本发明属于生物医学材料领域，涉及了一种噬菌体止血剂的制备方法及其应用。
背景技术：
血液凝固通指血液由流动的液状变成不能流动的凝胶状态的过程，主要是凝血因子促使血浆中可溶性纤维蛋白原变成不可溶的纤维蛋白的过程。正常的血液循环中存在的凝血和抗凝血系统能够相互平衡，从而保证了血液的正常流动。当机体因受到外力打击而出现伤口时，血液中的凝血因子、血小板可以为微小创伤(如轻微割伤)上的伤口迅速止血。重组凝血因子，如凝血因子vii，是一种是传统的人血凝血因子，是全身用止血药的代表，但该凝血因子具有分子量大、生产成本高、价格昂贵、半衰期短(4～6h)、表达量低、不易保存等缺点，大大限制了其在意外事故的急救治疗、手术过程中的创伤、战场上的受伤出血等应用。目前，临床上多采用化学药物如维生素k、酚磺乙胺、氨甲苯酸、重组人白介素-11等来作为止血剂来加速血液的凝固。这些止血药物主要是通过促进凝血因子活性或者抑制纤维蛋白溶解或者促进血小板的凝聚等功能达到凝血的目的。然而，这些药物由于是通过化学合成的凝血剂，存在毒性大，凝血效率低，来源有限等缺点，因此在临床应用当中有限。同时，临时性的止血也需要合适的止血方法来进行快速止血，以防人体组织受到细菌、病毒的感染。
随着对止血材料止血性能要求的不断提高，开发出止血速度更快、效果更佳的止血材料势在必行。rgd序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列)或含有rgd序列的蛋白广泛存在于细胞外基质、血浆蛋白以及血管内皮当中，是一种重要的细胞识别位点与信号启动分子，能够与纤维蛋白、激活后的血小板细胞表面特异性相互作用，因此在止血领域具有重要的医疗价值。
噬菌体展示是将编码外源多肽的dna序列通过基因工程技术插入到噬菌体基因的适当位置，使之稳定地表达外源多肽的技术。m13噬菌体是一种生物纳米纤维病毒(长900nm、宽7nm)，对人与动物无害，能特异性侵染含f因子的大肠杆菌，是噬菌体展示技术中的常用噬菌体。它由5种衣壳蛋白包裹一条单链环状dna基因组(6407bp)组成，其中2700拷贝的主要衣壳蛋白pviii位于噬菌体的侧壁，次要衣壳蛋白piii、pvi蛋白(各5拷贝)和pix、pvii蛋白(各5拷贝)分别组装到噬菌体的两端(图1)。噬菌体展示技术最大的特点是直接将蛋白表型和对应基因型联系了起来，展示后的多肽能在相对独立的空间保持较好的生物活性。通过噬菌体展示技术将rgd多肽展示在噬菌体表面，而rgd多肽跟血小板和纤维蛋白粘合在一起，帮助血小板形成血凝块；同时纤维状的噬菌体也能够与纤维蛋白网络相结合，促进凝血过程的发生，因此利用噬菌体展示技术展示rgd多肽可应用于止血剂的开发。
技术实现要素：
针对传统制备技术中存在的不足，本发明提供了一种止血效果好、实用方便的噬菌体止血剂
一种噬菌体止血剂，为利用噬菌体展示技术展示rgd多肽，所述多肽的氨基酸序列通式为：arg-gly-asp或arg、gly、asp3种氨基酸在内的其他变形；多肽展示在噬菌体的pⅷ外壳蛋白上。
本发明还提供了噬菌体止血剂的制备方法，包括如下步骤：
1)噬菌体展示载体的构建，其具体步骤如下：
a.设计前引物和后引物用于制备rgd插入片段肽对应碱基序列：
primer1，引入ncoi酶切位点：5′-atccatggcgcgtggcgacgatcccgcaaaagcg-3′；
primer2，引入hindiii酶切位点：5′-gcaagcttttatcagcttgctttcgag-3′；
b.将primer1和primer1分别配成寡聚核苷酸单链溶液，以m13dna为模板使用
c.将表达质粒用限制性内切酶酶切；
