脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗代谢综合征药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗代谢综合征药物中的应用。

背景技术：

代谢综合征是指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群，是导致糖尿病、心脑血管疾病的危险因素。胰岛素抵抗和高血糖、高血压、血脂异常等一系列代谢综合征，是非酒精性脂肪肝病、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病发病的“共同土壤”。由代谢综合征所致的高住院率、高致残率、高致死率已成为威胁全人类健康的公共卫生问题。

脂肪来源间充质干细胞(adsc)存在于脂肪组织的血管基质成分(svf)中，具有自我更新和多向分化潜能。adsc在体外可被诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等不同的组织细胞，是目前组织修复和再生领域的研究重点和热点。脂肪来源间充质干细胞外泌体可以携带具有生物学活性的蛋白质和rna等物质等，将有效成分及信息高效传递至受体细胞，在细胞间的信息交流中起重要作用。

目前对于脂肪来源间充质干细胞的研究主要涉及在肾脏、眼底疾病中的用途(cn102048756a)、在治疗勃起功能障碍的用途(cn105902568a)、在制备肝纤维化治疗制剂的用途(cn103436555a)、在制备治疗骨性关节炎制剂的用途(cn105748519a)、在制备肝癌化疗增敏制剂中的用途(cn103451152a)等，但迄今还未有关于脂肪来源间充质干细胞及其外泌体在治疗代谢综合征方面的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的提供脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗代谢综合征药物中的应用。

本发明研究发现，脂肪来源间充质干细胞外泌体可有效缓解胰岛素抵抗和代谢紊乱，在一定程度上抑制代谢综合征以及非酒精性脂肪肝的发生发展，由此提出了下述的发明内容：

本发明的第一方面，提供脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗代谢综合征药物中的应用。

本发明中，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体由如下方法制备而成：

(1)将剥离的脂肪组织分散于消化液中，以产生细胞悬浮液；

(2)离心细胞悬浮液，以形成细胞沉淀，分离沉淀，洗涤，得到含有脂肪来源间充质干细胞(adsc)的血管基质成分(svf)；

(3)在体外培养体系中对adsc进行扩增培养，收集扩增培养后的上清液，浓缩，向浓缩后的上清液中加入外泌体提取试剂，即提取得到脂肪来源间充质干细胞外泌体。

优选的，步骤(1)中，所述消化液是由krb缓冲液和ⅰ型胶原酶组成；更优选的，krb缓冲液和ⅰ型胶原酶的组成比例为1ml：2mg。

优选的，步骤(2)中，离心转速为2000rpm，离心时间为5分钟。

优选的，步骤(3)中，扩增培养的条件为：用不含外泌体的10％胎牛血清的dmem培养基(含有bfgf)培养adsc。

优选的，步骤(3)中，所述外泌体提取试剂为exoquick-tctm外泌体提取试剂。

本发明中，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体具有tsg101、cd9、cd63和hsp90标志。

优选的，本发明中，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体来源于小鼠附睾处脂肪组织。

优选的，本发明中，所述代谢综合征为高脂饮食诱发的代谢紊乱。

本发明的第二方面，提供包含上述脂肪来源间充质干细胞外泌体的组合物在制备治疗代谢综合征药物中的应用。

本发明的第三方面，提供脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝病的生物制剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次提出了脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗代谢综合征药物中的新用途，以及在制备治疗非酒精性脂肪肝病的生物制剂中的新用途。本发明研究发现，adsc来源外泌体可有效缓解胰岛素抵抗和代谢紊乱，在一定程度上抑制代谢综合征以及非酒精性脂肪肝的发生发展。此外，本发明还提供了上述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法，操作简单可行。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：脂肪来源间充质干细胞外泌体的透射电镜图；图中，白色标尺为150nm。

图2：外泌体标志western-blot的鉴定结果。

图3：adsc来源的外泌体干预治疗后，小鼠血清中甘油三酯含量。

图4：adsc来源的外泌体干预治疗后，小鼠血清中总胆固醇的含量。。

图5：adsc来源的外泌体干预治疗后，小鼠的葡萄糖耐量实验(gtt)中血糖的变化。

图6：adsc来源的外泌体干预治疗后，小鼠的胰岛素耐量实验(itt)中血糖的变化。

图7：adsc来源的外泌体干预治疗后，小鼠肝脏的照片。

图8：adsc来源的外泌体干预治疗后，小鼠肝脏中甘油三酯含量。

图9：adsc来源的外泌体干预治疗后，小鼠肝脏he染色图片；图中，白色标尺为100μm。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语说明：

代谢综合征：是指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群，是导致糖尿病、心脑血管疾病的危险因素。

adsc(adipose-derivedmesenchymalstemcell)：脂肪来源间充质干细胞，存在于脂肪组织血管基质成分中，是脂肪组织中的脂肪细胞前体，具有自我更新和多向分化潜能。

外泌体(exosome)：是细胞分泌外排的一类囊泡结构，直径约为30-120nm，内含多种蛋白和rna物质，可通过旁分泌或者内分泌方式作用于相应的组织或细胞，是介导细胞间信息传递的重要介质。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有关于脂肪来源间充质干细胞及其外泌体在治疗代谢综合征的报道。基于此，本发明提出了一种脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗代谢综合征药物中的应用。

