本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种小叶金露梅提取物及制备方法及其抗肿瘤活性的应用。
背景技术：
小叶金露梅（potentillaparvifoliafisch.），又名金老梅药、小叶金老梅、班纳和、柏拉、班玛等，蔷薇科委陵菜属落叶灌木，广泛分布于我国的四川、内蒙古、新疆、青海、甘肃、山西等地，是一种传统的中藏药。
《晶珠本草》记载：班纳合治疗妇女乳房胀痛。《蓝琉璃》记载：班纳合茎红色，花黄色，叶小，烧灰，治疗妇女乳房胀痛，消腹水。金露梅根茎、叶、花和枝都有非常强的药理活性，叶和花可入药，微苦，性寒，具有清热解暑、健胃、健脾、健脑清心、治疗女性月经不调、固齿等功能，根茎提取物具有增强的免疫调节特性，枝的提取物可食用，还能作为食品添加剂，降低血液中的胆固醇和血糖含量。民间用金露梅的叶子代茶饮用，可以有效的预防心脑血管疾病。《中药大辞典》中记载小叶金老梅功能主治：利尿消水，治寒湿脚气，痒疹，乳腺炎。
委陵菜属的多种植物均为药用植物，该属植物的主要成分有黄酮类、三萜类、鞣质类化合物等，具有抗炎，抗糖尿病，抗肿瘤，抗氧化，抗菌抗病毒等多种药理作用。
目前，对小叶金露梅的现代药理学研究较少，急需提供一种具有抗肿瘤活性的提取物及制备方法，以及其抗肿瘤活性的应用。
技术实现要素：
本发明所用药材为小叶金露梅（potentillaparvifoliafisch.）的干燥地上部分，于2014年8月采于青海省海北州，植物标本保存于青藏高原生物标本馆，标本编号为252558。
本发明的一个目的是提供一种小叶金露梅提取物的制备方法。
本发明提供的小叶金露梅提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将小叶金露梅，干燥，剪碎，得到小叶金露梅粉；
（2）将小叶金露梅粉置于亚临界提取柱（5l）中，压力泵将超纯水输送进预热器中预热，达到设定温度后，泵入提取柱中，系统压力到达设定值后，提取柱注满水时开始计时，萃取一定时间后提取液经冷却器流至收集釜收集，得到小叶金露梅亚临界萃取液；
（3）将亚临界萃取液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜处理，依次得微滤膜透过液、超滤膜透过液和纳滤膜截留组分；
（4）将纳滤膜截留组分冷冻干燥，得到一种小叶金露梅提取物。
步骤（1）中，小叶金露梅粉粒径长0.4~1.0cm。
步骤（2）中，所述亚临界萃取剂为水，温度为140℃~160℃，萃取压力4~6mpa，提取时间为10min~40min，料液比1:10g/ml~1:30g/ml，提取的次数为2~4次。
步骤（3）中，微滤膜处理采用的微滤膜孔径为0.02μm~8.00μm，处理的温度20℃，压力为0.1~0.3mpa，流速为10~30kg/h，得到微滤膜透过液。
步骤（3）中，超滤膜处理采用的超滤膜孔径为0.003μm~0.090μm，温度20℃，压力0.1~0.3mpa，流速为10~30kg/h，得到超滤膜透过液。
步骤（3）中，纳滤膜处理采用的纳滤膜孔径为0.001μm~0.002μm，温度20℃，压力0.7~0.9mpa，流速30~50kg/h，截留分子量为100~2000的小叶金露梅萃取组分，得到纳滤膜截留组分。
步骤（4）中，所述冷冻干燥程序为-60℃~-80℃预冻1~3h，-60℃~-80℃冷冻干燥12~36h，真空度5~10pa。
步骤（4）中，所述的小叶金露梅提取物中，萜类化合物含量5.42%~17.61%，黄酮类化合物含量7.35%~30.82%。
本发明的另一个目的是提供一种抗肿瘤活性剂。
本发明提供的抗肿瘤活性剂，其活性成分为上述的小叶金露梅提取物。
