一种具有抗肝癌作用的骨髓间充质干细胞来源的外泌体及其药物制剂的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及基于外泌体的治疗药物，具体涉及一种具有抗肝癌作用的骨髓间充质干细胞来源的外泌体及其药物制剂。

背景技术：

外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小均一，直径为40-100nm，密度1.10-1.18g/ml的囊泡样小体。1996年有学者发现b细胞可以通过释放能表达主要组织相容性复合体(mhc)分子的外泌体促进t细胞增殖和抑制肿瘤生长。外泌体包含多种蛋白质和遗传物质，表明蛋白质等大分子物质可以装载到外泌体上。外泌体可广泛分布于不同体液，在体内有较长的半衰期。此外，外泌体可以穿透细胞膜释放mrna到靶细胞，使受体细胞翻译转染的mrna。目前，外泌体已经开始应用于临床治疗。

肝癌发生于肝脏，可分为原发性肝癌及转移性肝癌。在原发性肝癌中，肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)最为多见(常简称为肝癌)，约占95％，其次是胆管细胞癌(cholangiocarcinoma)。肝癌是全球第五常见的癌症，亦是我国癌症中的第二号杀手，全球50％以上的肝癌发生在我国。罹患肝癌的高危险群以35-65岁的中年人为主，尤其以男性患者较多，比率是女性的2-4倍。高达80％-90％的肝癌患者同时有肝硬化。慢性乙、丙型肝炎病毒是最主要的病因(约80％)，其次是酒精、药物、摄食含有黄曲毒素的食物等。肝癌是高侵袭性的恶性肿瘤，早期症状不明显，导致大多数患者就诊较晚。

肝癌的治疗包括外科手术治疗、放射治疗和药物化疗。由于肝癌对放射治疗敏感性差，而常规化疗药物(如阿霉素、氟尿嘧啶、顺铂、干扰素等)的治疗不仅毒副作用严重，而且通常也不能明显缓解疾病或延长生命，因此目前肝癌的治疗仍以手术切除为主。但由于肝癌发病隐匿，早期诊断较困难，肿瘤细胞生长迅速，能进行手术治疗的患者不到30％，而且即使行手术以后复发率也很高，使得肝癌患者的预后极差。除可切除的小型肝癌患者的5年存活率达到80-90％外，不能手术肝癌患者自症状发作后的平均存活时间只有3-4个月。

目前，肝癌治疗药物远未满足临床需求，同时这一市场也蕴含着巨大的潜在价值。目前，小分子酪氨酸激酶抑制剂凭借其出色的疗效和安全性成为中国肝癌药物市场的主导药物。由于全球有超过50％的肝癌发生在中国，因此，中国的抗肝癌药物蕴藏着很大的市场潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗肝癌作用的骨髓间充质干细胞来源的外泌体及其药物制剂，以用于制备治疗肝癌的药物。

实现本发明上述目的技术方案如下：

一种具有抗肝癌作用的外泌体，由骨髓间充质干细胞来源的外泌体经化合物负载制备而成，所述化合物为具有如下通式结构的吡啶并咪唑类有机化合物；

其中，r2为-och2ch3或-oh；

r1为-ch2-或-ch(ch3)2-或-ch2ch2ch2-；

所述负载指将所述化合物导入外泌体内。

优选地，所述化合物选自下列化合物：

优选地，通过电转染法或脂质体转染法将化合物导入外泌体内制备化合物负载的外泌体。

上述外泌体在制备治疗肝癌的药物中的应用。

一种药物制剂，含有上述外泌体和一种或多种药学上可以接受的载体或赋形剂，通过药学上可以接受的制剂工艺制备而成。

本发明的突出优点：

实验结果表明，骨髓间充质干细胞来源的外泌体体内、体外均可以抑制肝癌细胞的增殖，但是抑制作用较弱，但骨髓间充质干细胞来源的外泌体经化合物cm1-6负载后，体内、体外对肝癌细胞增殖的抑制作用则显著提高，药效优异，可以用于制备治疗肝癌的药物。

附图说明

图1为各组肿瘤细胞增殖抑制率(％)，其中l代表低浓度，h代表高浓度；

图2为cm1-6负载外泌体组和对照组终末移植瘤大小比较；

图3为cm1-6负载外泌体的体内抑瘤率(％)。

具体实施方式

下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。

一、实验材料

编号cm1-6的吡啶并咪唑类有机化合物均为已知化合物，由本公司合成人员参照文献和有机合成常规方法合成，并经质谱和核磁确证。

rpmi1640培养基、高糖dmem培养基、α-mem培养基和新生牛血清购自gibco公司；人肝癌smmc-7721由南京医科大学提供。balb/c裸鼠，雄性，4-6周龄，体质量18-22g，由南京大学动物实验中心提供。外泌体快速提取试剂(exoquick)购自sbi公司。

二、实验方法

1、人骨髓间充质干细胞(mscs)分离和鉴定

于取得健康捐献者本人的同意并签订知情同意书之后，行骨髓穿刺术。抽取10ml的骨髓液，并立即将抽取到的骨髓液注射到含有肝素钠的抗凝管中。利用密度梯度离心方法联合全骨髓培养的方法以分离提取人骨髓mscs。整个实验过程均在预先经过紫外线消毒的超净工作台上完成。首先，含10％的新鲜fbs的高糖dmem培养基按照1：1的体积比例来稀释骨髓液，轻轻混匀。在50ml离心管中加入20ml的ficoll分离液，将稀释后的骨髓液沿着离心管管壁缓缓地加入到ficoll分离液之上。再以2000rpm/min的转速离心20min。离心之后小心拿出离心管，可以发现离心管中出现了分层。从上往下分为4层：第1层为血浆层，第2层为单个细胞层，第3层为分离液层，第4层为红细胞层。轻轻将第2层白色薄膜细胞吸到15ml离心管，加入5ml的pbs缓沖液洗涤细胞，以1000rpm/min离心10min，如此重复2次。弃去上清之后，再加入含有10％新鲜fbs的α-mem培养液来重悬细胞5ml，再将细胞接种到75mm²细胞培养瓶里，放置于37℃、5％co2细胞培养箱里培养24h。24h后，弃掉细胞培养瓶内所有培养液，用pbs液洗涤，然后加入含10％新鲜fbs的α-mem培养液。经过3次洗涤换液之后，于显微镜镜下，可见到贴壁生长、形态均一、呈纤维细胞样的人骨髓mscs。

