本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及一种组织工程软骨支架及其制备方法和用途。
背景技术
软骨缺损是临床常见疾病。由于软骨组织自行修复能力有限,所以各种类型软骨损伤的修复一直是临床治疗的难题。近年来组织工程技术的快速发展为解决这一难题提供了新思路。组织工程学三要素包括种子细胞，支架材料和生长因子，其中理想的支架材料对成功构建组织工程软骨至关重要。然而，目前软骨组织工程研究中大多数支架材料缺乏与自然软骨相似的结构特性及生物化学组成。软骨脱细胞基质支架是天然的软骨细胞生存环境，可以为软骨细胞生长增殖提供良好的结构和生化微环境，具有很强的优势和应用前景，是目前再生医学和组织工程研究热点。
虽然脱细胞软骨基质作为组织工程软骨支架材料有诸多优点，但限制其广泛应用的瓶颈问题是软骨组织结构致密，脱细胞试剂不容易渗入，很难将深层的软骨细胞彻底清除干净；即便经过反复多次脱细胞程序将细胞基本脱除，接种的软骨细胞也无法长入到脱细胞基质支架内部，从而导致软骨再生不全。所构建的组织工程软骨移植到动物体内后，随着支架材料的不断降解，移植段软骨逐渐软化塌陷，最终导致长期修复效果不佳。为了解决以上问题，目前有些研究尝试将软骨组织切成薄片后再进行脱细胞处理，然后将软骨细胞接种在该脱细胞基质薄片，发现细胞可以在软骨陷窝内繁殖生长。随后将再生软骨薄片层层叠加最终形成组织工程软骨移植物。另一些研究将天然软骨组织粉碎，制成脱细胞基质微丝，经冷冻干燥法进行交联后制备出三维多孔海绵支架。虽然这两种方法都可以有效地解决软骨组织深层彻底脱除细胞及长入接种细胞的问题，但它破坏了软骨脱细胞基质的结构完整性，从而导致再生软骨力学强度不足。
因此，本领域迫切需要一种能够在不破坏软骨细胞外基质结构的基础上，彻底脱除基质支架内部细胞，同时使接种细胞可以长入到支架材料内部的软骨脱细胞基质支架制备方法。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种可提高软骨组织细胞外基质孔隙率的方法，以使异体或异种软骨细胞能够彻底清除，自体软骨细胞能够长入其内部。
在本发明的第一方面，提供了一种组织工程软骨支架的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)将天然软骨组织经激光打孔得到激光微孔软骨组织；和
(2)将激光微孔软骨组织脱细胞，得到组织工程软骨支架。
在另一优选例中，所述激光打孔的输出功率为3-20瓦，并重复2-8次。
在另一优选例中，所述激光打孔的脉冲时间为10-30毫秒，光斑直径为100-500微米。
在另一优选例中，所述脱细胞包括将激光微孔软骨与酶消化液在20-30℃混合。
在另一优选例中，所述软骨细胞外基质来自同种异体或异种。
在本发明的第二方面，提供了一种通过如上所述的本发明提供的制备方法制得的组织工程软骨支架。
在本发明的第三方面，提供了一种组织工程软骨移植物，所述移植物包括软骨细胞和如上所述的本发明提供的组织工程软骨支架。
在另一优选例中，所述的移植物为管状或片状。
在本发明的第四方面，提供了一种构建如上所述的本发明提供的组织工程软骨移植物的方法，所述方法包括步骤：将软骨细胞接种到如上所述的本发明提供的组织工程软骨支架上，通过体内和/或体外培养得到如如上所述的本发明提供的组织工程软骨移植物。
在本发明的第五方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组织工程软骨支架的用途，用于制备组织工程软骨移植物。
在本发明的第六方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组织工程软骨移植物的用途，所述的移植物用于修复动物各类型软骨组织缺损。
据此，本发明提供了一种能够在不破坏软骨细胞外基质结构的基础上，彻底脱除基质支架内部细胞，同时使接种细胞可以长入到支架材料内部的软骨脱细胞基质支架制备方法。
附图说明
图1显示气管软骨组织激光打孔过程。
图2显示激光微孔气管组织脱细胞参数的优化。
图3显示体外、内构建片状或管状组织工程软骨。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现可以通过激光打孔增加软骨组织细胞外基质的孔隙率，从而使异体或异种软骨细胞能够彻底清除，自体软骨细胞能够长至其深层。与此同时，软骨组织的脱细胞参数需与激光打孔的操作参数匹配，从而制备出具有合适孔隙率,适当力学强度的3-d激光微孔软骨脱细胞基质支架，并进一步验证了该支架在体内和体外再生软骨的可行性。在此基础上，完成了本发明。
术语
术语“接种”指将细胞均匀分布于三维支架材料上的过程。
术语“构建”指体外分离培养种子细胞，并将细胞与生物材料混合，通过体外培养和/或体内植入，使细胞-材料复合物形成组织工程化组织的过程。