本发明的实验证明，本发明与现有技术相比具有以下优点：
（1）本发明从小叶金露梅中可制取得到一种可以抑制人神经细胞瘤细胞sh-sy5y的提取物，是一种纯天然的、植物源的和无依赖性的肿瘤抑制剂；
（2）本发明得到的提取物可以显著地抑制人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y的增殖，其活性是广谱性肿瘤抑制剂药物5-fluorourail的0.074倍，ic50分别为10.89μg/ml和0.14μg/ml，显示出较强的抑制sh-sy5y增殖的能力；
（3）本发明提供小叶金露梅提取物的制备工艺基本实现闭环的机械化制备流程，大大节约了提取物制备时间，提高了提取物制备效率。
总之，本发明不仅丰富了纯天然抗肿瘤活性剂的来源，也开拓了具有地域特色和资源优势的小叶金露梅植物新的功效和应用价值。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
具体实施方式
亚临界萃取设备，购自常州市特威电气自动化系统有限公司；微滤膜~超滤膜~纳滤膜系统，购自合肥禹王膜工程技术有限公司；人神经细胞瘤细胞sh-sy5y，购自上海细胞库。
实施例1：小叶金露梅提取物的制备方法及其抗肿瘤活性应用。
一、制备方法
（1）将小叶金露梅，干燥，粉碎，得到小叶金露梅粉，粒径长1.0cm；
（2）将小叶金露梅粉1.0kg置于亚临界提取柱中进行萃取，萃取剂为水，温度为140℃，萃取压力4mpa，提取时间为10min，料液比1:10g/ml，提取的次数为2次；
（3）将亚临界萃取液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜处理。其中，微滤膜孔径为8.00μm，温度20℃，压力为0.3mpa，流速为10kg/h，去除悬浮物、细菌和大分子量胶体等杂质，得到微滤膜透过液；超滤膜孔径为0.090μm，温度20℃，压力0.3mpa，流速为10kg/h，去除胶体、蛋白质、微生物和大分子有机物，得到超滤膜透过液；纳滤膜孔径为0.002μm，温度20℃，压力0.9mpa，流速30kg/h，截留分子量为100~2000的小叶金露梅萃取组分，得到纳滤膜截留组分；
（4）将纳滤膜截留组分冷冻干燥，冷冻干燥条件为-60℃预冻1h，-60℃冷冻干燥12h，真空度5pa，得到一种小叶金露梅提取物a65.08g。
二、小叶金露梅的检测
（1）小叶金露梅提取物中萜类化合物含量的测定：参考杨满琴等2008年4月发表于《安徽中医学院学报》第27卷第2期文章“紫外分光光度法测定豨莶草中总萜类成分含量”记录的方法，对小叶金露梅中萜类化合物含量进行测定；
（2）小叶金露梅提取物中黄酮类化合物含量：参考中华人民共和国农业行业标准nyt1295-2007《荞麦及其制品中总黄酮含量的测定》第1页~第3页记录的方法，对小叶金露梅中黄酮类化合物含量进行测定；
（3）小叶金露梅提取物对人神经细胞瘤细胞sh-sy5y的抑制作用：利用mtt法对小叶金露梅提取物进行抑制人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y增殖活性测试。小叶金露梅提取物的浓度分别为0.00、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg/ml，以每孔104个细胞接种于96孔板中，每孔体积200μl，将培养板放入培养箱中，在37℃、5%co2的饱和湿度条件下培养12h后，加入受试样品，受试样品作用24h后，每孔加入10μl5mg/ml的mtt溶液，于37℃、5%co2及饱和湿度条件下孵育4h，弃去培养基终止培养，每孔加入100μldmso，振荡10min，使甲瓒充分溶解。用多功能酶标仪于490nm处测定吸光值，计算小叶金露梅提取物对sh-sy5y的半抑制率ic50，并以抗肿瘤药物5-fluorourail为阳性对照进行比较。
