Psoriasin抗体和LL‑37抗体在制备防治银屑病的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及psoriasin抗体和ll-37抗体在制备防治银屑病的药物中的应用。

背景技术：

银屑病是一种发病率高，易复发，严重影响患者的生活质量的慢性炎症性皮肤病。银屑病的病理表现为表皮角质形成细胞(keratinocyte，kc)过度增殖，异常分化，真皮浅层血管迂曲增生扩张，真表皮炎症细胞浸润，浸润的主要细胞为中性粒细胞和t淋巴细胞，在急性期，可见中性粒细胞形成的munro微脓疡，慢性期主要为t淋巴细胞浸润。目前多采用维a酸类药物进行治疗，但效果不佳且易复发，后期副作用也较大，小分子生物疗法虽然效果较好，但费用极高，患者难以承受，且远期复发率并未降低，故目前银屑病的治疗成为研究的重点问题。

众所周知，皮肤是外界微生物进入机体的天然屏障，银屑病虽然表皮屏障被破坏，却很少发生皮损的局部感染，这一现象与银屑病皮损中存在大量的抗菌蛋白相关，这些抗菌蛋白包括psoriasin、防御素和ll-37，其在炎症或感染时由kc或浸润的炎性细胞产生，其不仅有抗微生物的作用，且可趋化免疫细胞，刺激kc及浸润的免疫细胞产生一系列的前炎性因子，从而调节靶细胞的增殖、凋亡和分化。研究表明，在银屑病中，真皮变化早于表皮，发病最初是真皮浅层血管通透性增加导致一系列炎症细胞的浸润和血管的增生。研究表明，在银屑病初始发病中，真皮血管通透性增加导致一系列炎症细胞的游出和分化，这些炎症细胞主要有中性粒细胞、th1细胞、th17细胞及浆细胞样树突状细胞(plasmicdentriticcell，pdc)。受损细胞释放自身的dna和rna，后两者均可与抗菌肽ll-37结合形成复合物(银屑病患者表皮角质形成细胞可产生大量的ll-37)，这些复合物可活化pdc并使之产生干扰素α(interferon，ifn)；其也可产生il-1β、il-6和tnfα，这些均可促进kc分泌infα。而后者可促进dc的成熟并分泌il-12和23，从而使幼稚t细胞向th1和th17细胞分化，并通过淋巴管和血管，到达病灶区域。在此区域，th1细胞产生tnfα和ifnγ，th17细胞分泌il-17和il-22，从而促进kc的增殖和血管新生。故th17细胞的成熟在银屑病炎性因子的浸润和血管新生及kc增殖中均有重要作用。

psoriasin最初是由madsen等于1991年从银屑病患者异常增生的角质细胞中分离得到。编码该蛋白的基因位于人染色体1q21表皮分化复合物区的s100基因簇，因此它可能在表皮的生物学功能中起重要作用，其在银屑病的kc中表达升高，其后，在膀胱鳞状细胞癌，原位乳癌和侵袭性乳癌中均有较高表达，人脑和视网膜色素上皮细胞中也检测到psoriasin的表达。psoriasin的分泌可由多种因素诱导，在紫外线、促炎症性细胞活素(如il-1、il-17、tnf-α、制瘤素-m)和细菌鞭毛蛋白等条件的刺激下，psoriasin的分泌量也会相应增加。psoriasin能够通过上调炎性通路来促进乳腺肿瘤的形成。psoriasin的灭菌作用得益于它与zn²⁺结合的特性。zn²⁺是细菌进行正常新陈代谢的关键元素，而psoriasin可通过与zn²⁺螯合来抑制细菌的生长和繁殖。同时，在ph＜6的酸性条件下，psoriasin还可引起细菌生物膜结构的穿孔。

抗菌肽ll-37是目前在人体中发现的cathelicidins家族的唯一成员。1995年cowland等报道从人骨髓中性粒细胞中发现了一种具有α-螺旋结构的cathelicidincap-18(hcap-18)，其是ll-37的前体。hcap-18/ll-37编码基因位于人染色体3p21.3，含有3个内含子和4个外显子，其中第4个外显子编码成熟肽ll-37[10]。ll-37存在于人体多种细胞中。除了在上皮组织中有表达外，ll-37在人中性粒细胞、nk细胞和肥大细胞中也会持续表达。目前已知天然免疫系统中表达ll-37的其它细胞有树突状细胞单核细胞、巨噬细胞、在间充质干细胞和骨髓基质。在银屑病皮损中，ll-37高表达于表皮全层的kc细胞质和浸润的中性粒细胞中，其可分泌游离出细胞存在于细胞间质中。ll-37具有抗gram阳性、阴性菌，真菌及病毒的活性。除抗菌作用外，ll-37还可刺激肥大细胞脱颗粒并可趋化中性粒细胞，单核细胞，肥大细胞和巨噬细胞。ll-37有促进血管的形成和生长、促进伤口愈合的功能。

