本申请是申请日为2012年2月3日、申请号为201280015807.1、发明名称“免疫原性支气管炎博德特氏菌组合物”的专利申请的分案申请。
本发明涉及免疫学领域，特别地涉及免疫原性和疫苗组合物领域。更具体而言，本公开涉及包含与百日咳杆菌粘附素联合的支气管炎博德特氏菌(bordetellabronchiseptica)制剂的组合物，用于在犬中治疗或预防呼吸疾病。
背景技术：
支气管炎博德特氏菌是寄居于犬呼吸道中并引发支气管炎或“犬舍咳”的革兰阴性菌。hawkins,e.c.,veterinaryinternalmedicine(1995),pp.767-811。支气管炎博德特氏菌使犬易受其他呼吸剂(respiratoryagent)的影响并且经常与其同时存在。迄今为止，很多疫苗可用于治疗由支气管炎博德特氏菌引起的支气管炎，包括
然而，大部分现有的商业疫苗需要棘手的鼻内施用以及添加佐剂，这可导致有害副作用，诸如烧灼感和刺激。vierascheibneretal.,nexusdec2000(vol8,no1)。由于其在疫苗施用期间相对易怒动物而具有的自身风险，鼻内疫苗在兽医医师中并不受欢迎。已经对亚单位疫苗(诸如涉及应用支气管炎博德特氏菌(百日咳杆菌粘附素)的p68蛋白质的那些疫苗)进行了研究，但是迄今为止，可能由于免疫原性、反应性和/或制剂稳定性不足，其未包括在任何商业犬用疫苗中。
支气管炎博德特氏菌是犬传染性呼吸系统疾病中的重要因素，其是拥挤条件(诸如救助中心和围板或训练犬舍)下居住的犬中常见的高度接触性传染病。cirdc的发病机理被认为是多因素的，涉及若干病毒和细菌。已知的作为cirdc的病原体的传染原除细菌支气管炎博德特氏菌(bemisetal.,lab.anim.sci.,29:48-52,1977)之外还包括犬呼吸道冠状病毒(crcov)(erlesetal.,virology,310(2):216-223,2003)、犬流感病毒(civ)(crawfordetal.,science,310(5747):482-485,2005)、犬副流感病毒(cpiv)(binnetal.,exp.biol.med.,126:140-145,1967)、犬支原体(chalkeretal.,microbiology,150:3491-3497,2004)和犬腺病毒血清型2(cav-2)(ditchfieldetal.,can.vet.j.,3:238-247,1962)。迄今为止，还没出现可对抗所有或大部分前述病原体的综合性组合疫苗。
因此，对能够安全肠胃外施用于犬的免疫原性组合物存在需求，其对支气管炎博德特氏菌提供长效免疫保护，而没有有害副作用或干扰组合疫苗中的其他抗原或者对兽医造成风险。本公开满足这些及其他相关需求。
技术实现要素：
在一个实施方式中，本发明提供免疫原性组合物，其包含支气管炎博德特氏菌和分离的百日咳杆菌粘附素抗原及其它。在另一实施方式中，所述百日咳杆菌粘附素抗原是重组蛋白质。在另一实施方式中，所述百日咳杆菌粘附素抗原来自支气管炎博德特氏菌。在另一实施方式中，所述百日咳杆菌粘附素抗原是p68。在另一实施方式中，所述组合物还包含经分离的bsp22抗原。
在另一实施方式中，支气管炎博德特氏菌组分是菌苗或细菌提取物(bacterialextract)。在另一实施方式中，所述组合物是不含佐剂的。在另一实施方式中，所述组合物还包含佐剂。
在另一实施方式中，所述百日咳杆菌粘附素抗原以约1μg至约30μg存在。更具体而言，所述百日咳杆菌粘附素以约5μg至约20μg存在，仍更具体，以约7μg至约15μg存在，甚至更具体，以约5μg、10μg、15μg或20μg存在。优选地，所述百日咳杆菌粘附素抗原通过将百日咳杆菌粘附素包含体溶解于脲中并任选通过柱色谱法纯化来制备。所述百日咳杆菌粘附素抗原是可溶性的并且优选基本不含聚集体(aggregates)。
另一实施方式提供了免疫原性组合物，其包含多种重组p68百日咳杆菌粘附素抗原，其中所述组合物基本不含p68聚集体。更具体而言，所述多种重组p68百日咳杆菌粘附素抗原通过将百日咳杆菌粘附素包含体溶解于脲中并任选通过柱色谱法纯化来制备。本发明还提供了通过将百日咳杆菌粘附素包含体溶解于脲中并任选通过柱色谱法纯化来制备p68百日咳杆菌粘附素抗原的方法。
在另一实施方式中，所述组合物配制用于肠胃外施用，这样其还包含稀释剂或赋形剂，用于肠胃外施用于犬。
在另一实施方式中，所述组合物还包含来自选自下述的犬呼吸系统病原体的抗原：犬副流感病毒(cpiv)、犬腺病毒-2(cav-2)、犬呼吸道冠状病毒(crcov)和犬流感病毒(civ)。在更具体的实施方式中，所述组合物包含至少两种、三种或四种来自犬呼吸系统病原体的抗原。
