本发明涉及一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体，本发明还涉及一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体的制备方法，属于药物制剂领域。
背景技术：
年龄相关性黄斑变性(以下简称amd)是导致老人不可逆视力障碍的首要原因，主要是由于黄斑区结构的衰老性改变。老年性黄斑变性大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高，是当前老年人致盲的重要疾病。amd分干性(非新生血管性)和湿性(新生血管性)两种。干性amd是视网膜色素上皮细胞和感光细胞萎缩等引起黄斑区萎缩变性；湿性amd主要表现为玻璃膜破坏、脉络膜血管侵入视网膜下新生血管的生成。干性amd约占90％。湿性amd虽仅占10％，但是其导致严重的视力丧失的比率达到90％以上。欧美amd患者超过1600万人，预计2020年将达2500万人。中国老人的amd患病率为1.89％-15.5％，每年新发约30万例。激光疗法曾一度是湿性amd的主要疗法，近年来随着各大制药巨头对该疾病治疗药物研究的深入，第一个湿性amd治疗药物(注射用维替泊芬)、抗vegf治疗药物(如哌加他尼钠注射剂)、重组人源化单克隆抗体(avastin、lucentis、eylea)相继问世，蛋白酪氨酸激酶抑制剂(al-39324、帕唑帕尼)已在临床试验中，市场前景不容忽视。
但目前上市制剂大多数以注射液形式玻璃体注射给药，以贝伐单抗为例，bevacizumab，分子量149kda，其普通注射剂商品名是安维汀，
多囊脂质体为非同心圆蜂窝状结构，由若干个小室组成的一个近似球形的制剂。其是在1983被研制出的一种新型多囊脂质体，主要用于包封水溶性好的药物，具有包封率高，稳定性好等优点。其特点是能在注射部位或给药腔内大量积聚，在释放过程中，每个包药的小室逐渐破裂释放药物，具有良好的缓释目的和贮库效应，其可减少患者给药次数，提高顺应性。
cn201210579417.9公开了一种含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，但其微球材料为聚丙交酯-乙交酯及聚酸酐等，其降解后生成乳酸等的酸性物质，该降解产物易在眼部产生炎症反应及并发症，而多囊脂质体的脂质成分无刺激性，安全可靠，不会出现上述类似情况。
目前尚未有多囊脂质体用于眼部玻璃体注射的报道。因此，有必要提出有效的技术方案，研发出一种缓控释制剂使其在眼部达到有效、稳定的治疗浓度，减少患者给药次数，增加顺应性，以解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种副作用低、包封率高，具有长效缓释可控的眼部玻璃体注射用多囊脂质体。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体，所述多囊脂质体包括下列重量份的各组分：贝伐珠单抗1份、脂质0.2-150份、渗透压调节剂5-500份、辅助乳化剂6-200份；
所述脂质包括中性磷脂、三甘油酯、带电荷磷脂和胆固醇；
其中，所述中性磷脂占脂质总质量的百分比为20-60％，所述三甘油酯占脂质总质量的百分比为5-20％，所述带电荷磷脂占脂质总质量的百分比为5-20％，所述胆固醇占脂质总质量的百分比为10-50％。
优选的，所述中性磷脂是二油酰基磷脂酰胆碱，所述三甘油酯是三油酸甘油酯，所述带电荷磷脂是二棕榈酰磷脂酰甘油。
优选的，所述多囊脂质体的粒径为10-50μm。
本发明还提供一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制含渗透压调节剂的贝伐珠单抗溶液作为内水相；
(2)配制中性磷脂、三甘油酯、带电荷磷脂和胆固醇作为脂质，将所述脂质溶于有机溶剂中，得到脂质相；其中，所述中性磷脂占脂质总质量的百分比为20-60％，所述三甘油酯占脂质总质量的百分比为5-20％，所述带电荷磷脂占脂质总质量的百分比为5-20％，所述胆固醇占脂质总质量的百分比为10-50％；
(3)配制含渗透压调节剂和辅助乳化剂的水溶液作为外水相；
(4)按照所述内水相与所述脂质相的体积比为1:1-1:10，将所述内水相分散到所述脂质相中，形成w/o初乳；
(5)按照所述w/o初乳和所述外水相的体积比为1:1-1:5，将所述w/o初乳分散到所述外水相中，形成w/o/w型复乳；
(6)将所述w/o/w型复乳转移至外水相中，除去复乳中的有机溶剂，所得溶液500-3000rpm离心，取下层沉淀，加入生理盐水重新分散，得到本发明所述多囊脂质体；所述w/o/w型复乳与外水相体积比为1:1-1:4。
优选的，将步骤(4)所述内水相分散到脂质相中，其中所述分散的条件为：分散速度8000-12000rpm，分散时间3-5min。
