本发明属于免疫治疗领域，涉及cik细胞，具体涉及一种增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性的化合物及其制剂。
背景技术：
：原发性肝癌(以下简称肝癌)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年大约有63万的新发病例，而且近年来发病率有上升趋势。肝癌患者的病程短，临床上较难早期发现，确诊时往往病情已进入中、晚期，病死率高。目前肝癌的治疗主要是以手术切除、肝移植、局部消融、化学治疗栓塞及其他局部区域治疗、分子靶向治疗等，但这些方法的治疗效果并不理想，因为肝癌患者体内天然免疫、特异性免疫功能低下，根治性手术切除率低，手术后复发率高，放射、化学治疗疗效差，易发生肝内播散及肝外转移，因此急需寻找新的有效方法来治疗肝癌。生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式，越来越受到重视。目前用于肿瘤生物治疗的免疫活性细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、树突状细胞(dc)以及细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)等。cik细胞是一种新型的免疫活性细胞，其主要效应细胞的表面标志为cd3+cd56+，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。研究表明，过继细胞免疫治疗对抑制肝癌的复发和转移、提高患者治愈率、改善患者生活质量、延长生存期都具有重要作用。如何用较少的cik细胞就发挥较优的免疫治疗效果是科研工作者的一个重要研究方向。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性的化合物及其制剂，以使用较少的cik细胞就发挥较优的免疫治疗效果。实现本发明上述目的技术方案如下：一种吡啶并咪唑类有机化合物在制备增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性的药物中的应用，该吡啶并咪唑类有机化合物具有如下通式结构：其中，r2为-och2ch3或-oh；r1为-ch2-或-ch(ch3)2-或-ch2ch2ch2-。优选地，吡啶并咪唑类有机化合物选自下列化合物：一种用于增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性的药物制剂，包括上述吡啶并咪唑类有机化合物，还包括药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、膏剂、口服液体制剂。本发明的突出优点：本发明证明吡啶并咪唑类化合物可以有效增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性，可以制备成药学上可以接受的药物制剂，以实现使用少量的cik细胞就发挥较优的免疫治疗效果。附图说明图1为各组cik细胞对hepg2的杀伤率比较。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验材料编号cm1-6的吡啶并咪唑类有机化合物均为已知化合物，由本公司合成人员参照文献和有机合成常规方法合成，并经质谱和核磁确证。人肝癌细胞系hepg2为本公司长期保存。重组人干扰素rhifn-γ、重组人白细胞介素rhil-2、cd3鼠抗人单克隆抗体、cik细胞分离液、pbs、无血清培养基md-cm-stmn、rpmi1640培养基、胎牛血清fbs、mtt、dmso、胰酶均购自南京建成生物。二、实验方法1、外周血单个核细胞制备无菌抽取健康人外周血约50ml，肝素抗凝(肝素15iu/ml)，用等体积pbs稀释外周血。按1：1的体积比缓慢加入到含有细胞分离液的50ml离心管中，2000r/min离心20min。取中间环状乳白色单个核细胞层，移入50ml离心管中，加入适量pbs，1800r/min离心8min，弃上清，洗涤2次，细胞计数。2、cik细胞诱导培养用含有5％fbs的md-cm-stmn细胞培养基调整单个核细胞密度为1×106个/ml，接种20ml于培养瓶中，细胞总数为2×107，当天(第0天)加入rhil-21000u/ml、rhifn-γ1000u/ml、cd3鼠抗人单克隆抗体5mg/l，放置37℃，5％co2培养箱中开始培养。第3天开始补加md-cm-stmn细胞培养基，同时补充cd3鼠抗人单克隆抗体、rhifn-γ、rhil-2，用量同前，此后每3d添加新鲜培养基，补加rhifn-γ，用量相同，rhil-2用量减半为500u/ml。3、cik细胞增殖测定台盼蓝染色方法，用细胞计数板分别于培养第0、5、8、13、20天对细胞进行计数，重复3次取平均值。4、肿瘤细胞系的培养将hepg2细胞接种于培养瓶中，加入含有10％fbs的rpmi1640，贴壁细胞用0.25％的胰酶消化。取对数生长期的细胞，接种于96孔板，进行体外杀伤实验。5、mtt法测定cm1-6化合物对hepg2细胞的细胞毒作用取对数生长期hepg2细胞，调整细胞悬液密度为5×103个/ml，接种于96孔板，每孔200μl。待细胞贴壁后换液，给药组分别加入2μm化合物cm1-6，对照组加入培养液，每组均设3个平行孔，放置在37℃、5％co2培养箱中作用48h后，各给药组及对照组每孔均分别加入20μlmtt(5g/l)，继续放置在37℃、5％co2培养箱中培养4h，弃上清，每孔加入200μldmso，37℃下摇床振荡10min，酶标仪测定490nm处吸光度(a)值。6、mtt法测定cik对hepg2细胞杀伤作用将培养至第13天的cik细胞作为效应细胞，进行体外杀伤实验。调整hepg2细胞浓度5×103个/ml，每孔100μl，分为cm1增敏组、cm2增敏组、cm3增敏组、cm4增敏组、cm5增敏组、cm6增敏组和常规组，cm1-6增敏组分别添加2μm化合物cm1-6，常规组正常培养，放置在37℃、5％co2培养箱中培养至细胞贴壁后换液，按效靶比10：1将效应细胞加入培养孔中，同时另设单独靶细胞(靶细胞+培养液)和单独效应细胞(效应细胞+培养液)为阴性对照，放置在37℃、5％co2培养箱中作用48h后，加入mtt(5g/l)，20μl/孔，继续放置在37℃、5％co2培养箱中培养4h，2000r/min离心5min，翻板弃上清，加入dmso150μl/孔，震荡，待沉淀溶解，放于酶标仪中，490nm测光密度(od)值，按如下公式计算杀伤活性：杀伤率(％)＝{1-[(实验组od值-单独效应细胞od值)/单独靶细胞od值]}×100％。7、统计学方法采用spss19.0统计软件分析，数据以均数±标准差表示，p＜0.05具有统计学意义。三、实验结果1、cik细胞增殖cik细胞在培养第5天细胞增殖速度加快，第5-13天为快速增殖时间段，在第20天细胞增殖达到原种植量的118倍，在第20天细胞增殖达到原种植量的176倍。2、化合物cm1-6对hepg2细胞的细胞毒作用化合物cm1-6给药组与对照组的吸光度(a)值无显著差异，证明2μm化合物cm1-6对hepg2细胞无明显细胞毒作用。结果见表1。表1化合物cm1-6给药组与对照组的吸光度值的比值cm1cm2cm3cm4cm5cm6a给药/a对照1.020.980.980.991.011.013、化合物cm1-6增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性从表2和图1可以看出，各增敏组cik细胞对hepg2细胞的杀伤率均显著高于常规组。已知2μm化合物cm1-6对hepg2细胞无明显细胞毒作用，各增敏组cik细胞对hepg2细胞杀伤率的提高只能归结于化合物cm1-6提高了hepg2细胞对cik细胞的杀伤敏感性，使用化合物cm1-6对靶细胞hepg2细胞增敏后，效靶比不变的情况下，cik细胞对hepg2细胞的杀伤力显著提高。表2各组cik细胞对hepg2细胞的杀伤率(效靶比10:1)本发明证明吡啶并咪唑类化合物可以有效增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性，可以制备成药学上可以接受的药物制剂，以实现使用少量的cik细胞就发挥较优的免疫治疗效果。上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。当前第1页12