在另一实施方式中，本文所述的免疫原性组合物不包含非呼吸系统抗原。因此，本发明的一个实施方式提供了如本文所述的组合物，条件是其不含非呼吸系统抗原。非呼吸系统抗原不在对象中引发呼吸系统疾病。此类非呼吸系统抗原的非限定性实例包括狂犬病毒、犬细小病毒、犬胃肠炎病毒、钩端螺旋体属(leptospiraspecies)和博氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)。
在另一实施方式中，所述抗原来自犬呼吸道冠状病毒(crcov)。在另一实施方式中，所述抗原来自犬流感病毒(civ)。在另一实施方式中，所述抗原来自犬副流感病毒(cpiv)。在另一实施方式中，所述抗原来自犬腺病毒-2(cav-2)。在另一实施方式中，所述抗原来自犬副流感病毒(cpiv)和犬腺病毒-2(cav-2)。
在另一实施方式中，所述组合物包含来自犬副流感病毒(cpiv)、犬腺病毒-2(cav-2)、犬呼吸道冠状病毒(crcov)和犬流感病毒(civ)的抗原。
在另一实施方式中，所述组合物诱导对支气管炎博德特氏菌和犬副流感病毒(cpiv)、犬腺病毒-2(cav-2)、犬呼吸道冠状病毒(crcov)和犬流感病毒(civ)中至少一种的免疫反应。
本发明的另一实施方式提供了一种免疫原性组合物，其包含犬呼吸道冠状病毒(crcov)、支气管炎博德特氏菌制剂和犬流感病毒(civ)。更具体而言，所述组合物包含分离的百日咳杆菌粘附素抗原。
本发明的另一实施方式提供了上述任一种实施方式的免疫原性组合物用于在犬中治疗或预防来自犬呼吸道病原体的感染的方法或用途。在另一实施方式中，所述组合物在所述犬中预防来自所述犬呼吸道病原体的感染达6个月或更长的时期。在另一实施方式中，所述组合物在所述犬中预防来自所述犬呼吸道病原体的感染达1年的时间。
在另一实施方式中，犬呼吸道病原体为支气管炎博德特氏菌。在另一实施方式中，犬呼吸道病原体还包含下述中的至少一种、两种、三种或四种：犬副流感病毒(cpiv)、犬腺病毒-2(cav-2)、犬呼吸道冠状病毒(crcov)和犬流感病毒(civ)。
本发明的另一实施方式提供了提供了上述任一种实施方式的免疫原性组合物用于治疗或预防犬传染性呼吸道疾病综合征(cirdc)的方法或用途，其中所述组合物治疗或预防来自多种犬呼吸道病原体的感染。另一实施方式提供了肠胃外施用如本文所述的免疫原性组合物的用途或方法。
另一实施方式提供了包含用于在犬中治疗或预防来自犬呼吸道病原体的感染的免疫原性组合物的药物制备。
本发明的这些和其他实施方式、特征以及优势根据下面所述的详细描述和所附权利要求将是显而易见的。应理解，上述和下述各实施方式可结合成单一实施方式。
具体实施方式
下述定义适用本公开。其取代本文中通过参考引入的各单独参考文献所含的任何相反性定义。未限定的词语具有本领域技术人员通常使用的含义。此外，除非上下文另外要求，单数术语将包括多个和复数形式，而且多个和复数形式将包括单数。
“约”或“近似”当与可测量的数值变量结合使用时，是指该变量所示的值，以及在该所示值的实验误差内的该变量的所有值(例如，在平均值的95％置信区间内)，或者在所示值的百分之十内的该变量的所有值，无论如何更大者。如果用“约”指以周计的时间间隔，“约3周”指17-25日，而“约2至约4周”指10-40日。
如本文所用，“佐剂”是指用作免疫反应的非特异性刺激物的任何物质。关于佐剂的进一步描述，见下述。
如本文所用，术语"动物”包括易于感染支气管炎博德特氏菌和/或犬呼吸道疾病症候群的任何动物，包括家养和野生的哺乳动物。优选地，本文所述的动物指犬或人类。
如本文所用，“抗体”为保护抗原结合部位的任何多肽，无论来源、制备方法或其他特征。其是指由于对抗原的免疫反应而特异性与该抗原结合的没有球蛋白分子或其片段。免疫球蛋白是由具有“恒定”区和“可变”区的“轻”和“重”多肽链组成的血清蛋白，并且基于恒定区的组成对其进行分类(例如，iga、igd、ige、igg和igm)。对给定抗原具有“特异性”的抗体表示该抗体的可变区专门识别特异性抗原并与其结合。如本文所用，所示术语包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、单一特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、四聚体抗体、四价抗体、多重特异性抗体、单链抗体、结构域特异性抗体、单域抗体、结构域删除抗体(domain-deletedantibody)、融合蛋白、scfc融合蛋白、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体、突变抗体和cdr移植抗体。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整的免疫球蛋白，或者可以是完整的免疫球蛋白的免疫反应性蛋白质。