2、外泌体(exosomes)的分离和鉴定

收集第4-6代人骨髓mscs培养上清液，按照exoquick试剂盒说明书进行外泌体的提取。具体的步骤如下：将培养上清转移到高速离心管中，在4℃下离心去掉细胞碎片。取上清移到新的高速离心管中，按照细胞上清液：试剂＝2:1的比例加入试剂，使用涡旋仪充分混匀之后，放畳在4℃冰箱中孵育过夜。次日，离心弃去上清，pbs缓冲液重悬即得exosomes悬液，置-20℃冰箱保存。westernblot证实上述exosomes表达外泌体特异标志cd9、cd63和cd81。

3、外泌体负载方法

将编号cm1-6的吡啶并咪唑类有机化合物分别与等质量的外泌体混合，通过电转的方法制备化合物负载外泌体。电击条件为电压420v，电容150μf，于4mm电转杯进行电转。随后用倒置离心超滤膜过滤，去除未转染进外泌体内的游离化合物。

也可以通过脂质体转染法将化合物导入外泌体实现对外泌体的负载。

4、外泌体对人体肝癌细胞smmc-7721的抑制活性(体外活性)

在细胞对数生长期，将人肝癌smmc-7721细胞悬液调成5×10⁷cells/l接种于96孔培养板，每孔100μl，即每孔细胞约为5000个，置37℃、5％co2培养箱12h后按如下分组方法进行加药，每孔加入药物后终体积为150μl/well(不足体积以不含血清rpmi1640培养液补齐)，每组设3个复孔，置37℃、5％co2培养48h后，每孔加入10μlcck-8试剂，继续培养1h，酶标仪检测吸光度值a(测定波长450nm，参比波长655nm)，计算各组增殖抑制率，该实验重复3次。增殖抑制率(％)＝(1-a实验组/a对照组)×100％。

分组方法如下，其中：纯外泌体组和负载外泌体组的浓度均以纯外泌体的质量和每孔终体积计；对照组为不含血清的rpmi1640培养液。

纯外泌体组：低浓度5μg/ml；高浓度20μg/ml；

cm1-6化合物组：低浓度5μg/ml；高浓度20μg/ml；

cm1-6负载外泌体组：低浓度5μg/ml；高浓度20μg/ml。

5、外泌体对裸鼠肝癌移植瘤的抑制活性(体内活性)

将实验裸鼠于独立通气笼盒spf条件下适应性驯养1周。1周后在裸鼠腋窝皮下接种0.1ml的smmc-7721细胞悬液(含5×10⁶个对数生长期的细胞)。当肿瘤体积生长至100mm³左右(约12d)的时候开始分组腹腔给药。分组如下，每组各8只均腹腔注射给药，连用14d。

对照组：生理盐水+1％dmso；

cm1-6负载外泌体组：10mg/(kg·d)。

抑瘤率(％)＝(1-负载外泌体组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)×100％。

6、统计学处理

数据以均数±标准差表示，spss13.0统计软件处理数据，采用完全随机设计的单因素方差分析分析组间差异的显着性，以p＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、外泌体对肝癌细胞的体外抑制活性

与对照组比，cm1-6化合物低浓度和高浓度组的细胞增殖均未受明显抑制(抑制率≤4.8％，p＞0.05)，证明编号cm1-6的化合物本身对肝癌细胞无明显抑制作用；与对照组比，纯外泌体组低浓度和高浓度对smmc-7721细胞增殖具有一定的抑制作用，但抑制率较低；与对照组和纯外泌体组比，cm1-6负载外泌体组低浓度和高浓度对smmc-7721细胞增殖具有显著的抑制作用(p＜0.05)。各组的肿瘤细胞增殖抑制率如图1所示。

2、外泌体对肝癌移植瘤的体内抑制活性

裸鼠皮下接种人肝癌细胞smmc-7721第5天后，在种植部位皮下触及小结节，第12天后肿瘤结节增长至约100mm³大小，致瘤成功率为100％。外泌体干预过程中，各组移植瘤裸鼠没有出现药物引起的死亡，干预前各组移植瘤裸鼠体质量差异无统计学意义，干预后各组移植瘤裸鼠体质量差异亦无统计学意义。与对照组比，cm1-6负载外泌体组肿瘤生长速度显著降低，肿瘤体积显著减小(p＜0.05)。给药结束第二天处死裸鼠，取出移植瘤测定终末体积，图2和表1为cm1-6负载外泌体组和对照组终末移植瘤大小，图3为各组抑瘤率(％)。

表1cm1-6负载外泌体组和对照组终末移植瘤体积(cm³)

实验结果表明，骨髓间充质干细胞来源的外泌体体内、体外均可以抑制肝癌细胞的增殖，但是抑制作用较弱，但骨髓间充质干细胞来源的外泌体经化合物cm1-6负载后，体内、体外对肝癌细胞增殖的抑制作用则显著提高，药效优异，可以用于制备治疗肝癌的药物。

上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。