在本申请的一种实施方案中，通过建立高脂饮食诱导的代谢综合症模型，进行adsc来源外泌体干预，分别检测外泌体干预后血清中甘油三酯、总胆固醇的含量；并在外泌体干预结束前进行葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验；外泌体干预结束后观察小鼠肝脏的脂肪变情况和肝脏中甘油三酯的含量。

综上，通过上述研究发现：adsc来源外泌体具有缓解胰岛素抵抗和代谢紊乱的作用，可用于代谢综合征的治疗；还可抑制高脂饮食诱导的脂肪肝病变，可用于制备治疗非酒精性脂肪肝病的生物制剂。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：adsc的提取与分离

⑴脂肪组织的分离：选取10～12周龄c57bl/6雄性小鼠，麻醉并处死小鼠后，打开腹腔，剥离其附睾处脂肪，尽量去除血管，称取脂肪重量后，浸于pbs中冰上放置。

⑵配制消化液：根据脂肪重量，按照每克脂肪需3mlkrb缓冲液，6mgⅰ型胶原酶的比例配制使用。

⑶脂肪组织消化：将剥离好的脂肪组织机械剪碎后，加入配制好的消化液中，混匀后置于37℃摇床中消化45分钟，2000rpm，离心5分钟，小心取出底部的细胞置于不加酶的krb中，冰上放置。

⑷过滤：用100μm孔径铜网过滤细胞悬液，滤过后的混悬液2000rpm，离心5分钟，弃上清。

⑸洗涤：沉淀物加入双倍体积的无酶krb缓冲液，混匀后2000rpm，离心5分钟，弃上清，沉淀物即为含有adsc的血管基质成分(svf)。

⑹种板：按照一只小鼠所提细胞接种至六孔板中一个孔的原则进行种板。加入含有bfgf的dmem条件培养基重悬。每孔加入2ml培养基，37℃、5％co2条件下培养，24-30小时后换液。

⑺传代：细胞融合度达90％时可进行传代。用pbs清洗细胞表面，加入适当胰酶消化细胞，按照每孔细胞传至一个10cm平皿中的原则进行传代培养。第四代的细胞进行后续实验。

实施例2：adsc来源的外泌体的提取与鉴定

用不含外泌体的10％胎牛血清的dmem培养基(含有bfgf)培养adsc。取第四代adsc细胞培养上清，0.22μm无菌过滤器过滤后，5000g，100k浓缩离心管4℃离心30分钟，取上室浓缩液于新的无菌15ml离心管中，加入exoquick-tc^tm外泌体提取试剂，置于4℃过夜后，5000g,4℃离心30分钟，弃上清，用无菌pbs重悬沉淀并分装，冻于-80℃保存。

将提取到的外泌体用透射电镜的方法对其直接大小以及形态进行检测，结果如图1所示；用western-blot的方法检测外泌体标志tsg101、cd9、cd63、hsp90，进一步对其进行鉴定，结果如图2所示。

实施例3：adsc来源外泌体对高脂饮食诱导代谢综合症模型的影响

(1)建立高脂饮食诱导代谢综合症模型与外泌体干预

7周龄c57bl/6雄性小鼠用于建立代谢综合症模型。在一周的预高脂饮食适应后，给予高脂饮食(hfd)(含有60％cal)喂养，以普通饮食(ncd)喂养作为对照组。高脂饮食喂养12-20周后，腹腔注射实施例2制备的外泌体(30μg/mouse，每3天注射一次，连续注射6-8周)，即为hfd-exosome组；腹腔注射生理盐水组为对照组，即hfd-ns。普通饮食喂养小鼠腹腔注射生理盐水组为ncd-ns。

(2)检测小鼠血清中甘油三酯的含量

外泌体干预结束后，取小鼠外周血，试剂盒检测小鼠血清中甘油三酯的含量。结果如图3所示，外泌体治疗后，小鼠血清中甘油三酯的含量明显降低。

(3)检测小鼠血清中总胆固醇的含量

外泌体干预结束后，取小鼠外周血，试剂盒检测小鼠血清中总胆固醇的含量。结果如图4示，外泌体治疗后，小鼠血清中总胆固醇的含量明显降低。

(4)葡萄糖耐量实验(gtt实验)

外泌体干预结束前两周，行gtt实验，结果如图5所示。由图5可以看出，外泌体治疗组小鼠对葡萄糖的耐量明显提高。

(5)胰岛素耐量实验(itt实验)

外泌体干预结束前一周，行itt实验，结果如图6所示。由图6可以看出，外泌体治疗组小鼠的胰岛素敏感性明显提高。

(6)小鼠肝脏脂肪变情况

外泌体干预结束后，取小鼠肝脏并拍照，观察小鼠肝脏的脂肪变情况，结果如图7所示。由图7可以看出，外泌体干预后，小鼠肝脏脂肪变明显改善。

(7)小鼠肝脏中甘油三酯的含量

外泌体干预结束后，取小鼠肝脏，提取小鼠肝脏中甘油三酯并用试剂盒检测甘油三酯的含量，结果如图8所示。如图8可以看出，外泌体干预可以降低小鼠肝脏中甘油三酯的含量。

(8)肝组织切片染色

外泌体干预结束后，取小鼠肝脏，并进行he切片染色，如图9所示，外泌体干预后，肝组织切片中脂滴数量减少。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。