“抗体”可转换为抗原结合蛋白质，其包括但不限于抗体片段，所述抗体片段包括但不限于：fab、f(ab')2、fab'片段、fv片段、单链fv(scfv)片段、fd片段、dab片段、双体、cdr3肽、约束fr3-cdr3-fr4肽、纳米抗体、二价纳米抗体、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceutical、smips)和微抗体(minibody)，以及任意上述片段及其化学或遗传操作的配体(counterpart)，以及保留抗原结合功能的其他抗体片段。通常，此类片段将包含抗原结合域。如本领域技术人员应理解的，任何此类粉丝可进行工程化(例如“种系化(germlined)”)，以便降低其免疫原性，增加其亲和性，改变其特异性或实现其他目的。
如本文所用，“抗原”或“免疫原”是指含一种或多种表位(线性表位、构象表位或两者)的分子，所述表位在暴露于对象之后将诱导对该抗原具有特异性的免疫反应。表位是与t-细胞受体或特异性抗体结合的抗原的特异位点，且通常包含约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。如本文所用，术语抗原是指亚单位抗原—从本质上与所述抗原相关的完整生物体分开并分离的抗原—以及杀死、减毒或灭活细菌、病毒、真菌、寄生虫或其他微生物。如本文所用，术语还指抗体，诸如抗-个体遗传型抗体或其片段，以及指能够模仿抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟位。如本文所用，术语抗原还指在体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸，诸如在dna免疫接种应用中。
如本文所用，“抗原性”是指蛋白质或多肽与针对该蛋白质或多肽而培养的抗体免疫专一性结合的能力。
术语“支气管炎博德特氏菌(bordetellabronchiseptica或b.bronchiseptica)”是指：支气管炎博德特氏菌的活的减毒细菌、支气管炎博德特氏菌的被杀死的全细胞提取物(菌苗)或者支气管炎博德特氏菌的细胞细菌提取物。
“缓冲液”指防止另一化学物质的浓度变化的化学体系。质子给体和受体体系用作缓冲液，其防止氢离子浓度(ph)的显著变化。缓冲液的其他实例包是含弱酸及其盐(共轭碱)或弱碱及其盐(共轭酸)的溶液。
如本文所用，“犬”包括通常被称为狗者，但也包括犬科家族的其他成员。
如本文所用，术语“细胞系”或“宿主细胞”指病毒在其中可以复制或维持的原核或真核细胞。
如本文所用，术语“培养物(culture)”指在缺乏其他种或类型时生长的细胞或微生物种群。
“剂量”是指给予对象的疫苗或免疫原性组合物。“第一剂量”或“启动剂量(primingdose)”是指在第0日所给予的此种组合物的剂量。“第二剂量”或“第三剂量”或“年剂量”是指在第一剂量之后所给予的此类组合物的量，其可以是但不必是与第一剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。
“表位”是与t-细胞受体或特异性抗体结合的抗原的特异位点，且通常包含约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。
如本文所用，“赋形剂”是指疫苗或免疫原性组合物的不反应的载体组分，其不是抗原。优选的赋形剂是本领域已知的用于肠胃外注射的那些。
“片段”是指蛋白质或基因的截短部分。“功能性片段”和“生物活性片段”是指保留了完整蛋白质或基因的生物性能的片段。
“同源性”或“同源性百分比”是指在比对序列并且(如果必要)引入间隙以实现最大百分比序列同源性以及还考虑作为序列同源性一部分的任何保守置换之后，在候选序列中与比较序列中的残基相同或类似的核苷酸或氨基酸残基的百分比。
“同源物”或“物种同源物”包括在两种或更多种物种中发现的基因，其具备大量的多核苷酸序列同源性，并具备相同或相似的生物功能和/或性质。优选地，代表物种同源物的多核苷酸序列将在中等严格条件下杂交，如通过本文实施例所述，并且具有相同或类似的生物活性和/或性质。在另一方面，代表物种同源物的多核苷酸将共享大于约60％的序列同源性、大于约70％的序列同源性、大于约80％的序列同源性、大于约90％的序列同源性、大于约95％的序列同源性、大于约96％的序列同源性、大于约97％的序列同源性、大于约98％的序列同源性或大于约99％的序列同源性。
“同一性”或“同一性百分比”是指在比对两种序列并且(如果必要)引入间隙以实现最大百分比序列同一性但是不考虑作为序列同一性一部分的任何保守置换之后，在候选序列中与比较序列中的残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。
