本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种家禽大肠杆菌疫苗的制作方法。
背景技术：
家禽大肠杆菌是家禽的整个生命周期都容易发生的细菌病，主要表现有肉芽肿、气囊炎、腹膜炎、蜂窝织炎、脐炎和输卵管炎等，大肠杆菌每年给我国家禽养殖业造成10%以上的损失（每年约100亿元以上损失），而且大肠杆菌易产生耐药性，近二十年来，家禽养殖业的超范围、超剂量用药问题十分突出，给公共卫生安全也造成一定的影响。业内一直希望能使用大肠杆菌疫苗来控制此病的发生，但几十年来大肠杆菌疫苗的研究和应用，却一直没有大的突破。其主要原因是大肠杆菌血清群（162个以上）多血清型、血清亚型更多（几千个以上），不同的血清群之间的疫苗没有交叉保护或交叉保护很差，就是同一血清群型的疫苗，比o157群的菌苗，因为这一群中h抗原、k抗原、粘附素、毒素、保护素、铁摄取机制以及侵袭毒不同，其对家禽的保护率也会很大差异。在我国，疫苗生产厂家生产能力很大，100吨的发酵罐几天就能生产2亿头份疫苗，一个月的产量就是几十亿头份，而我国的家禽养殖场养殖规模小，主要规模就是几千只到几万只，而且同一地区常有不同种禽场的鸡苗，大肠杆菌也千差万别，大肠杆菌血清型多且不同菌株菌苗与野菌株之间没有交叉保护或交叉保护很差，选取的菌株只对所采菌的某一个场或几个场有效，用于本地或外地其它养殖场则无效，疫苗厂液体生产能力巨大但疫苗适用性差，这就会造成疫苗的巨大浪费，一次生产几亿头份却只有几万头份有效果。为解决这一矛盾，疫苗厂曾试图在不同地区最多选取4、5个菌株做到一个疫苗里，试图扩大菌株的覆盖性，但因各地的大肠杆菌菌株型太多而终告失败，所以经过十几年试生产后，疫苗厂已基本放弃家禽大肠杆菌生产。但大肠杆菌病本身，由于近二十年来大肠杆菌耐药性不断增加，发病却更趋严重。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种家禽大肠杆菌疫苗的制作方法，解决大肠杆菌血清型多且不同菌株菌苗与野菌株之间没有交叉保护或交叉保护很差，疫苗厂液体生产能力巨大但疫苗适用性差且易造成疫苗的巨大浪费的问题，具有针对性强，疫苗保护率高，防疫有效时间长，且产能也不浪费的特点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种家禽大肠杆菌疫苗的制作方法，包括如下步骤：
（1）针对有需求的养殖场，从每一家养殖场的病鸡肝脏中分别提取相应的细菌，标记并备用；
（2）将每个养殖场的细菌，进行培养、灭活、离心、重悬，得到大肠杆菌菌体；
（3）根据每个养殖场的实际需要将大肠杆菌菌体制备成菌量为5×109-2×1010cfu/ml的大肠杆菌疫苗。
进一步地，步骤（1）中，每个养殖场只做自家菌苗，采用一对一方式，采取针对性小产量固体培养。
进一步地，步骤（2）中所述培养的具体方法为：将每个养殖场的细菌，分别在营养平皿上划线，长出细菌后转入鉴别培养基，或直接在鉴别培养基上划线，放入37℃恒温箱中，待长出符合规定的菌落后，挑取相关的多个菌落放入营养肉汤中扩增培养，18-30个小时后，将生长良好的不同养殖场的大肠杆菌菌液分别涂布接种到营养平皿上，根据每个养殖场本批家禽数量将一定量的涂布好的大肠杆菌平皿，放入37℃恒温箱培养18-30个小时。
进一步地，步骤（2）中所述灭活的具体方法为：将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到不同养殖场的大肠杆菌菌液，根据菌液量加入3.5-4.55‰的甲醛，放入37℃摇床振荡灭活3-5天，进行灭活检测。
进一步地，步骤（2）中，离心搅拌速率为4000-8000r/min，离心时间为10min；重悬操作为：收集菌泥，用生理盐水重悬1-3次，离心，除去灭活用甲醛和大肠杆菌菌体破裂产生的大量内毒素和外毒素。