目前，ll-37被公认是一种上皮细胞生长因子。tokumaru等研究证明，ll-37可以诱导上皮细胞生长因子受体转录活化，促使角质形成细胞迁移。ll-37具有促进血管形成的功能。研究表明，在银屑病的发病初始，外界应激或微生物作用于皮肤后，不仅可产生以上所述的抗菌蛋白，也可刺激kc和浸润的炎症细胞产生一系列细胞因子趋化因子及酶类，如白介素(interleukin，il)-8，il-1β，肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)α和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，mmp)等，这些因子均可促进血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)的生成，最终导致血管内皮细胞的增生。研究还表明，活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ros)可以诱导psoriasin的生成，而后者又可以促进il-8和vegf的产生。故氧化应激所产生的ros在抗菌蛋白所致的t细胞分化和血管新生中有重要作用。ros可导致线粒体dna突变，而线粒体的功能障碍又可导致自由基产生增多，从而引起线粒体膜通透性的改变，进而形成恶性循环，最终造成细胞的损伤。故线粒体是一种相对早期受到损伤的细胞器，细胞主要是通过自噬来清除损伤线粒体以维持细胞的稳态。

自噬是指细胞内的溶酶体降解自身细胞器和其他大分子的过程，能够导致程序性细胞死亡。研究证明，自噬可能通过清除受损的线粒体和过氧化物酶体而抑制ros的产生。同时线粒体自噬调控了线粒体的质量，减少受损的线粒体数目，从而防止了ros诱导的炎症小体活化，进一步证明了自噬通过保护线粒体功能来降低ros的产生，从而起到抑制炎症的作用。

技术实现要素：

本发明解决的问题在于提供psoriasin抗体和ll-37抗体在制备防治银屑病的药物中的应用，达到抑制银屑病发展以及促进皮损恢复正常的目的。

本发明是通过以下技术方案来实现：

psoriasin抗体与ll-37抗体相组合在制备防治银屑病的药物中的应用。

所述的药物为外用药物。

以质量分数计，psoriasin抗体∶ll-37抗体＝(1～10)∶(10～1)。

以质量分数计，psoriasin抗体∶ll-37抗体＝(1～5)∶(5～1)。

所述的药物为抑制th细胞分化、促进活化t细胞凋亡的药物。

所述的药物为抑制过度免疫和自身免疫的药物。

psoriasin、ll-37作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用。

所述的药物包含针对psoriasin的抗体和针对ll-37的抗体。

一种防治银屑病的药物，其活性组分包括psoriasin抗体与ll-37抗体。

其活性组分包括psoriasin抗体与ll-37抗体；以质量分数计，psoriasin抗体∶ll-37抗体＝(1～5)∶(5～1)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

鉴于ll-37和psoriasin不仅在银屑病中表达升高，且在银屑病的病理表现中发挥重要作用，在银屑病的发病机制中处于起始位臵；本发明采用两者的抗体可阻止包括血管通透性的升高，炎症细胞的趋化、增多和聚集、炎症因子的释放、kc的增殖和血管的增生，使银屑病不再向前发展；同时所采用的抗体可对活化t细胞的凋亡及保持免疫系统的稳定性有重要作用，其可抑制过度免疫和自身免疫。

相比于当前多注重于抑制th细胞分化过程中所必需的细胞因子和趋化因子来抑制炎症反应，本发明不仅重视抑制th细胞的分化，也重视促进活化t细胞的凋亡；进一步，通过外用治疗咪喹莫特小鼠模型比较并探索两个抗体的最佳比率，结果表明ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml的治疗效果较为显著，具有较高的pasi评分。

与其它治疗银屑病药物相比，本发明的干预靶点更加明确，针对银屑病发病的炎症因子ll-37和psoriasin来进行药物的制备或者药物靶点。本发明采用适当浓度适当比率的ll-37抗体和psoriasin抗体治疗咪喹莫特小鼠银屑病模型，能够改善红斑、鳞屑和皮损厚度，达到抑制银屑病发展以及促进皮损恢复正常的目的；实验结果表明疗效明显。