术语“脱细胞”指由经化学和物理的方法去除异体或异种组织中的细胞的过程。
术语“激光打孔”是指利用高功率密度激光束照射被加工材料，使材料很快被加热至汽化温度，蒸发形成孔洞。
术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽，例如纯化的细胞因子,或分离的软骨细胞。
术语“自体移植”指将所需生物活体材料(如种子细胞、脱细胞基质、和/或它们构成的移植物)从某个体中取出并再施用于同一个体的过程。
术语“异种移植”指将所需生物活体材料(如种子细胞、脱细胞基质、和/或它们构成的移植物)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。
术语“异体移植”指将所需生物活体材料(如种子细胞、脱细胞基质、和/或它们构成的移植物)从某个体中取出并再施用于同物种另一不同个体的方法。
组织工程软骨支架
本发明提供的组织工程软骨支架的制备方法包括步骤：
第一步，对天然软骨组织进行激光打孔，得到微孔软骨组织，打孔参数中的输出功率为3-20瓦,脉冲时间为10-30毫秒,光斑直径为100-500微米,打孔重复次数为2-8次；第二步，将经过激光打孔的微孔软骨组织进行脱细胞处理。
上述第一步中，输出功率优选为8-12瓦，更优选为10瓦。
上述第一步中，打孔参数中的脉冲时间优选为16-18毫秒，更优选为17毫秒。
上述第一步中，光斑直径优选为250微米。
上述第一步中，优选重复打孔3-5次，更优选为4次。
上述第二步中，激光打孔后的微孔软骨组织，结构和强度发生改变，所以需要对传统的脱细胞方法进行优化。由于软骨组织脱细胞过程历时较长，而长时间的高温状态会严重影响软骨的力学强度，因此需尽可能在低温条件下进行脱细胞。传统方法中酶消化的温度一般在37℃，而上述第二步中涉及的脱细胞处理的酶消化温度为25-30℃，优选为25-27℃。
在本发明的一种实施方式中，上述第二步中的脱细胞处理步骤包括将经过激光打孔的微孔软骨组织与脱氧胆酸钠溶液混合后经酶消化，且这样的步骤循环不超过20次，优选为10-20次。
在本发明的一个实施例中，上述第二步中的脱细胞处理的步骤为：
①蒸馏水振荡清洗经过激光打孔的微孔软骨组织；
②加入脱氧胆酸钠工作液，于4℃温度下振荡；
③pbs漂洗；
④加入酶消化液，25-30℃(优选为25-27℃)振荡；
⑤pbs漂洗；
⑥重复②-⑤，开始循环，循环不超过20次，优选为10-20次，更优选为10-15次。
所述酶消化液中含有dna酶、rna酶。
构建组织工程软骨移植物
可以使用本领域常规的方法，通过将软骨细胞接种于上述本发明的方法提供的组织工程软骨支架上，构建组织工程软骨移植物。
本领域中另一个重要问题是，组织工程软骨能否长期在体内保持足够的力学强度。随着基质支架的降解，如果再生软骨力学强度不足将会导致修复区软化塌陷。在本发明的一个实施例中，以构建组织工程气管软骨移植物为例，分别在片状和长段管状的上述本发明的方法提供的组织工程气管软骨脱细胞基质支架上接种软骨细胞，体外培养2周后植入裸鼠皮下培养12周，发现接种细胞均能长入激光打孔脱细胞基质内部，并在体内外再生片状或管状组织工程软骨移植物。尤其体内实验的结果显示，所构建软骨移植物的基质支架内表面甚至形成比天然气管厚近2倍的软骨组织，那么有理由相信即使远期软骨脱细胞基质支架材料完全降解，新生软骨也具有足够的力学强度修复软骨组织缺损。
软骨形成细胞
本发明中软骨形成细胞的来源没有特别限制，可以是人或动物的软骨细胞，可来源于关节软骨、肋软骨、耳软骨、鼻中隔软骨、气管软骨等各种软骨组织；也可以是具有软骨分化潜能的人或动物其它种类细胞，可来源于骨髓、脂肪、肌肉、皮肤等组织。一种优选的来源是来自人或动物的耳软骨或关节软骨。
分离获得软骨细胞的方法是文献多次报道的公认方法。一种优选的方法是全麻或局麻下无菌切取软骨组织，经磷酸缓冲液(pbs)清洗后，加入5-10倍软骨体积的胶原酶溶液(浓度一般在0.5-3mg/ml，以pbs或培养液配制)，37℃恒温振荡消化4-20小时(依软骨组织的来源及消化进展程度而定)，过滤收集软骨细胞悬液，离心、洗涤、台盼蓝染色、显微镜下计数，原代软骨细胞活力一般应在80％以上。将干细胞诱导分化成软骨细胞的方法也是本领域常规的方法。
软骨细胞的培养、传代方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将软骨细胞在co2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)f-12培养基或dmem培养基+5％-20％胎牛血清；2)f-12培养基或dmem培养基+5％-20％自体(或异体)人血清；3)f-12/dmem培养基(1:1)+2％-20％胎牛血清或人血清。一类特别优选的软骨细胞是体外分离培养的原代-第3代的软骨细胞。此时的软骨细胞功能和活力均良好，具有很强的软骨形成能力，经免疫细胞化学染色证明有ii型胶原表达，rt-pcr及原位杂交检测证明有ii型胶原及蛋白聚糖(aggrecan)mrna的表达。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、通过本发明提供的方法激光打孔后能得到大体结构最理想的微孔软骨组织，电镜检测可以看出软骨基质的结构和完整性得以保存。