优选的，将步骤(5)所述初乳分散到外水相中，其中所述分散的条件为：分散速度为4000-7000rpm，分散时间1-3min。
本发明还涉及一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的应用。
本发明提供了用于眼部玻璃体注射的以治疗眼部疾病的多囊脂质体，其脂质成分在玻璃体内降解成无刺激性成分，不会造成炎症及并发症的发生；同时延长药物在玻璃体的释放时间，减少患者用药痛苦。
本发明所提供的方法，制备的多囊脂质体包封率高，粒径大小在10-50μm之间，具有良好的缓释作用，减少了给药次数，提高了患者的顺应性。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：
图1为本发明实施例一所述的多囊脂质体的体外释放曲线图。
具体实施方式
本发明涉及一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体，包括贝伐珠单抗、脂质、渗透压调节剂和辅助乳化剂。其中，所述贝伐珠单抗浓度为25-100mg/ml，所述渗透压调节剂质量分数为0.1-10％，所述辅助乳化剂浓度为10-80mmol/l。
所述脂质含有中性磷脂、三甘油酯、带电荷磷脂、胆固醇。具体为二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇，三油酸甘油酯。脂质中各原料及其组分的选择，对于本发明中多囊脂质体的包封率、球形及分散程度来说是重要的。其中，所述中性磷脂占脂质总质量的百分比为20-60％，所述三甘油酯占脂质总质量的百分比为5-20％，所述带电荷磷脂占脂质总质量的百分比为5-20％，所述胆固醇占脂质总质量的百分比为10-50％。
本发明中，所述的中性磷脂是二油酰基磷脂酰胆碱，其是形成多囊脂质体的主要成分，只有具有含有双分子层的磷脂，药物才能被包封在其中。
本发明中，所述的三甘油酯是三油酸甘油酯，其是形成多囊脂质体的关键因素，否则，只能得到普通脂质体；三油酸甘油酯填充于多囊脂质体囊与囊之间的空隙中，起着连接稳定各个小室的作用；不同链长的三甘油酯，影响药物的体外释放速率。
本发明中，所述的带电荷磷脂是二棕榈酰磷脂酰甘油，其作用是增强所形成的多囊脂质体之间的稳定性，主要是由于中性磷脂由于范德华力作用易产生凝聚效应，相同电荷之间的排斥力可更好防止颗粒的凝集。其在脂质相中的浓度为1-10mg/ml,荷负电磷脂效果更佳。经过实验对比发现，含有二棕榈酰磷脂酰甘油的多囊脂质体比不含有的在球形圆整及分散程度上均有较明显优势，前者粘连在一起，分散性不好。
本发明中，所述的胆固醇作为膜稳定剂，可改善磷脂膜的流动性，减少药物的渗漏率，用量过多或过少都会影响多囊脂质体的稳定性和包封率，脂质相中胆固醇的浓度在5-20mg/ml，实验发现若不加胆固醇，所制得的多囊脂质体很快便破碎，达不到缓释效果。
本发明中，所述内水相中的渗透压调节剂为蔗糖、海藻糖及氯化钠中的一种或多种，优选蔗糖,但需要理解的是，本发明内水相中的渗透压调节剂不能是葡萄糖。本发明内水相中的渗透压调节剂的选择主要是依据贝伐单抗在5％葡萄糖及右旋糖中容易发生浓度依赖性降解，且处方筛选中也得到论证。
本发明中，所述的外水相中的渗透压调节剂为蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇和氯化钠中的一种或多种，优选葡萄糖。
本发明中，所述的内水相渗透压调节剂、外水相渗透压调节剂的存在，是保证内外水相压力差在一定范围内，增加多囊脂质体的稳定性，尽可能减少发生药物泄露。
本发明中，所述的有机溶剂为本领域常规使用的有机溶剂，一般为能溶解脂质成分的任何有机溶剂，较佳的为乙醚、甲醇、三氯甲烷、丙酮的一种或多种。
本发明中，所述的外水相中的辅助乳化剂为甘氨酸、组氨酸、l-赖氨酸中的一种或多种，优选l-赖氨酸。
下面通过实施例来具体阐述本发明所述一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体的制备方法。
实施例一
一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体的制备方法，包括如下步骤：
精密称取二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇，三油酸甘油酯分别22mg、6mg、18mg、6mg于10ml烧杯中，加3ml氯仿溶解，得到脂质相；
将上述得到的脂质相与4ml含7％蔗糖的25mg/ml的贝伐珠单抗溶液合并，涡旋混合，形成w/o型初乳；
将上述得到的初乳注入盛有10ml的4％葡萄糖和60mmol/l的赖氨酸水溶液中，涡旋混合,形成w/o/w型复乳；