d.退火寡聚核苷酸链与质粒双酶切产物在t4dna连接酶作用下连接入载体，得到重组质粒；
2)tg1细胞的活化及质粒重组到tg1细胞；
a.将tg1细胞接种至lb培养基中，37℃，220r/min培养4h活化；以步骤1)中的重组质粒转化表达到宿主菌tg1细胞，37℃继续培养，得到感受态细胞；
b.挑取单菌落用于扩增细胞，质粒提取试剂盒提取质粒测序以验证质粒为阳性，证明rgd基因序列在tg1细胞表达，得到感受态tg1细胞；
3)rgd噬菌体扩增及纯化
将步骤2)中的感受态tg1细胞在37℃培养2个小时后加入辅助噬菌体，再加入iptg作为诱导剂，过夜培养；之后高速离心收集上清去除tg1细胞；peg/nacl沉淀、离心收集沉淀得到rgd噬菌体颗粒，重复该步骤2次，rgd噬菌体在去离子水中溶解分散，得到rgd噬菌体水溶液，通过uv光谱计算噬菌体数量；
4)rgd噬菌体冷冻干燥；
将步骤3)中的rgd噬菌体水溶液在冷冻干燥机中-40℃冷冻干燥12-24小时，得到rgd噬菌体粉末。
其中，所述多肽展示在噬菌体的pⅷ外壳蛋白上，或piii、pvi、pix或pvii蛋白位点上。
所述步骤3)得到的rgd噬菌体水溶液浓度为：105pfu/ml～1015pfu/ml。
所述步骤3)得到的rgd噬菌体水溶液浓度为：1011pfu/ml～1013pfu/ml。
将rgd肽展示在噬菌体外壳pⅷ蛋白的n-端(图1)。本发明以天然的、对人体无害的噬菌体为载体，在其衣壳表面展示rgd肽，其具有显著的促进凝血效应。同时，由于噬菌体外壳蛋白的亲水性，能够促进纤维蛋白原吸附的数量，从而会增加血小板粘附和促进血栓，达到止血效果。该rgd噬菌体止血剂主要用于外伤止血、手术出血等，其止血效果要优于化学药物如维生素k等，是一种理想的生物止血剂，与止血材料连用可增强止血效果。本专利给出了制备rgd噬菌体止血剂的制备工艺及最佳条件。通过进一步临床试验研究，有望给出一种新型的创伤止血制品。
另外本申请提供了噬菌体止血剂的用途。
rgd噬菌体在制备用于人体外伤、手术创伤的快速止血剂的用途
rgd噬菌体在用于制备耳动脉止血剂的用途，止血时间为：2.5分钟。
rgd噬菌体在制备用于促进细胞及组织的粘附和生长的药物的用途。
rgd噬菌体在制备用于疾病成像，肿瘤细胞的特异性打靶中的用途。
rgd噬菌体止血剂还可混合添加凝血促进剂、抗生素、抗真菌剂、消炎剂、止痛剂中的一种或两种以上的组合物。比如通过共混合添加的青霉素，冷冻干燥后制备得到的rgd噬菌体/青霉素止血剂具有消炎抗菌的作用；其通过与酶的催化反应交叉连接添加到组合物或制品中，rgd噬菌体还可以通过交联反应与生物大分子结合，如壳聚糖。其反应原来是噬菌体展示的rgd氨基酸残基，通过交联剂戊二醛或者京尼平与壳聚糖的-nh3相互键合交联成网络结构，进而形成rgd噬菌体/壳聚糖凝胶止血材料
与现有技术相比，本发明工艺简单，rgd噬菌体止血剂在伤口之间接触即发生粘附和启动内源性和外源性血液凝血过程，无需再添加其它止血因子，克服现有技术存在的不成形问题，适合于大规模生产；并且成本较低廉，环保无污染，具有突出显著的技术效果。
本发明具有以下突出特点：
(1)促进血小板激活：能吸引血液里带负电荷的血小板和纤维蛋白，增加血小板粘附和促进血栓
(2)快速止血：血液中的纤维蛋白网络通过粘附rgd噬菌体，能够加速凝血网络的自组装及形成，促进止血速度和效果，改善止血机制；
(3)用途范围广：适用于全身性失血的止血，尤其对脏器内出血的救治提供新的治疗方法。
附图说明
图1为rgd肽展示在噬菌体外壳pⅷ蛋白的n-端示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
本发明的实施例如下：
实施例1：
噬菌体止血剂的制备：