2、经过本发明提供的方法得到的微孔软骨组织，大大缩短了脱细胞处理的循环次数，减少了支架制备时间；降低了脱细胞过程中的温度要求，从而减少了脱细胞过程中对软骨细胞外基质的损伤。
3、通过本发明提供的软骨脱细胞基质支架制备方法，可以有效地提高软骨组织细胞外基质孔隙率，以使异体或异种软骨细胞能够彻底清除，避免体内移植修复缺损后免疫反应的发生；同时接种细胞能够长入至其深层，再生出具有足够力学强度的组织工程软骨，确保体内长期修复效果。
4、本发明提供的组织工程软骨移植物可在体内不引起任何免疫反应。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
制备激光打孔脱细胞气管支架
1.获得同种异体气管组织
用空气栓处死新西兰白兔，从颈部切口暴露气管后切取3-4厘米的气管放置于4℃的磷酸缓冲液(pbs)中。仔细移除附带的肌肉和脂肪组织，得到同种异体气管组织(仍保持管状，见图1a)，并放于4℃的pbs中。
2.将气管进行激光打孔并且筛选最优参数
将气管用一根和气管内径大小几乎相等(或者小一点的)支撑管支撑，然后以一定的速率旋转，c02激光打孔器(synrad-6500,wa98275))发射激光在气管表面进行打孔(图1b)。当参数设置为输出功率5w以下，即便脉冲时间和重复次数不变，微孔深度可能仅到达气管壁厚度的1/2，孔隙率增加较小；当参数设置为输出功率达到8-12w，脉冲时间16-18ms，重复3-5次，微孔深度能达到气管壁厚度的5/6,维持将要穿透而又没穿透气管壁的状态；当参数设置为输出功率10w，脉冲时间在25ms以上，即便只重复4次，气管壁被打穿，气管大体塌陷不能保持原有管状结构和力学强度。经过大量对比探索，当参数设置为输出功率8-12w，脉冲时间16-18ms，重复3-5次，这样就可以打出维持原有管腔且具有一定力学强度的激光微孔气管软骨支架(图1c)。
3.得到激光打孔脱细胞气管软骨支架
a：相关溶液的配制
①4％脱氧胆酸钠：取4g脱氧胆酸钠粉剂，加入100mlpbs，混匀，室温保存。
②酶消化液：称取1.21gtris碱加入到800ml双蒸水当中，使用盐酸调节ph值至7.6，分别加入dnasei20000u、rnasea25mg、mgc121.22g、cacl21.11g，混匀后定容至1000ml(dnasei20u/ml，rnasea25mg/l)，4℃冷藏备用。
b：具体操作方法
①蒸馏水浸泡48h(1:100)，4℃恒温振荡，每12h更换一次；
②4％脱氧胆酸钠4h(1:10)，4℃恒温振荡；
③pbs漂洗1h，4℃振荡，每15min更换一次；
④酶消化液3h(1:10)，4℃、25℃或37℃振荡；
⑤pbs漂洗1h，4℃振荡，每15min更换一次；
⑥重复②-⑤，开始循环，循环8、10或12次。
得到的激光打孔脱细胞气管支架分别为lmt(lasermicroporetechnique)protocol4℃，8，10，12次循环、lmtprotocol25℃，8，10，12次循环、和lmtprotocol37℃，8，10，12次循环。
c：结果
lmtprotocol4℃，经过12次脱细胞循环微孔气管大体和基质保持完好，但软骨陷窝中的留有大量软骨细胞，脱细胞不干净。
lmtprotocol25℃，经过12次脱细胞循环微孔气管软骨大体基本保持正常3-d管状结构，基质稍微破坏，软骨陷窝中几乎没有软骨细胞，脱细胞干净。
lmtprotocol37℃，经过12次脱细胞循环微孔气管软骨大体塌陷不能维持正常3d管状结构，基质破坏严重，软骨陷窝中几乎没有软骨细胞，脱细胞干净。
d：结论
lmtprotocol25℃，脱细胞循环12次既能保证激光微孔气管基质正常3d管状结构和内部基质仅受轻微破坏，又能保证软骨细胞脱干净，是最佳的激光微孔气管基质的脱细胞参数。(图2)
实施例2
体内/体外构建组织工程气管软骨移植物
1.软骨细胞的分离和培养
常规方法从兔耳廓软骨分离出软骨细胞并且进行体外扩增培养至p2代。
2.组织工程气管软骨的体内与体外再生
收集足量的第2代软骨细胞，将细胞小心均匀接种于脱细胞基质支架(片状和管状)外表面,于37℃，5％co2，饱和湿度条件培养，每隔2天换液。两周后取出部分细胞-材料复合物植入裸鼠皮下培养12周；其余细胞-材料复合物体外继续培养至8周。结果发现，无论体内或体外，均形成瓷白且具有足够力学强度的组织工程软骨组织。(图3)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。