经检测，本发明方法制备得到的小叶金露梅提取物中萜类化合物含量5.42%，黄酮类化合物含量17.35%，sh-sy5y的半抑制率ic50为10.89μg/ml。此外，阳性对照药物5-fluorourail的sh-sy5y半抑制率ic50为0.14μg/ml。
实施例2：小叶金露梅提取物的制备方法及其抗肿瘤活性应用。
一、制备方法
（1）将小叶金露梅，干燥，粉碎，得到小叶金露梅粉，粒径长0.4cm；
（2）将小叶金露梅粉2.0kg置于亚临界提取柱中进行萃取，萃取剂为水，温度为160℃，萃取压力6mpa，提取时间为40min，料液比1:30g/ml，提取的次数为4次；
（3）将亚临界萃取液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜处理。其中，微滤膜孔径为0.02μm，温度20℃，压力为0.1mpa，流速为30kg/h，去除悬浮物、细菌和大分子量胶体等杂质，得到微滤膜透过液；超滤膜孔径为0.003μm，温度20℃，压力0.1mpa，流速为30kg/h，去除胶体、蛋白质、微生物和大分子有机物，得到超滤膜透过液；纳滤膜孔径为0.001μm，温度20℃，压力0.7mpa，流速50kg/h，截留分子量为100~2000的小叶金露梅萃取组分，得到纳滤膜截留组分；
（4）将纳滤膜截留组分冷冻干燥，冷冻干燥条件为-80℃预冻3h，-80℃冷冻干燥36h，真空度10pa，得到一种小叶金露梅提取物b174.25g。
二、小叶金露梅的检测
（1）小叶金露梅提取物中萜类化合物含量：与实施例1的二的（1）相同；
（2）小叶金露梅提取物中黄酮类化合物含量：与实施例1的二的（2）相同；
（3）小叶金露梅提取物对人神经细胞瘤细胞sh-sy5y的抑制作用：与实施例1的二的（3）相同。
经检测，本发明方法制备得到的小叶金露梅提取物中萜类化合物含量14.61%，黄酮类化合物含量30.82%，sh-sy5y的半抑制率ic50为6.24μg/ml。
实施例3：小叶金露梅提取物的制备方法及其抗肿瘤活性应用。
一、制备方法
（1）将小叶金露梅，干燥，粉碎，得到小叶金露梅粉，粒径长0.7cm；
（2）将小叶金露梅粉4.0kg置于亚临界提取柱中进行萃取，萃取剂为水，温度为150℃，萃取压力5mpa，提取时间为25min，料液比1:20g/ml，提取的次数为3次；
（3）将亚临界萃取液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜处理。其中，微滤膜孔径为1.00μm，温度20℃，压力为0.2mpa，流速为20kg/h，去除悬浮物、细菌和大分子量胶体等杂质，得到微滤膜透过液；超滤膜孔径为0.030μm，温度20℃，压力0.2mpa，流速为20kg/h，去除胶体、蛋白质、微生物和大分子有机物，得到超滤膜透过液；纳滤膜孔径为0.002μm，温度20℃，压力0.8mpa，流速40kg/h，截留分子量为100~2000的小叶金露梅萃取组分，得到纳滤膜截留组分；
（4）将纳滤膜截留组分冷冻干燥，冷冻干燥条件为-70℃预冻2h，-70℃冷冻干燥24h，真空度7pa，得到一种小叶金露梅提取物c362.74g。
二、小叶金露梅提取物的检测
（1）小叶金露梅提取物中萜类化合物含量：与实施例1的二的（1）相同；
（2）小叶金露梅提取物中黄酮类化合物含量：与实施例1的二的（2）相同；
（3）小叶金露梅提取物对人神经细胞瘤细胞sh-sy5y的抑制作用：与实施例1的二的（3）相同。