附图说明

图1为ll37抗体1ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图2为ll37抗体5ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图3为psoriasin抗体1ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图4为psoriasin抗体5ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图5为ll37抗体1ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图6为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体5ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图7为ll37抗体1ug/ml&psoriasin抗体5ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图8为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图9为0.1％叠氮钠外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片；

图10为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml与ll37抗体1ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的pasi评分对比；

图11为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml与ll37抗体5ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的pasi评分对比；

图12为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml与psoriasin抗体1ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的pasi评分对比；

图13为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml与psoriasin抗体5ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的pasi评分对比；

图14为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml与ll37抗体1ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的pasi评分对比；

图15为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml与ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体5ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的pasi评分对比；

图16为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml与ll37抗体1ug/ml&psoriasin抗体5ug/ml外用治疗咪喹莫特小鼠的pasi评分对比；

图17为ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml与0.1％叠氮钠外用治疗咪喹莫特小鼠的pasi评分对比。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

ll-37和psoriasin不仅在银屑病中表达升高，且在银屑病的病理表现中发挥重要作用，在银屑病的发病机制中处于起始位臵，用其抗体可阻止包括血管通透性的升高，炎症细胞的趋化、增多和聚集、炎症因子的释放、kc的增殖和血管的增生，使银屑病不再向前发展，这些抗体可对活化t细胞的凋亡及保持免疫系统的稳定性有重要作用，其可抑制过度免疫和自身免疫。因此，采用适当浓度的的最佳比率ll-37抗体和psoriasin抗体治疗咪喹莫特小鼠银屑病模型，改善红斑、鳞屑和皮损厚度，来达到抑制银屑病发展以及促进皮损恢复正常的目的。

下面给出具体的实施例。

购买6-7周balb/c小鼠，2％水合氯醛麻醉后，剃去背部毛约2*2cm大小，外用咪喹莫特乳膏62.5mg，每天早上八点一次，外用不同浓度的不同比率的ll-37抗体和psoriasin抗体(均购自于北京博奥森生物技术有限公司，效价均为1mg/1ml，总计40ul)；具体的浓度分组为：

ll371ug/ml；

ll375ug/ml；psoriasin1ug/ml；psoriasin5ug/ml；

；ll371ug/ml&psoriasin1ug/ml；

ll375ug/ml&psoriasin5ug/ml；

ll371ug/ml&psoriasin5ug/ml；

ll375ug/ml&psoriasin1ug/ml；

同时，设0.1％叠氮钠外用治疗作为对照；

每天下午六点一次，每天早上拍照并pasi评分，分红斑、鳞屑、皮损肥厚三部分，每部分按照：无记为0分，轻度记为1分，中度记为2分，重度记为3分，极重度记为4分，计算合计分数即为pasi评分，共7天。把pasi评分应用graphpadprism5作图软件作图并统计比较。第8天脱颈椎处死小鼠后，取皮损，一部分做免疫组化。

不同浓度的ll-37抗体和psoriasin抗体外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片如图1～图8所示，可以看到不同浓度的治疗组有不同的治疗效果；

pasi评分结果如图10～图17所示，结果表明就不同的浓度的ll-37抗体和psoriasin抗体治疗效果来说，ll37抗体5ug/ml&psoriasin抗体1ug/ml浓度组具有最佳治疗效果(pasi评分最低，且与其他组合相比p＜0.05)。

相比于当前多注重于抑制th细胞分化过程中所必需的细胞因子和趋化因子来抑制炎症反应，本发明不仅重视抑制th细胞的分化，也重视促进活化t细胞的凋亡；本发明ll-37抗体和psoriasin抗体治疗咪喹莫特小鼠银屑病模型，能够改善红斑、鳞屑和皮损厚度，达到抑制银屑病发展以及促进皮损恢复正常。

因此本发明提出以下应用：

psoriasin抗体与ll-37抗体相组合在制备防治银屑病的药物中的应用。

具体的，所述的药物为外用药物。

以质量分数计，psoriasin抗体∶ll-37抗体＝(1～10)∶(10～1)。

以质量分数计，psoriasin抗体∶ll-37抗体＝(1～5)∶(5～1)。

所述的药物为抑制th细胞分化、促进活化t细胞凋亡的药物。

所述的药物为抑制过度免疫和自身免疫的药物。

psoriasin、ll-37作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用。

所述的药物包含针对psoriasin的抗体和针对ll-37的抗体。

基于上述应用，提出一种防治银屑病的药物，其活性组分包括psoriasin抗体与ll-37抗体。

具体的，其活性组分包括psoriasin抗体与ll-37抗体；以质量分数计，psoriasin抗体∶ll-37抗体＝(1～5)∶(5～1)。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。