进一步地，所述鉴别培养基为ss琼脂培养基、伊红美蓝培养基中的一种。
进一步地，根据需要对菌落做进一步血清学或基因学鉴定（pcr），来确认大肠杆菌。
进一步地，所述灭活检测的具体操作为：挑取灭活菌液进行营养平皿划线检测，24-48小时后，观察是否有大肠杆菌生长，没有大肠杆菌生长，证明大肠杆菌灭活成功。
进一步地，步骤（3）中，大肠杆菌疫苗分为大肠杆菌水苗或油乳剂灭活苗，大肠杆菌水苗通过生理盐水直接稀释大肠杆菌菌体制得；油乳灭活苗根据标准操作规程制得。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明一种家禽大肠杆菌疫苗的制作方法，具有针对性强，疫苗保护率高，疫苗有害性低，且产能也不浪费的特点，同时，固体平皿培养比常规富营养物液体培养所得菌液所含营养类杂质少，菌苗使用副作用也小，可用于家禽的整个生产周期，特别是能用于产蛋家禽，对产蛋高峰家禽，影响很小，做一次苗防疫有效时间在3到4个月。两次防疫有效时间可达到6到8个月，而一些祖代场种鸡场和父母代种鸡场，连续使用两次到三次，防疫时间可长达一年。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
一种家禽大肠杆菌疫苗的制作方法，包括如下步骤：
（1）针对有需求的某一养殖场，从病鸡肝脏中提取细菌；
（2）在营养平皿上划线，长出细菌后转入ss琼脂培养基，或直接在ss琼脂培养基上划线，放入37℃恒温箱中，待长出符合规定的菌落后，鉴定：
血清学鉴定：向一个划好个个方格的玻璃板上滴一滴大肠杆菌菌液，然后加入一滴标准型号（共167种）的血清，用无菌牙签搅拌，静止1到2分钟，如果出现浑浊就是该血清型，没有浑浊反应，就是不是该血清型，以此来确认大肠杆菌的血清型；
pcr鉴定：首先利用标准dna提取试剂盒提取细菌dna，然后建立pcr反应体系，将该体系放入pcr仪中进行所需大肠杆菌目的基因片断的扩增，如果能扩增出特征基因片段，则证明此细菌就是大肠杆菌；
挑取相关的多个菌落放入营养肉汤中扩增培养18个小时，将生长良好的大肠杆菌菌液分别涂布接种到营养平皿上，根据该养殖场本批家禽数量将一定量的涂布好的大肠杆菌平皿，放入37℃恒温箱培养18个小时；将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到该养殖场的大肠杆菌菌液，根据菌液量加入3.5‰的甲醛，放入37℃摇床振荡灭活，3天后，进行灭活检测；将灭活好的大肠杆菌菌液以8000r/min转速进行离心10min，收集菌泥，用生理盐水重悬1次，离心得到大肠杆菌菌体；
（3）根据该养殖场的实际需要将大肠杆菌菌体制备成菌量为2×1010cfu/ml的大肠杆菌水苗。
某祖代种鸡场，一万套进口祖代种鸡，2015下半年发给50多家客户父母代种雏鸡，95%的客户出现钉脐、拉白粪情况，5天后出现大量死亡，前20天出现死亡率约在8-20%之间，随后雏鸡和青年鸡出现生长不整齐，发育不达标值15%左右。2015年底，该祖代场送检祖代病种鸡、父母代毛蛋等，经细菌提取、培养和鉴定，为大肠杆菌。依本方法制作大肠杆菌疫苗后，间隔20天进行两次免疫，疫苗使用期间，未见明显的产蛋下降。该祖代场2016年底反馈，该场2016年一整年发给100多家客户，没有一家种鸡场反映前10天有超过2%的死亡，父母代种鸡的生长也符合该品种饲养要求。
实施例2：
一种家禽大肠杆菌疫苗的制作方法，包括如下步骤：
（1）针对有需求的养殖场，从养殖场的病鸡肝脏中分别提取相应的细菌，标记并备用；