如本文所用，在对象中的“免疫反应”是指对抗原发展的体液免疫反应、细胞免疫反应或者体液与细胞免疫反应。“体液免疫反应”是指至少部分被抗体介导的免疫反应。“细胞免疫反应”是通过t-淋巴细胞或其他白细胞或二者介导的免疫反应，而且其包括由激活的t-细胞、白细胞或二者产生的细胞因子、化学增活素和类似分子的生成。免疫反应可利用本领域已知的标准免疫测定和中和测定来确定。
如本文所用，“免疫原性”是指蛋白质或多肽引发特异性针对引起所述疾病的细菌或病毒的免疫反应的能力。
"免疫原性组合物"是一种含免疫原的制剂，其包括例如蛋白质，肽，全细胞，灭活的、亚单位或减毒病毒，或者多糖，或其组合，其被施用来刺激受体对存在于免疫原性组合物中一种或多种抗原的体液和细胞免疫反应。"免疫接种"是施用免疫原性组合物并在宿主中刺激对抗原的免疫或免疫原性反应的过程。优选的宿主为哺乳动物，诸如犬。优选地，免疫原性组合物为疫苗。
如本文所用。“免疫保护量”是有效地在受体在诱导免疫原应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。体液免疫或细胞介导的免疫或两种免疫均可被诱导。可评价动物对组合物的免疫原应答，例如，间接通过测量抗体滴度、淋巴细胞增殖测定，或者直接通过监控用野生株攻击后的体征和症状。例如，可通过测量攻击生物体的流出(shed)降低，临床迹象的降低，诸如死亡率、发病率、温度以及对象的总体身体健康情况、健康和表现，来评价组合物或疫苗所赋予的保护性免疫。免疫反应可包括而不限于诱导细胞和/或体液免疫。取决于所使用的特定生物体，或者被治疗或接种的动物的状况，治疗有效的组合物或疫苗的量可变并可由兽医确定。
如本文所用，“鼻内”施用是指经过或经由鼻子将诸如疫苗或其他组合物的物质引入对象体内，并且其包括主要经过鼻粘膜输送物质。
如本文所用，术语“分离的”是指处于基本纯形式的物质(例如，大于约95％纯度)；或者以一定途径从其自然环境纯化或富集的物质。提及“分离的百日咳杆菌粘附素”表示从其自然环境中被移出的百日咳杆菌粘附素蛋白质，诸如从宿主动物/犬中移出，位于菌种生长培养基中，或者从全细胞支气管炎博德特氏菌制剂中纯化，并且其随后可被返回添加至含支气管炎博德特氏菌提取物的组合物中(即，增添百日咳杆菌粘附素分离物)。如本文所用，术语“分离的”包括处于含其他物质/稀释剂/赋形剂/佐剂/蛋白质的溶液中的免疫原。
“药剂”是指用于预防、治愈或改善医学状况或者预防一些生理状况或事件的任何物质。
如本文所用，"单克隆抗体"是指通过单杂交瘤细胞系产生的抗体，其全部定向于特定抗原上的一个表位。用于制备单克隆抗体的抗原可以病原体的分离蛋白或整体病原体来提供。“杂交瘤”是由通过骨髓瘤细胞融合形成的杂交细胞和特异性抗体产生细胞组成的克隆细胞系。一般而言，单克隆细胞具有小鼠起源。然而，单克隆抗体也指通过噬菌体展示技术或者等价于噬菌体展示的方法或非小鼠起源的杂交细胞而生产的针对抗原的特定表位制备的抗体的克隆种群。
如本文所用，“经口”或“口服”施用是指通过或经由口腔将诸如疫苗或其他组合物的物质引入对象体内，并且其包括经过口腔黏膜的吞咽或输送(例如，舌下或口腔吸收)或二者。气管内也经口或口服施用的一种方式。
如本文所用，“口鼻”施用是指经过或经由鼻子和口腔将诸如组合物或疫苗的物质引入对象体内，例如，正如所发生的，通过将一滴或多滴滴剂置于鼻内进行。口鼻施用包括与经口和经鼻施用相关输送过程。
如本文所用，“肠胃外施用”是指通过或经由不包括消化道的途径将诸如组合物或疫苗的物质引入对象体内。肠胃外施用包括皮下、肌内、动脉内和静脉施用。为了本公开的目的，肠胃外施用不包括主要涉及经由口腔、鼻子、器官和肺内的粘膜组织来输送物质的给药途径。
如本文所用，术语“病原体”或“致病微生物”指能够在其宿主动物中诱导或引发疾病、病症或异常状态(优选呼吸系统疾病，诸如cirdc)的微生物，例如cpiv、cav-2、crcov、犬支原体、civ或支气管炎博德特氏菌。
如本文所用，“百日咳杆菌粘附素”是指博德特氏菌属的外膜蛋白。优选地。百日咳杆菌粘附素来自支气管炎博德特氏菌，更优选的来自“p68”，并且由基因prna编码。百日咳杆菌粘附素可以其天然形式从支气管炎博德特氏菌分离，或者其可重组产生。百日咳杆菌粘附素的序列和实例提供在美国专利号7,736,658中，该专利的内容因此通过参考并入。本文采用的百日咳杆菌粘附素抗原包括蛋白质的脂化形式。
“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适合用于与对象组织接触但是没有过分毒性、刺激、过敏反应等的物质，其与合理的收益/风险比相当并有效用于其预期用途。
