本发明涉及一种治疗抑郁失眠疾病的中药有效部位及其制备方法与应用，具体的说，是涉及复方中药有效部位及其制备方法与应用。
背景技术
抑郁症导致的失眠是一种最常见的睡眠障碍。不寐与郁证均属于情志疾病范畴，均与肝郁滞不畅关系密切。中国睡眠研究会确定2015年的睡眠日主题为“健康心理，良好睡眠”。据世界卫生组织调查，世界超过三分之一的人口存在睡眠障碍，其中中国各种睡眠障碍人数高达38.2％。其中心理因素是造成睡眠问题的主要因素。现代医学研究证明：睡眠障碍与抑郁的产生密切相关，50.90％抑郁症患者常出现失眠，而失眠和抑郁又可导致心血管疾病和糖尿病。随着社会竞争加剧、生活节奏加快，失眠、抑郁症的发病率正急剧上升。目前治疗抑郁症和失眠主要以合成药为主，虽然这些药物治疗效果非常理想，但大部分抗抑郁西药都存在抗抑郁谱窄、毒副作用大的特点，例如maoi可能造成患者出现中毒性肝损伤及高血压危象，tca由于其抗胆碱作用明显，可能会造成使用者便秘、尿潴留及视力模糊等情况，甚至会造成患者体位性低血压、心律失常以及心肌梗死等等严重的不良反应。而镇静催眠药存在头晕、困倦等后遗作用，对呼吸有抑制作用，久用可产生耐受性、成瘾性等不良反应，使其临床应用受到限制。因此寻找新型低毒、有效、兼具治疗抑郁与失眠共病的药物非常有必要，具有巨大的市场价值。
由于抑郁症和失眠的发病机制复杂，复方中药治疗抑郁症和失眠是通过多途径、多靶点、多层次来实现的，在治疗复杂疾病时具有独特的优势。不仅疗效好，而且副作用小、安全可靠，适合长期服用。由酸枣仁、合欢皮、白芍、柏子仁(配方为24份、13份、6份、10份)四味中药构成的中药小复方酸枣仁合欢方(简称shf)，具有抗抑郁作用，研究表明总萜类、黄酮、油脂是其主要化学成分。本研究经分离纯化去除无效组分黄酮类成分及油脂得到有效部位，具有明显的抗抑郁失眠作用。
技术实现要素：
本发明一个目的是提供一种中药有效部位的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种高纯度的中药有效部位。
本发明的第三个目的是提供一种中药有效部位在治疗抑郁失眠疾病药物中的应用。
本发明是通过如下技术方案予以实施。
一种复方中药有效部位，可用下述方法制得，该方法包括如下步骤：
(1)将四味药材粉碎，加入药材6～10质量倍体积的百分浓度为50～90％乙醇加热回流二次，每次1～3h，过滤，合并滤液，减压浓缩至流浸膏；
(2)将步骤(1)所得流浸膏以水溶解，通过大孔吸附树脂，分别以3～7bv0.2～5％碱溶液、2～4bv蒸馏水、2～4bv50-90％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，即得shf有效部位。
所述步骤(2)中所述大孔吸附树脂柱可选ab-8、nka-9或d-101型中一种。
优选地，所述大孔吸附树脂柱为ab-8。
所述步骤(2)中所述0.2～5％碱溶液可选naoh、koh、ca(oh)2。
优选地，所述的碱溶液为1％naoh溶液。
所述步骤(2)中所述50～90％乙醇溶液优选为70％乙醇。
另外，本发明提供了一种由上述方法制备的治疗抑郁症兼具睡眠障碍疾病的中药有效部位，其特征在于其活性成分包含shf中四种药材中提取的5个主要活性成分，即芍药内酯苷、(-)-丁香树脂酚-4-o-β-d-呋喃芹糖基-(1→2)-β-d-吡喃葡萄糖苷(简称丁香树脂酚苷)、白桦酯酸、白桦酯醇、胡萝卜苷等成分。
本发明提供了所述一种中药有效部位在治疗抑郁症、失眠疾病药物中的应用。
本发明提供了所述一种中药有效部位可以自身的形式施用，也可以加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
本发明最后提供了一种中药有效部位制备的制剂，该制剂是由本发明shf有效部位和至少一种药学上可接受的辅料制备成液体制剂、固体和半固体制剂、气体制剂。其中，所述液体制剂包括口服液、混悬液、糖浆、注射液、药酒、酊剂，所述的固体和半固体制剂包括片剂、丸剂、膏剂、丹剂、散剂、颗粒剂、栓剂、粉剂、乳剂、咀嚼剂和胶囊剂，所述的气体制剂包括气雾剂和吸入剂。
本发明的有益效果为：1.本发明与常规的萃取、碱提酸沉的分离方法比较，制备的萜类含量显著增加，外观及溶解性能显著改善。本发明工艺操作简便，效率高，生产成本低，适合工业化生产。
2.复方中药有效部位具有显著的抗抑郁及镇静催眠活性，药效强于原复方中药。可以同时用于预防和治疗抑郁症、失眠症，具有良好的经济效益和应用前景。
附图说明
图1为混合标准品(a)和有效部位(b)的hplc图
