物信息学靶标预测、转移相关基因筛选验证及胃癌细胞株mir-647功能验证等实验，发现mir-647/srf/myh9轴在胃癌转移中起关键抑制作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中mir-647在胃癌中表达下调，并与患者淋巴结转移相关的图片；

图2为本发明实施例2中胃癌细胞系中的mir-647影响转移相关基因srf和myh9表达的图片；

图3为本发明实施例3中mir-647/srf/myh9信号轴显著抑制胃癌细胞迁移的图片；

图4为本发明实施例4中mir-647表达影响患者预后，并与srf水平表达相关的图片；

图5为本发明实施例5中mir-647发挥抑癌作用是通过影响srf表达实现的图片。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本发明mir-647类似物指agomir-647。

实施例1：mir-647在胃癌中表达下调，并与患者淋巴结转移相关

实验方法和结果如下(结果如图1所示)：

图1中a：通过qrt-pcr检测109例人胃癌组织(t)以及相对应的正常胃黏膜组织(n)中mir-647表达水平，其中使用u6rna作为内参。***p<.001

图1中b：用饼图及瀑布图展示mir-647人胃癌组织以及相对应的正常胃黏膜组织中mrr-647相对表达水平。mir-647相对水平的变化倍数(t/n)>2或<1/2则认为有统计学意义。瀑布图：mir-647相对水平的变化倍数(log2[t/n])>1或<-1则认为有统计学意义。

如图1所示，图1中a和b通过不同统计方法说明mir-647在胃癌中频发表达下调。

图1中c：mir-647表达水平与胃癌患者临床分期、淋巴结转移或局部浸润情况的相关关系分析。*p<.05；**p<.01。如图图1中c所示，mir-647表达与t、n、和tnm临床分期相关。

图1中d：qrt-pcr检测5种胃癌细胞株中mir-647表达水平结果。如图所示mgc80-3表达最低，ags和snu-5表达最高。

图1中e、f：qrt-pcr检测转染mir-647后的mgc80-3与mkn45胃癌细胞中mir-647表达水平。***p<.001。如图图1中e、f所示，两种细胞均有较好的转染效率。

图1中g：3d细胞迁移侵袭实验***p<.001

图1中h：单层细胞划痕试验用于2d细胞迁移。***p<.001。

如图1所示，图1中g和h分别观察mir-647稳定过表达细胞株和过表达后瞬转再次抑制其表达细胞株的迁移和侵袭情况，结果发现mir-647过表达后细胞迁移和侵袭能力下降，抑制mir-647后该能力有一定程度恢复，说明mir-647表达抑制胃癌细胞迁移和侵袭能力。

实施例2：胃癌细胞系中的mir-647影响转移相关基因srf和myh9表达

实验方法和结果如下(结果如图2所示)：

图2中a：通过4个常用的mirna数据库进行生物信息学预测mrr-647的潜在靶基因。其中展示了部分与细胞运动能力相关并且与rho通路相关的基因(标记为红色)。

图2中b：用mirbasetargets数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/targets)进行mrr-647靶基因通路富集分析。使用4个数据库以及mirgator(nam,etal.,nucleicacidsresearch.36:d159-64；http://genome.ewha.ac.kr/mirgator)。细胞运动功能相关的基因如图表所示。

图2中c：通过qrt-pcr检测mgc80-3与ags中rho通路相关基因的表达水平。其中由于mgc80-3胃癌细胞mir-647表达水平低，因此予mgc80-3胃癌细胞转染mir-647类似物；而ags胃癌细胞中mir-647表达水平高，因此予ags胃癌细胞转染mir-647抑制剂。u6作为内参。***p<.001。如图2中c所示，srf和myh9表达在两种细胞中均明显受mir-647表达影响。

图2中d-e：用westernblot与qrt-pcr检测5株胃癌细胞株中srf与myh9的表达水平。gadph作为内参。如图所示，ags和snu-5的srf和myh9表达相对较少；mgc80-3和mkn45细胞的srf和myh9表达相对较高。

图2中f：westernblot检测mgc80-3与mkn45胃癌细胞(均感染mir-647过表达的慢病毒或对照组慢病毒)中的srf与myh9蛋白表达水平。gadph作为内参。如图2中f所示，加入mir-647过表达慢病毒后，细胞srf和myh9表达均下调。

图2中g：westernblot检测感染mir-647抑制剂或其阴性对照(inc)的mgc80-3-lv-mir-647与mkn45-lv-mir-647胃癌细胞中srf与myh9的蛋白表达水平。gadph作为内参。如图2中g所示，加入mir-647抑制剂后原来过表达mir-647的两种细胞srf和myh9表达均有所恢复。

实施例3：mir-647/srf/myh9信号轴显著抑制胃癌细胞迁移

实验方法和结果如下(结果如图3所示)：

图3中a：通过targetscan与miranda数据库预测mir-647在srf与myh9mrna的3’端非编码区的结合序列。

图3中b、c：向稳定表达lv-mir-647或lv-nc的mgc80-3与ags(mgc80-3-lv-mir-647与ags-lv-mir-647)转入3’端非编码区报告质粒(pgv306-wt1-3)、位点突变报告质粒(pgv306-mut1-4)或对照质粒(pgv306空载)后的相关荧光素酶活性分析。以海肾荧光素酶活性作为参照。***p<.001。如图3中b、c所示，srf的3’端非编码区第1和第3位预测结合位点是mir-647的结合序列；myh9的预测结合位点未检测到mir-647结合活性。提示mir-647靶向抑制srf而非myh9mrna的3’端非编码区。