如本文所用，"多克隆抗体"是指针对特定病原体或抗原的混合抗体种群。一般而言，该种群含有多种抗体组，每组定向于该病原体或抗原的特定表位。为制备多克隆抗体，整体病原体或分离抗原通过接种到宿主中或感染宿主而引入，其诱导宿主产生对抗该病原体或抗原的抗体。
如本文所用，术语“多核苷酸”指由在链中共价结合的核苷酸单体组成的有机聚合物分子。dna(脱氧核糖核酸)和rna(核糖核酸)是具有不同功能的多核苷酸的实例。
如本文所用，术语“多肽”指由两个或更多个在链中结合的氨基酸组成的有机聚合物分子。
如本文所用，"预防感染"指预防或抑制引起所述疾病的细菌或病毒的复制，以便抑制细菌或病毒的传播，从而阻止细菌或病毒自身在其宿主中建立，或者减轻由传染引起的疾病的症状。如果存在细菌或病毒载量的减少，则认为治疗是治疗性的。
如本文关于疫苗或其他组合物所用的“保护”、“保护的”、“保护性免疫”是指该疫苗或组合物预防或降低由衍生疫苗或组合物中所用的抗原的生物体引发的疾病症状。术语“保护”、“保护的”等还指所述疫苗或组合物可用于“治疗”疾病或者已经存在于对象中的所述疾病的一种或多种症状。
如本文所用，“呼吸作用”施用是指通过或经由吸入喷雾(雾化)物质而将疫苗或其他组合物的物质引入对象体内。在呼吸作用施用中，主要输送机制涉及雾化物质经过气管、支气管和肺中的粘膜的吸收，因此其不同于鼻内或口服施用。
术语“特异性结合(specificbinding、specificallybinds)”等定义为两个或更多个分子形成在生理或测定条件下可测量而且具有选择性的复合物。如果在适当选定的条件下，此类结合基本不被抑制，而同时非特异性结合被抑制，则抗体或其他抑制剂被称为与蛋白质“特异性结合”。特异性结合的特征在于高亲和性以及对化合物或蛋白质具有选择性。非特异性结合通常具有低亲和性。在igg抗体中的结合通常特征在于真实约10-7m或更高的亲和性，诸如约10-8m或更高，或者至少约10-9m或更高，或者至少约10-10或更高，或者至少约10-11m或更高，或者至少约10-12m或更高。如本文所用，该术语也适用例如抗原结构域对未被很多抗原携带的特定表位具有特异性的情况，在这种情况中，携带抗原结构域的抗体通常不与其他抗原结合。
如本文所用，“特异性免疫原片段”是指这样的序列蛋白质，其仅由对该序列具有特异性的抗体或t细胞识别。
如本文所用，“对象”是指具有免疫系统的任何动物，其包括动物，诸如犬。
如本文所用，“基本相同的”是指至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性程度。
如本文所用，“亚单位疫苗”和“亚单位组合物”是指一类疫苗或组合物，其包括源自来自感兴趣病原体(诸如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的抗原或与其同源的抗原(但并非全部抗原)。此类组合物或疫苗基本不含完整病原体细胞或致病颗粒，或者此类细胞或颗粒的溶解产物。因此，亚单位疫苗或亚单位组合物可从来自病原体或其类似物的至少部分纯的或基本纯的免疫原性多肽制备。获得亚单位疫苗或亚单位组合物中的抗原或多种抗原的方法包括标准纯化技术、重组生产或化学合成。“亚单位疫苗”或“亚单位组合物”因此指由病毒、细菌或其他免疫原的确定的抗原成分或多种抗原成分组成的疫苗或组合物。优选地，本发明的亚单位组分重组产生，且最优选地，其为百日咳杆菌粘附素(p68)。
“tcid50”是指“组织培养感染剂量”，并且其被定义为感染50％的给定批次的已接种细胞培养所需的病毒稀释。各种方法可用于计算tcid50，包括spearman-karber方法，其用在通篇说明书中。关于spearman-karber方法的描述，参见b.w.mahy&h.o.kangro,virologymethodsmanual25-46(1996)。
如本文所用，"治疗剂"是指任何分子、混合物、病毒或治疗剂，优选病毒减毒的或灭杀的，或者亚单位或化合物，其有助于治疗病毒、细菌、寄生虫或真菌感染、因此引起的疾病或病症。
如本文所用，“治疗有效量”是指将在接受抗原或疫苗或组合物的对象(例如，犬)中诱导免疫反应的抗原或疫苗或组合物的量，其适于预防或减轻由病原体(诸如病毒、细菌、寄生虫或真菌)感染引起的疾病的体征或症状，包括不良的健康影响或其并发症。体液免疫或细胞介导的免疫，或者体液免疫和细胞介导的免疫两种都被诱导。动物对抗原、疫苗或组合物的免疫原应答可间接通过测量抗体滴度、淋巴细胞增殖试验，或者直接通过监控用野生型菌株攻击后的体征和症状来评价。由疫苗或组合物赋予的保护性免疫可通过测量攻击生物体流出的降低和/或临床症状(诸如死亡率、发病率、温度以及对象的总体身体健康情况、健康和表现)的降低来评价。取决于所使用的特定免疫原，或者对象的状况，治疗有效的疫苗或组合物的量可变并可由本领域技术人员确定。