经检测，本发明方法制备得到的小叶金露梅提取物中萜类化合物含量9.03%，黄酮类化合物含量24.61%，sh-sy5y的半抑制率ic50为8.51μg/ml。
对比例1：小叶金露梅提取物的制备方法及其抗肿瘤活性应用。
一、制备方法
（1）将小叶金露梅，干燥，粉碎，得到小叶金露梅粉，粒径长0.7cm；
（2）将小叶金露梅粉1.0kg置于亚临界提取柱中进行萃取，萃取剂为水，温度为130℃，萃取压力3mpa，提取时间为25min，料液比1:20g/ml，提取的次数为3次；
（3）将亚临界萃取液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜处理。其中，微滤膜孔径为1.00μm，温度20℃，压力为0.2mpa，流速为20kg/h，去除悬浮物、细菌和大分子量胶体等杂质，得到微滤膜透过液；超滤膜孔径为0.030μm，温度20℃，压力0.2mpa，流速为20kg/h，去除胶体、蛋白质、微生物和大分子有机物，得到超滤膜透过液；纳滤膜孔径为0.002μm，温度20℃，压力0.9mpa，流速40kg/h，截留分子量为100~2000的小叶金露梅萃取组分，得到纳滤膜截留组分；
（4）将纳滤膜截留组分冷冻干燥，冷冻干燥条件为-70℃预冻2h，-70℃冷冻干燥24h，真空度7pa，得到一种小叶金露梅提取物d50.64g。
二、小叶金露梅提取物的检测
（1）小叶金露梅提取物中萜类化合物含量：与实施例1的二的（1）相同；
（2）小叶金露梅提取物中黄酮类化合物含量：与实施例1的二的（2）相同；
（3）小叶金露梅提取物对人神经细胞瘤细胞sh-sy5y的抑制作用：与实施例1的二的（3）相同。
经检测，本发明方法制备得到的小叶金露梅提取物中萜类化合物含量1.08%，黄酮类化合物含量5.24%，sh-sy5y的半抑制率ic50为105.34μg/ml。
对比例2：小叶金露梅提取物的制备方法及其抗肿瘤活性应用。
一、制备方法
（1）将小叶金露梅，干燥，粉碎，得到小叶金露梅粉，粒径长0.4cm；
（2）将小叶金露梅粉2.0kg置于亚临界提取柱中进行萃取，萃取剂为水，温度为170℃，萃取压力7mpa，提取时间为25min，料液比1:20g/ml，提取的次数为3次；
（3）将亚临界萃取液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜处理。其中，微滤膜孔径为0.02μm，温度20℃，压力为0.1mpa，流速为30kg/h，去除悬浮物、细菌和大分子量胶体等杂质，得到微滤膜透过液；超滤膜孔径为0.003μm，温度20℃，压力0.1mpa，流速为30kg/h，去除胶体、蛋白质、微生物和大分子有机物，得到超滤膜透过液；纳滤膜孔径为0.001μm，温度20℃，压力0.7mpa，流速50kg/h，截留分子量为100~2000的小叶金露梅萃取组分，得到纳滤膜截留组分；
（4）将纳滤膜截留组分冷冻干燥，冷冻干燥条件为-70℃预冻2h，-70℃冷冻干燥24h，真空度7pa，得到一种小叶金露梅提取物e195.01g。
二、小叶金露梅提取物的检测
（1）小叶金露梅提取物中萜类化合物含量：与实施例1的二的（1）相同；
（2）小叶金露梅提取物中黄酮类化合物含量：与实施例1的二的（2）相同
（3）小叶金露梅提取物对人神经细胞瘤细胞sh-sy5y的抑制作用：与实施例1的二的（3）相同。
经检测，本发明方法制备得到的小叶金露梅提取物中萜类化合物含量2.65%，黄酮类化合物含量7.03%，sh-sy5y的半抑制率ic50为80.52μg/ml。
综上可知，本发明方法不仅可以有效制备一种小叶金露梅提取物，而且制备工艺非常高效，工艺步骤机械化程度高，制备方法成熟可靠，尤其是该发明制得小叶金露梅提取物具有显著地抑制人神经细胞瘤细胞sh-sy5y细胞增殖的活性，是一种极具应用前景的抗肿瘤剂。