图3中d、e：用双荧光素酶报告基因分析验证确定srf通过靶标结合myh9启动子来调节myh9的表达。通过bioinformatics(proscan与jaspar)分析网站预测myh9启动子上转录因子结合的潜在序列。(d)本研究合成了myh9启动子全长序列(荧光素酶质粒构建)pgl3-myh9-1300(野生型)以及5段截断片段(pgl3-myh9-1000,pgl3-myh9-903,pgl3-myh9-753,pgl3-myh9-528andpgl3-myh9-328)。-589至-439位点含有srf结合位点的序列，在荧光素酶报告基因实验中发现对应荧光素酶活性显著增强(d)。通过进一步荧光素酶报告基因实验证实，srf能够直接结合myh9启动子上野生型序列(ccatatatgg在-589至-439位点中)，而不能结合其对应突变型序列(aacgaccagag)(e)。***p<.001。因此，srf通过结合myh9启动子区ccatatatgg促进myh9转录。

图3中f：用chip-qpcr实验方法分析验证在mgc80-3与ags胃癌细胞中srf结合myh9启动子情况。rna聚合酶ii(rnaii)能够结合到gadph启动子上，因此选其作为阳性对照。以相对于对照的igg富集倍数作为展示(mean±sd；*p<.05；**p<.01；***p<.001)。如图3中f所示，srf和mrtf抗体均可拉下以ccatatatgg为核心的myh9启动子区dna小片段，进一步说明srf和mrtf二者结合于ccatatatgg区域调控myh9表达。

图3中g：蛋白srf靶结合myh9启动子上的cargbox的图解说明。

图3中h：用westernblot检测分析转入srf质粒或对照组质粒的mgc80-3-lv-mir-647与ags-lv-mir-647胃癌细胞中srf与myh9表达水平变化。gadph作为内参。同时，westernblot也用于检测分析转入myh9质粒或对照组质粒的mgc80-3-lv-mir-647与ags-lv-mir-647胃癌细胞中srf与myh9表达水平变化。gadph作为内参。如图3中h所示，过表达mir-647下调srf和myh9表达；过表达srf恢复srf和myh9蛋白表达；而过表达myh9仅恢复myh9蛋白表达，srf表达未见明显变化。这说明mir-647抑制myh9和srf表达，srf促进myh9表达。结合荧光素酶报告基因检测结果提示，mir-647靶向抑制srf表达从而下调srf依赖性转录的myh9表达。

图3中i：3d细胞迁移侵袭实验：分别为：转染srf、myh9及空载体的ags-lv-mir-647胃癌细胞。eachbarrepresentsthemean±sd.***p<.001。如图3中i所示，mir-647过表达引起的细胞迁移侵袭减少在恢复srf或myh9表达后得到一定程度的恢复。结合之前实验结果，说明mir-647是通过srf/myh9轴影响胃癌细胞迁移侵袭的。

实施例4：mir-647表达影响患者预后，并与srf水平表达相关

实验方法和结果如下(结果如图4所示)：

图4中a：109例胃癌组织及对应正常粘膜中的srf蛋白进行免疫组化。原始倍数，100×放大倍数。

图4中b：根据srf表达水平的免疫组化结果进行评分作统计分析(卡方检验，***p<.001)。如图4中b所示，正常组织与癌组织的srf表达评分存在显著差异，癌组织中评分高的占多数(评分3的占44.96％，评分2的占32.11％)

图4中c：109例胃癌组织样品中srf表达水平与mir-647水平的相关关系分析，***p<.001。如图4中c所示，mir-647与srf的qpcr表达检测结果示二者表达呈负相关。

图4中d：原位杂交实验检测mir-647在胃癌组织与邻近正常黏膜组织中的表达情况。原始倍数，100×，200×。(diglabeledlnaprobesforu6andscramblewereusedaspositiveandnegativecontrols,respectively.)dig标记lna探针。分别作为阳性对照(u6)与阴性对照(scramble)。如图4中d所示，mir-647在癌中表达较正常上皮明显下调。

图4中e、f：109例胃癌病例中mir-647与srf和myh9表达水平间相关关系。所示为两代表性病例展示(e)。原始倍数、200×。组织标本中mir-647低表达或高表达以百分比表示，分析与srf和myh9表达水平的相关关系。*p<.05。如图4中e、f所示mir-647表达与myh9、srf均呈负相关。

图4中g：用kaplan-meier生存分析方法统计分析胃癌患者生存与其对应srf表达水平相关关系(log-ranktest)。如图4中g所示，mir-647表达高低与患者生存相关，mir-647低表达提示预后不良。

实施例5

图5中a-c用mir-647过表达慢病毒、srf过表达质粒及二者相应的对照构建胃癌细胞基因异常表达稳定株(lv-nc/vector是对照组；lv-mir-647/vector是mir-647过表达的胃癌细胞；lv-mir-647/srf是mir-647过表达后加入srf质粒稳定表达的细胞株，用于功能回复实验，证明mir-647的功能是通过抑制srf表达实现的)。用三种细胞裸鼠皮下成瘤后再原位种植到胃壁进行观察，每组各8只，对照组1只麻醉死亡。原位种植两个月后解剖观察，记录原发肿瘤大小及转移部位与数量，通过两样本t检验统计组间差异明显。说明mir-647过表达的胃癌细胞成瘤能力和转移能力显著下调，该现象在过表达srf水平后得到一定程度的逆转，在体内进一步说明mir-647发挥抑癌作用是通过影响srf表达实现的。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。