（2）将每个养殖场的细菌，分别在营养平皿上划线，长出细菌后转入伊红美蓝培养基，或直接在伊红美蓝培养基上划线，放入37℃恒温箱中，待长出符合规定的菌落后，挑取相关的多个菌落放入营养肉汤中扩增培养30个小时，将生长良好的不同养殖场的大肠杆菌菌液分别涂布接种到营养平皿上，根据每个养殖场本批家禽数量将一定量的涂布好的大肠杆菌平皿，放入37℃恒温箱培养30个小时；将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到不同养殖场的大肠杆菌菌液，根据菌液量加入4‰的甲醛，放入37℃摇床振荡灭活5天，进行灭活检测；将灭活好的大肠杆菌菌液以4000r/min转速进行离心10min，收集菌泥，用生理盐水重悬3次，得到大肠杆菌菌体；
（3）根据每个养殖场的实际需要可以将大肠杆菌菌体制备成菌量为5×109cfu/ml的大肠杆菌水苗或油乳剂灭活苗。
在步骤（1）中，每个养殖场只做自家菌苗，采用一对一方式，采取针对性小产量固体培养，针对性强，疫苗保护率高，且产能也不浪费。
在步骤（2）中，在灭活检测中，挑取灭活菌液进行营养平皿划线检测，培养48小时后，没有大肠杆菌生长，证明大肠杆菌灭活成功。
在步骤（2）中，垂悬次数为3次，为了确保除去灭活用甲醛和菌体破裂产生的大量内毒素和外毒素，使疫苗的有害性大大降低，可用于家禽的整个生产周期，特别是能用于产蛋家禽，对产蛋高峰家禽，影响很小。
在一个海兰褟父母代种场中饲养有250日龄9000套，平均每天死亡病种鸡30多，周死淘率达210只以上，平均产蛋率为80%，采样分离细菌鉴定为大肠杆菌，利用本方法制作大肠杆菌苗，免疫一次，使用疫苗时未见产蛋有明显下降，一个月后该场反映，周死淘率下降为5只左右，这种情况一直维持了5个月，产蛋率有所上升，平均为83%。
实施例3：
一种家禽大肠杆菌疫苗的制作方法，包括如下步骤：
（1）针对有需求的养殖场，从每一家养殖场的病鸡肝脏中分别提取相应的细菌，标记并备用；
（2）将每个养殖场的细菌，分别在营养平皿上划线，长出细菌后转入ss琼脂培养基，或直接在ss琼脂培养基上划线，放入37℃恒温箱中，待长出符合规定的菌落后，挑取相关的多个菌落放入营养肉汤中扩增培养25个小时，将生长良好的不同养殖场的大肠杆菌菌液分别涂布接种到营养平皿上，根据每个养殖场本批家禽数量将一定量的涂布好的大肠杆菌平皿，放入37℃恒温箱培养25个小时；将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到不同养殖场的大肠杆菌菌液，根据菌液量加入4.5‰的甲醛，放入37℃摇床振荡灭活4天，进行检测；将灭活好的大肠杆菌菌液以5000r/min转速进行离心10min，收集菌泥，用生理盐水重悬2次，得到大肠杆菌菌体；
（3）根据每个养殖场的实际需要可以将大肠杆菌菌体制备成菌量为1010cfu/ml的大肠杆菌水苗。
在步骤（2）中，鉴别培养基除了可以使用ss琼脂培养基，还可以使用如伊红美蓝培养基等常用培养基。
在步骤（3）中，水苗通过生理盐水直接稀释菌体制得，制得的大肠杆菌水苗可以直接使用，大肠杆菌水苗放一段时间后菌体在重力作用下会沉淀，用时再摇匀即可。
在某养殖场中8000多只200日龄海兰灰蛋鸡，共2栋鸡，各4000只，发病情况一样：死淘率高，主要是拉白粪、沾屁股和水泄，剖检主要是包心包肝和卵黄性腹膜炎，用大肠杆菌药时，死淘率减少，用药后半月病情就复发。后在试验中，4000只用药，4000只分离大肠杆菌做本养殖场大肠杆菌疫苗，疫苗使用时未见有明显产蛋下降。三个月后，用药组死淘352只，用药6次，2800元，症状没有减轻。另一疫苗组，用药一次，410元，死淘43只，拉白稀粪沾屁股、水泄等现象消失，没有复发，鸡羽毛完整度普遍好于用药组。
上述实施例中所制得的家禽大肠杆菌疫苗，具有针对性强，疫苗保护率高，疫苗的有害性低的特点，可用于家禽的整个生产周期，特别是能用于产蛋家禽，对产蛋高峰家禽，影响很小，做一次苗防疫有效时间在3到4个月。两次防疫有效时间可达到6到8个月，而一些祖代场种鸡场和父母代种鸡场，连续使用两次到三次，防疫时间可长达一年，且产能不浪费并较少经济损失。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。