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。
实施例1
shf有效部位的制备方法
1.shf有效部位的制备方法
将四味药材按重量份称取(酸枣仁24g、合欢皮13g、白芍6g、柏子仁10g)，粉碎、分别以10倍量、8倍量70％乙醇加热回流2h、1h，过滤，合并滤液；滤液减压浓缩至流浸膏，即为复方shf，备用；流浸膏以水溶解，通过处理过的ab-8大孔吸附树脂，分别以蒸馏水溶解，通过处理过的ab-8大孔吸附树脂，分别以7bv1％naoh溶液、4bv蒸馏水、5bv70％乙醇溶液洗脱。收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，即得shf有效部位，其中总萜类的百分含量为51.80％(重量/重量)。
2.hplc分析
精密称取shf有效部位干燥粉末0.0240g，以甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容。超声15min，经0.45μm有机系微孔滤头过滤，取滤液。本实验的色谱条件为：采用梯度洗脱，流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸水，流速：1ml.min-1，运行时间：60min。色谱柱：agilenttc-c18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：30℃，进样量：20μl；检测波长：204nm。线性梯度洗脱程序为：0～14.5min，14％～20％a；14.5～32min，20％a；32～39.9min，20％～29％a；39.9～42min，29％～90％a；42～57min，90～100％a；57～60min，100％a。
通过与标准品比较其保留时间确定色谱峰，(1)芍药内酯苷(albiflorin)，(2)(-)-丁香树脂酚-4-o-β-d-呋喃芹糖基-(1→2)-β-d-吡喃葡萄糖苷((-)-syringaresnol-4-o-β-d-apiofuranosy-(1→2)-β-d-glucopyranoside)，(3)白桦酯酸(betulinicacid)，(4)白桦酯醇(betulin)，(5)胡萝卜苷(daucosterol)(如图1)。
按照供试品溶液制备方法，取6批shf有效部位样品，每份0.0240g，制备供试品溶液，在上文所述色谱条件下进样，计算shf样品中芍药内酯苷、(-)-丁香树脂酚-4-o-β-d-呋喃芹糖基-(1→2)-β-d-吡喃葡萄糖苷(简称丁香树脂酚苷)、白桦酯酸、白桦酯醇、胡萝卜苷的质量分数，结果见表1。
表1shf有效部位5个成分含量测定(n＝3)
实施例2
shf有效部位治疗抑郁失眠共病的实验研究
1.实验材料
1.1实验动物：雄性icr小鼠70只(清洁级，体重20±2g)中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，合格证号：scxk津2005-0001。实验前在实验室饲养1周，适应环境。室温22±2℃，相对湿度65％～70％。日光照12h，自由饮食、摄水。
1.2药物与试剂：shf提取物、shf有效部位提取物(本实验室自制)；盐酸文拉法辛缓释胶囊(怡诺思，爱尔兰惠氏药厂，批号：0902052)。
1.3实验仪器：bp211d十万分之一分析天平(上海君达仪器厂)；r204型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；shb-iiia循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)
2.实验方法
2.1实验分组及给药方案
除正常组外，其余各组小鼠均按“2.2”方法造模；从造模的第一天开始每天早上8：00-9：00灌胃给药，一天一次，持续23天，给药方案见表2。
表2实验动物分组及给药方案
2.2慢性应激抑郁失眠小鼠模型的建立方法
剥夺小鼠睡眠48h，方法为小平台水环境法，具体操作如下：鼠笼内设立直径为3cm，高2cm的平台，在平台周边注满水，水温保持在(20℃)左右，水面距平台面约0.5cm，小鼠在平台上可自行饮食饮水，如果睡眠，会因为肌张力松弛而落入水中。大平台对照组，大平台直径为10cm，使小鼠可以睡眠，其余条件同上[13]。再以慢性不可预见性的温和刺激，在21d内按随机安排的方法应用10种应激因素：超声30s、冷水游泳(10℃)5min、热水游泳(45℃)5min、夹尾1min、潮湿饲养12h、禁食12h、禁水12h、无垫料饲养12h、昼夜颠倒24h、倾斜饲养12h。每天给予两种刺激，使小鼠不可预料刺激的发生，以避免产生适应，平均每种刺激给予4次。每次应激实验均在远离饲养间的另一实验室进行[14]。