如本文所用，“治疗(treatortreating)”是指逆转、减轻、抑制此类术语所适用的病症、状况或疾病的进程，或预防所述病症、状况或疾病，或者预防所述病症、状况或疾病一种或多种症状。
如本文所用，“治疗”是指如上所定义的“治疗”的行为。
如本文所用，“疫苗”或“疫苗组合物”是指选自病毒或细菌的免疫原性组合物，所述病毒或细菌或者为修饰活性的、减毒的或灭杀的，或者为亚单位疫苗，或者为上述的任意组合。向对象施用疫苗产生免疫反应。可通过已知的给药途径将疫苗直接引入对象中，包括肠胃外、经口等。该术语指预防或降低感染或者预防或降低感染的一种或多种体征或症状的组合物。疫苗组合物对抗病原体的保护作用通常通过在对象中诱导免疫反应来实现。通常而言，消除或降低的感染发病率、体征或症状的改善或者微生物从感染对象中加速消除均表示疫苗组合物的保护作用。本发明的疫苗组合物提供了抵抗由犬呼吸道疾病病原体引起的感染的保护作用。
如本文所用，“兽医学可接受的”是指是指在合理医学判断范围内适合用于与兽医对象组织接触但是没有过分毒性、刺激、过敏反应等的物质，其与合理的收益/风险比相当并有效用于其预期用途。如本文所用，“兽医学可接受的载体"是指不干扰有效成分的生物活性的效力并且对其所施用的兽医对象无毒的载体介质。
抗原、免疫原性组合物和疫苗
本公开基于下述预料不到的发现：与支气管炎博德特氏菌制剂相结合的分离百日咳杆菌粘附素抗原的包含体产生充分改善的功效和安全性。即，在细菌攻击之前肠胃外施用于犬时，所述组合物预防支气管炎发作而且不会产生不良的副作用。
本发明还提供免疫原性组合物和疫苗，其包含一种或多种适合施用于犬以治疗cirdc的病毒和细菌或亚单位。本发明所包括的犬呼吸道冠状病毒(crcov)特征可为存在于患有传染性呼吸道疾病的犬的呼吸道中的冠状病毒。crcov在动植物演化史上与下述最密切相关：牛冠状病毒(bcov)、人类冠状病毒(hcov)株oc43和血凝性脑脊髓炎病毒(hev)；肠道犬冠状病毒(ccov)仅与crcov关系较远。适合用于本发明的crcov的代表性实例包括鉴定为crcov菌株4182的菌株(erlesetal.,virusres.,124:78-87,2007)。
本发明所包括的流感病毒抗原可以是来自鸟类或哺乳动物的任何经鉴定的流感病毒株，其包括但不限于：具有亚型h3血细胞凝集素和亚型n8神经氨酸苷酶或者h3n8亚型的流感病毒，其更经常被称为h3n8病毒。流感可具有任何哺乳动物或鸟类起源，包括但不限于猪、马或犬起源。在一个实施方式中，应用犬流感抗原。在一个实施方式中，应用马流感抗原。在一个实施方式中，应用具有亚型糖蛋白指定的h3或n8的菌株。在一个实施方式中，应用具有亚型h3和n8糖蛋白的菌株。
本发明所包括的流感抗原可分离自驯养和野生的狗、马、猪和家禽。选来用于样品收集的动物应显示急性和/或亚急性临床症状，其可包括温和至严重的呼吸道症状和发烧。动物还可显示厌食和昏睡的症状。病毒分离方法是本领域技术人员熟知的，包括：接种哺乳动物或鸟类细胞培养物、用来自临床标本的鼻或喉粘膜样本接种含胚卵、通过擦拭鼻腔通道或咽喉收集，或者通过收集诸如脾、肺、扁桃体和肝的组织及肺灌洗。可在细胞培养物中观察到病毒的细胞病变效应。可测试尿囊液或细胞溶解产物积聚人类、小鸡、土鸡或豚鼠红细胞的能力，其为流感病毒存在的推定证据。
适用于本发明的犬流感病毒(civ)株的代表性实例包括鉴定为a/犬/iowa/9a1/b5/08/d12的菌株，其于2006年6月29日以pta-7694保藏于美国典型培养物保藏中心(atcc),10801universityboulevard,manassas,va20110-2209。civ抗原的典型菌株为商业疫苗civ病毒株，
本发明所包括的犬副流感病毒(cpiv)特征可为已知作为与犬舍咳相关的病原体的病毒之一。cpiv抗原的代表性菌株为商业疫苗的减毒cpi病毒株，
本发明所包括的犬腺病毒2型(cav-2)特征可为已知作为与犬舍咳相关的病原体的病毒之一。cav-2抗原的代表性菌株为商业疫苗的减毒cav-2病毒株，
本发明所包括的犬支原体(m.cynos)描述于chalkeretal.,microbiology,150:3491-3497,2004中并且是与呼吸系统疾病相关的常见的支原体种属。抗犬支原体的免疫原性组合物描述于us2007/0098739中，其通过参考并入本文。
本发明所包括的支气管炎博德特氏菌组分特征可为与犬舍咳相关的细菌病原体。本发明所包括的所述免疫原性组合物和疫苗可为下述中的一种或多种：活的减毒支气管炎博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌菌苗或细菌提取物。另外，所述组合物优选还包括支气管炎博德特氏菌的分离的亚单位抗原。