将上述得到的复乳快速倒入20ml外水相中，37℃左右进行旋转蒸发，除去有机溶剂氯仿，1000r/min离心，弃去上清液，下部沉淀加适量生理盐水，得到本发明的多囊脂质体。
实施例一所述的多囊脂质体的体外释放曲线如图1所示，结果显示，贝伐珠单抗多囊脂质体具有明显体外缓释效果。
对比例一
精密称取二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇分别22mg、6mg、18mg于10ml烧杯中，加3ml氯仿溶解，得到脂质相；
将上述脂质相与4ml含7％蔗糖的25mg/ml贝伐珠单抗溶液合并，涡旋混合，形成w/o型初乳；
将上述初乳注入盛有10ml的4％葡萄糖和60mmol/l的赖氨酸水溶液中，涡旋混合,形成w/o/w型复乳；
将复乳快速倒入20ml外水相中，37℃左右进行旋转蒸发，除去有机溶剂氯仿，1000r/min离心，弃去上清液，下部沉淀加适量生理盐水，得到对比例一的多囊脂质体。
对比例一的制备方法与实施例一相同。不同之处仅在于对比例一中的脂质相组分缺少三油酸甘油酯。
对比例二
精密称取二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，三油酸甘油酯分别22mg、6mg、6mg于10ml烧杯中，加3ml氯仿溶解，得到脂质相；
将上述脂质相与4ml含7％蔗糖的25mg/ml贝伐珠单抗溶液合并，涡旋混合，形成w/o型初乳；
将上述初乳注入盛有10ml的4％葡萄糖和60mmol/l的赖氨酸水溶液中，涡旋混合,形成w/o/w型复乳；
将复乳快速倒入20ml外水相中，37℃左右进行旋转蒸发，除去有机溶剂氯仿，1000r/min离心，弃去上清液，下部沉淀加适量生理盐水，得到对比例一的多囊脂质体。
对比例二的制备方法与实施例一相同。不同之处仅在于对比例二中的脂质相组分缺少胆固醇。
对比例三
精密称取二油酰基磷脂酰胆碱，胆固醇，三油酸甘油酯分别22mg、18mg、6mg于10ml烧杯中，加3ml氯仿溶解，得到脂质相；
将上述脂质相与4ml含7％蔗糖的25mg/ml贝伐珠单抗溶液合并，涡旋混合，形成w/o型初乳；
将上述初乳注入盛有10ml的4％葡萄糖和60mmol/l的赖氨酸水溶液中，涡旋混合,形成w/o/w型复乳；
将复乳快速倒入20ml外水相中，37℃左右进行旋转蒸发，除去有机溶剂氯仿，1000r/min离心，弃去上清液，下部沉淀加适量生理盐水，得到对比例一的多囊脂质体。
对比例三的制备方法与实施例一相同。不同之处仅在于对比例三中的脂质相组分缺少二棕榈酰磷脂酰甘油。
贝伐珠单抗包封率的测定：
包封率是指被包裹物质(如某药物)在脂质体悬液中占药物总量的百分比。它是脂质体和纳米粒质量控制的一个重要的指标，反映了药物被载体包封的程度。
测定条件：色谱柱agilentbio-monolithproteina(5.2×4.95mm，0.1ml)；流动相：pbs溶液与醋酸溶液，等度洗脱；紫外检测器，检测波长：280nm，流速1.5ml/min，柱温：室温，进样量20ul。
测定过程：
1)取贝伐珠单抗多囊脂质体混悬液0.5ml，2500rpm，离心6min，弃去上清液除去游离药物，沉淀部分加入适量生理盐水重新混悬，再按照上述离心方法得沉淀部分，加入曲拉通溶解，测得所包封药物质量；
2)取贝伐珠单抗多囊脂质体混悬液0.5ml，加曲拉通溶解，测得总药物质量；
3)根据式i计算包封率。
包封率＝包封药物质量/总药物质量×100％
式i
采用本发明所述贝伐珠单抗包封率的测定方法测定实施例一所述的多囊脂质体的包封率为72.6％。
采用本发明所述贝伐珠单抗包封率的测定方法测定对比例一所述的多囊脂质体的包封率为6.8％。
采用本发明所述贝伐珠单抗包封率的测定方法测定对比例二所述的多囊脂质体的包封率为40.3％。
采用本发明所述贝伐珠单抗包封率的测定方法测定对比例三所述的多囊脂质体的包封率为50.3％。
测包封率时，对比例一所得下部沉淀明显较少，包封率仅为6.8％；对比例二所得下部沉淀较少，包封率仅为40.3％；对比例三所得混悬液分散性较差，有结块现象，包封率为50.3％。
通过实施例与对比例可知，本发明所用的各类材料缺一不可，若缺少其中之一，其包封率、球形及分散程度上将受到较大影响。
本发明所述药物为贝伐珠单抗，所述药物还可以为其他小分子药物或生物大分子药物。具体而言，所述小分子药物包括两性霉素、万古霉素、头孢他啶、庆大霉素、地塞米松、曲安奈德、糖皮质激素、帕唑帕尼；蛋白多肽类大分子药物包括雷珠单抗、阿柏西普及其衍生物等。
本发明所述眼部玻璃体注射用多囊脂质体治疗范围包括但不限于老年性黄斑变性(年龄相关性黄斑变性、amd)、青光眼、眼内炎及其它玻璃体视网膜疾病等。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。