(1)超声：超声波刺激小鼠30s。
(2)潮湿饲养：将水加入垫料使其潮湿，让小鼠在潮湿的环境中生存12h。
(3)禁食：12h断食。
(4)禁水：12h断水。
(5)倾斜饲养：将鼠笼倾斜45°饲养小鼠12h。
(6)夹尾：将小鼠放入固定笼中，用止血钳夹住距尾根1cm处，用力不要过大，使小鼠发出哀叫声即可，持续1min。
(7)无垫料饲养：在无垫料的鼠笼中饲养小鼠，每次12h。
(8)昼夜颠倒：于早7：00时将大鼠的笼子盖上黑色的塑料袋，不开灯使动物处于黑暗状态；至晚19：00时将笼子上的黑色塑料袋去掉，置于开灯的房间，使动物处于光照状态，直至次日早7：00时。
(9)冷水游泳：将动物放在盛有10℃的水桶中(水深5cm)，小鼠的足后尖刚好能触及桶底，5min后将小鼠取出放回笼中。
(10)热水游泳：将动物放在盛有45℃的水桶中(水深5cm)，小鼠的足后尖刚好能触及桶底，5min后将小鼠取出放回笼中。
2.3观测指标及方法
(1)体重
分别于第1、7、14天监测体重。
(2)自主活动测定
用自主活动测试仪对小鼠进行自主活动测定，实验进行6min，记录后5min内小鼠自主活动的数值。
(3)悬尾实验(tst)
将小鼠尾端1cm的部位贴在一水平木板上，木板离地1m左右，使动物呈倒挂状。悬挂两侧用板隔开动物视线，动物为克服不正常体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”显示“失望”状态。实验进行6min，记录后4min内的不动时间，并同时观察小鼠挣扎幅度[17]。
(4)强迫游泳实验(fst)
将小鼠单独放入一直径18cm，高30cm的透明玻璃缸中。玻璃缸置于安静的房间，缸中水深10cm以上，水温45℃左右。实验进行6min。实验开始时小鼠试图挣扎逃跑，但感觉无望后即停止挣扎，仅将头露出水面，肢体漂浮维持一种不动状态。记录后4min内小鼠的不动时间，用小鼠的漂浮不动时间作为判断抑郁严重程度的指标。每次实验后冲洗水缸，换水，避免影响下一只动物测试。
(5)空场实验
空场实验由一个圆形的基座组成(直径80cm，高20cm)，基座底部半径14，28，42cm处有3个同心圆，并被分为42个单位，不以墙壁隔开。将小鼠单独放入圆心区域使其自由探索。记录其3min中内穿越，站立和修饰的次数。每只小鼠实验后应用清洁剂将装置清洁干净。每只小鼠进行一次实验。
(6)与戊巴比妥钠协同作用的影响
第14天灌胃0.5h后腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠，剂量为28mg/kg。记录各组小鼠出现睡眠的只数。第15天灌胃0.5h后腹腔注射阈上剂量戊巴比妥钠，剂量为38mg/kg。注射后开始计时，记录睡眠潜伏期及睡眠时间。以翻正反射消失时为睡眠起始时间，翻正反射恢复为睡眠结束时间。腹腔注射后到睡眠起始这段时间为睡眠潜伏期，潜伏期超过15min，按15min记录。
2.4统计学分析
数据以均值±标准差的形式表示。采用单因素方差分析法进行统计学分析。数据由spssv16.0软件处理，p＜0.05或p＜0.01具有显着性差异。
3实验结果
3.1shf及其有效部位对小鼠体重的影响
各组小鼠在第1、7、14天的体重结果表明，各组小鼠在给药期间体重均无显著性差异，说明药物对小鼠体质无明显影响。
3.2shf及其有效部位对小鼠tst不动时间的影响
小鼠在悬尾模型中出现的不动状态反映了动物的绝望行为，结果见表4。对各组小鼠给药后tst不动时间的分析表明，shf及有效部位各剂量组和氟西汀组与模型对照组比较均能显着缩短小鼠不动时间，表现出抗抑郁活性，具有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)。
表4shf及有效部位对小鼠tst不动时间的影响(
注：**与模型对照组比较p＜0.01
3.3shf及有效部位对fst不动时间的影响
对各组小鼠fst不动时间分析表明，与模型组比较，各给药组均能显著缩短小鼠fst不动时间，且有显著性差异(p＜0.01)。说明shf及其有效部位能对抗小鼠因强迫游泳造成的抑郁症状态，且与氟西汀的作用相当，结果见表5。
表5shf及有效部位对小鼠fst不动时间的影响(
注：**与模型组比较p＜0.01