在一个实施方式中，所述支气管炎博德特氏菌作为通过柱色谱法纯化的全细胞声处理物(wholecellsonicate)制备，如在1984年10月12日提交的专利申请号fr2571618中所提供的。支气管炎博德特氏菌的另一代表性实例为细菌提取物bronchicinetmcae(pfizer)，其从提取自支气管炎博德特氏菌细胞的抗原物制备。支气管炎博德特氏菌的另一实例是以
另外，亚单位还优选与支气管炎博德特氏菌组分联合存在(即，补充有支气管炎博德特氏菌组分)。所述亚单位的代表性实例为分离的百日咳杆菌粘附素抗原，优选为支气管炎博德特氏菌p68抗原，特性是重组的支气管炎博德特氏菌p68抗原，其被p68-特异性单克隆抗体bord2-7(描述于us7,736,658中，通过参考并入本文)识别，且在一个优选实施方式中，其具有如us7,736,658中所述的氨基酸序列或与其具有同源性。
重组p68百日咳杆菌粘附素抗原优选以合适的形式制备，使得在处理过程中类天然结构得以保存或恢复。因此，本发明的一个方面提供基本不含(少于约80％、90％、95％甚或99％)聚集物的重组p68百日咳杆菌粘附素。在另一实施方式中，重组p68百日咳杆菌粘附素用脲溶解，优先约0.1m、0.5m、1m、2m、3m或6m脲溶液。之后，诸如可通过柱色谱法纯化p68抗原。一种此类溶解方法描述于surinderetal.,j.bioscienceandbioengineering,v.99(4),pgs303-310(2005)中。
本文使用的百日咳杆菌粘附素抗原包括脂化形式。脂化蛋白质的制备实例提供于erdileetal.,infectionandimmunity,(1993)v.61(1)p.81-90中，该文献通过参考并入。其中所公开的方法可用于制备含有附加的脂质部分的翻译后修饰的百日咳杆菌粘附素蛋白质。
此外，在另一实施方式中，免疫原性组合物包含支气管炎博德特氏菌和分离的bsp22抗原。在另一实施方式中，免疫原性组合物包含支气管炎博德特氏菌、分离的百日咳杆菌粘附素抗原，还包含分离的bsp22抗原。bsp22抗原可如medhekaretal.,molecularmicrobiology(2009)71(2),492–504中所提供般制备。优选地，分离的bsp22抗原与支气管炎博德特氏菌提取物和分离的百日咳杆菌粘附素抗原(具体为重组p68)联合存在(即，除支气管炎博德特氏菌提取物和分离的百日咳杆菌粘附素抗原之外，还包括分离的bsp22抗原)。“bsp22”还包括抗原的脂化形式。脂化蛋白质的制备方法提供于erdileetal.,infectionandimmunity,(1993)v.61(1)p.81-90中，该文献通过参考并入。其中所公开的方法可用于制备含有附加的脂质部分的翻译后修饰的bsp22蛋白质。
本发明所包括的病毒可在细胞、细胞学和宿主细胞中繁殖。所述细胞、细胞学或宿主细胞例如可以是但不限于哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞，包括昆虫和植物细胞。本发明所包括的病毒可在其中繁殖的病毒细胞、细胞学和宿主细胞是本领域技术人员容易知晓并得到的。
本发明所包括的细菌可利用本领域技术人员已知的各种培养基来培养和繁殖，包括肉汤培养基(液体)和琼脂(固体；半固体)培养基。一些细菌还可在哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞中培养并繁殖。
本发明所包括的病毒和细菌在用于免疫原性组合物或疫苗中之前可以是减毒的或灭活的。减毒和灭活方法是本领域技术人员熟知的。减毒方法包括但不限于在细胞培养物中在合适的细胞系上连续传代(病毒和一些细菌)、在肉汤培养物中连续传代(细菌)、紫外线照射(病毒和细菌)和化学诱变(病毒和细菌)。病毒或细菌灭活方法包括但不限于用福尔马林、β-丙内酯(betapropriolactone,bpl)或二乙烯亚胺(bei)处理或者本领域技术人员已知的其他方法。
通过福尔马林灭活可通过使含微生物的悬浮液与37％甲醛混合而形成0.5％甲醛终浓度来进行。通过在室温下连续搅拌约24小时混合微生物-甲醛混合物。然后通过测定在合适的细胞系或肉汤培养上的生长来测试灭活微生物混合物。
对于一些抗原，通过bei灭活可通过使含本发明微生物的悬浮液与0.1mbei(2-溴-乙胺，在0.175nnaoh中)混合至1mm的bei终浓度来进行。对于其他抗原，bei终浓度为2mm。本领域技术人员知晓待使用的适宜浓度。通过室温下持续搅拌约48小时然后添加1.0m硫代硫酸钠至0.1mm终浓度，混合病毒-bei混合物。混合继续进行另外2小时。通过测定在合适的细胞系或肉汤培养上的生长来测试含灭活微生物的混合物的残留活病毒。