1)噬菌体展示载体的构建，其具体步骤如下：
a.设计前引物和后引物用于制备rgd插入片段肽对应碱基序列：
primer1：5′-atccatggcgcgtggcgacgatcccgcaaaagcg-3′(引入ncoi酶切位点)
primer2：5′-gcaagcttttatcagcttgctttcgag-3′(引入hindiii酶切位点)；
b.将primer1和primer1分别配成寡聚核苷酸单链溶液，以m13dna为模板扩增整个编码序列(使用
c.将表达质粒用限制性内切酶酶切；
d.退火寡聚核苷酸链与质粒双酶切产物在t4dna连接酶作用下连接入载体，得到重组质粒。
2)tg1细胞的活化及质粒重组到tg1细胞；
a.将tg1细胞接种至lb培养基中，37℃，220r/min培养4h活化。以步骤1)中的重组质粒转化表达到宿主菌tg1细胞，37℃继续培养，得到感受态细胞；
b.挑取单菌落用于扩增细胞，质粒提取试剂盒提取质粒测序以验证质粒为阳性，证明rgd基因序列在tg1细胞表达，得到感受态tg1细胞。
3)rgd噬菌体扩增及纯化
将步骤2)中的感受态tg1细胞在37℃培养2个小时后加入辅助噬菌体，再加入iptg作为诱导剂，过夜培养。之后高速离心收集上清去除tg1细胞。peg/nacl沉淀、离心收集沉淀得到rgd噬菌体颗粒，重复该步骤2次，rgd噬菌体在去离子水中溶解分散，得到rgd噬菌体水溶液，通过uv光谱计算噬菌体数量。
4)rgd噬菌体冷冻干燥；
将步骤3)中的rgd噬菌体水溶液在冷冻干燥机中-40℃冷冻干燥24小时，得到rgd噬菌体粉末。
5)rgd噬菌体用于耳动脉止血模型的止血
将步骤4)中的rgd噬菌体可用于耳动脉止血模型的止血，止血时间为：2.5分钟。
实施例2：
噬菌体止血剂的制备：
rgd噬菌体水溶液的制备与实施例1相同。将人脐静脉内皮细胞在细胞板中培养三天，将rgd噬菌体水溶液与人脐静脉内皮细胞在37℃孵育12小时，通过一抗(anti-m13coatproteing8pantibody)特异性与rgd噬菌体结合，再与带有夜光标签的二抗孵育，通过荧光显微镜观察，能够在人脐静脉内皮细胞周围观察到具有荧光的噬菌体，说明rgd噬菌体能够与人脐静脉内皮细胞特异性相结合。
实施例3：
噬菌体止血剂的制备：
rgd噬菌体粉末的制备与实施例1相同。将制备得到的rgd噬菌体粉末用于耳动脉止血模型的止血。兔耳动脉止血模型的构建：按40mg/kg剂量静脉注射戊巴比妥钠溶液麻醉兔后，将其中央耳动脉区域切开皮肤，钝性分离出耳动脉和神经，再用手术刀横向切断动脉，待血液涌出后立即用相同质量的rgd噬菌体粉末贴敷于伤口表面，每隔10s观察止血情况，直至最终完全止血后记录止血时间止血时间为：2.5分钟，而不贴敷rgd噬菌体粉末的伤口在6分钟后自行愈合，说明rgd噬菌体粉末可以帮助动物自身的血小板进行粘合及止血。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
sequencelisting
<110>浙江大学
<120>一种噬菌体止血剂的制备方法及其应用
<130>2017
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>34
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
atccatggcgcgtggcgacgatcccgcaaaagcg34
<210>2
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gcaagcttttatcagcttgctttcgag27