经统计学分析在tst与fst实验中，shf及其有效部位的抗抑郁作用无统计学差异，说明shf有效部位的抗抑郁药效等同于shf，用药剂量明显减少，是其抗抑郁的有效部位。
3.4shf及其有效部位对小鼠空场实验的影响
通过与模型对照组比较，各给药组和氟西汀组在小鼠穿越，站立和修饰行为上均无明显差异(p＞0.05)。由此可以判断药物的抗抑郁作用并不是由于小鼠自主活动增强而引起的。实验结果见表4。
表4shf及其有效部位对小鼠空场实验的影响(
3.5shf及其有效部位对阈下剂量戊巴比妥钠协同作用的影响
表5所示为shf及其有效部位对阈下剂量戊巴比妥钠实验，结果显示shf及其有效部位均能增加阈下剂量戊巴比妥钠睡眠动物和提高睡眠率。
表5shf及其有效部位对阈下剂量戊巴比妥钠实验(
3.6shf及其有效部位对阈上剂量戊巴比妥钠协同作用的影响
由表6可以看出，shf及其有效部位各组睡眠潜伏期与模型对照组相比均明显缩短，且差异存在高度统计学意义(p＜0.01)。各组睡眠时间比较发现，给药组比模型对照组的睡眠时间明显延长，差异存在统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。且有效部位高剂量组的睡眠时间最长，提示与阈上剂量戊巴比妥钠有协同催眠作用。
表6shf及其有效部位对阈上剂量戊巴比妥钠实验结果
注：*与模型对照组比较p＜0.05；**与模型对照组比较p＜0.01
实施例4
有效部位颗粒剂的制备
1.颗粒剂的处方筛选
1.1辅料筛选按表7设计的处方取定量有效部位干膏粉与辅料(过80目筛)过40目筛混合均匀，用70％乙醇作黏合剂制软材，过20目筛制粒，60u鼓风干燥20min，过18目筛整粒，于60℃烘干10mm，计算细粉率，见表7。
1.2溶化性的测定精密称取1.1项下3种颗粒剂各1.0g，分别加入约60℃的水200ml，振摇，测定其完全溶解所需要的时间。《中国药典》2010年版一部中附录规定，颗粒剂应在5min内全部溶化，允许有轻微浑浊。结果3种颗粒剂均在2min全溶。
1.3溶液澄明度在光线充足处肉眼观察溶液的澄清透明度，结果见表7。
表7颗粒的辅料筛选
注：有效部位干膏粉加入量0.1g，糊精加入量6.6g。
由表7可知，木糖醇与糊精作为辅料制得的颗粒剂细粉率最低，溶液澄明度也最佳，故选择木糖醇与糊精作为混合辅料制粒；木糖醇有甜味，还可作为矫味剂，并且其代谢不需胰岛素参与。
1.4正交试验优选根据预试验结果，辅料的配比、黏合剂的种类是影响颗粒成型的主要因素。以木糖醇用量、糊精用量、乙醇体积分数为考察因素，干膏粉用量均为0.1g，共9份，选择l9(34)正交表设计试验，以颗粒剂粒度合格率为成型效果的评价指标，试验安排及结果见表8。
表8颗粒制备工艺正交试验分析
直观分析表明各因素影口向成型效果的作用主次为c＞a＞b。方差分析表明各因素均无显著性差异，故选择最佳工艺a1b1c1，即干膏粉0.1g，木糖醇3.0g，糊精1.4g，50％乙醇为黏合剂，干膏粉-木糖醇-糊精(0.5∶15∶7)。将制备好的颗粒过80目筛，筛下物称定质量，未过筛物再过60目筛，称定质量，继续过40目筛，同样方法过30目和20目筛，记录各目数筛下物质量。采用固定漏斗法将3只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上1cm的高度处，小心地将颗粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗中直到坐标纸上形成的颗粒圆锥体尖端接触到漏斗口为止，由坐标纸测出圆锥底部的直径(2r)，按计算tgα＝h/r休止角(n＝6)，见表8。结果发现各组颗粒剂的粒径分布及休止角均无显著差异，因此不作为正交试验筛选最优处方的指标。各组颗粒剂休止角均在35.0～36.5度，一般认为休止角≤30度时流动性好，≤40度时可满足生产过程中的流动性需求，故本制剂的流动性是符合生产要求的。
2.2颗粒剂的质量检查
称取干膏粉0.1g，按优选的工艺条件制备3批颗粒剂，进行质量检查。
2.2.1性状本品为颗粒剂。经多批样品的自然属性检查，均为浅黄白色至浅黄色颗粒，气清香，味苦、微甜，颗粒均匀，色泽一致，无吸潮、软化、结块。
2.2.2合格颗粒收率的测定按《中国药典》2010年版附录ic方法进行测定。能通过1号筛而不能通过5号筛的颗粒为合格颗粒，计算合格颗粒的收率93.09％，符合要求。
2.2.3溶化性的测定按2.1.2项下方法测定。颗粒剂在30s内全溶，溶液略呈乳白色，透光性良好，符合《中国药典》2010年版的要求。
2.2.4流动性的测定按2.1.4项下方法测得休止角35.6度，说明本制剂流动性符合生产要求。