本发明所包括的免疫原性组合物和疫苗可包括一种或多种兽医可接受的载体。如本文所用，"兽医可接受的载体"包括任何溶剂、分散介质、涂料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖，以及本领域技术人员已知的其他等渗剂。稳定剂包括白蛋白以及本领域技术人员已知的其他稳定剂。防腐剂包括硫柳汞以及本领域技术人员已知的其他防腐剂。
佐剂可以是可代谢的，是指佐剂由能够通过靶标生物代谢的成分组成，诸如植物油基佐剂。可代谢的佐剂可以是可代谢油。可代谢油为通常存在于植物和动物中的脂肪和油，而且其通常主要由三酰基甘油的混合物组成，也称为甘油三酯或中性脂肪。这些非极性水不溶性物质是甘油的脂肪酸三酯。甘油三酯根据其三个脂肪酸残基或侧链的身份和布置而不同。
佐剂还可以是不可代谢的，是指佐剂由不能通过乳剂所施用的动物对象的身体代谢的成分组成。适用于本发明组合物的不可代谢油包括烷烃、烯烃、炔烃，以及其相应的酸和醇、其醚和酯，及其混合物。优选地，所述油的个体化合物是轻质烃混合物，即，此类组分具有6-30个碳原子。所述油可合成制备或从石油产品纯化。用于本文所述的组合物的优选的不可代谢油例如包括矿物油、石蜡油和环烷烃。如本文所用，术语"矿物油"是指作为经蒸馏技术得自矿脂的液态烃混合物的不可代谢佐剂油。如本文所用，该术语"液化石蜡"、"液体石蜡"和"白矿油"同义。如本文所用，该术语也意图包括"轻质矿物油"，即，通过矿脂蒸馏类似得到的油，但是该油相比白矿油具有稍微较低的比重。矿物油得自各种商业来源，例如，j.t.baker(phillipsburg,pa)、usbcorporation(cleveland,oh)。轻质矿物油以名称商业可得
佐剂包括但不限于emulsigen佐剂体系(mvplaboratories；ralston,ne),ribi佐剂体系(ribiinc.；hamilton,mt)、明矾、氢氧化铝凝胶、水包油乳剂、油包水乳剂(诸如例如，freund'scompleteandincompleteadjuvants)、嵌段聚合物(cytrx；atlanta,ga)、saf-m(chiron；emeryville,ca)、
可以使用的各种组合的其他非限定性实例包括三萜系化合物加甾醇类(例如，quila/胆固醇，也称为qac)、三萜系化合物加甾醇类、免疫调节剂和聚合物(例如，quila/胆固醇/dda/
用于本发明上下文中的佐剂和添加剂的量和浓度可由本领域技术人员容易地确定。在一个实施方式中，本发明包括包含约20μg至约2000μg佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一实施方式中，佐剂以约100μg至约1500μg、或约250μg至约1000μg、或约350μg至约750μg的量包含。在另一实施方式中，佐剂以约500μg/2ml免疫原性组合物或疫苗的量包含。
所述免疫原性组合物和疫苗还包括抗生素。此类抗生素包括但不限于选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类、青霉素类、多肽、喹诺酮类、磺胺类和四环素类类别的那些抗生素。在一个实施方式中，本发明包括含约1μg/ml至约60μg/ml抗生素的免疫原性组合物和疫苗。在另一实施方式中，免疫原性组合物和疫苗包含约5μg/ml至约55μg/ml抗生素，或约10μg/ml至约50μg/ml抗生素，或约15μg/ml至约45μg/ml抗生素，或约20μg/ml至约40μg/ml抗生素，或约25μg/ml至约35μg/ml抗生素。在又一实施方式中，免疫原性组合物和疫苗包含小于约30μg/ml的抗生素。
本发明所包括的免疫原性组合物和疫苗可包括一种或多种编码病毒或细菌或病毒或细菌蛋白质的多核苷酸分子。dna或rna分子可用在所述免疫原性组合物或疫苗中。dna或rna分子可在其他物质不存在的情况下施用，或者其可无语促进细胞摄入的物质(例如，脂质体或阳离子脂质体)一起施用。免疫原性组合物或疫苗中的总多核苷酸通常在约0.1μg/ml至约5.0mg/ml之间。在另一实施方式中，免疫原性组合物或疫苗中的总多核苷酸为约1μg/ml至约4.0mg/ml，或约10μg/ml至约3.0mg/ml，或约100μg/ml至约2.0mg/ml。利用核酸(dna或mrna)的疫苗和接种程序在现有技术中充分描述，例如美国专利号5,703,055、美国专利号5,580,859、美国专利号5,589,466，所有专利均通过参考并入本文。
除上述病毒或细菌外，本发明所包括的免疫原性组合物和疫苗可包括其他额外的抗原。抗原可以是微生物的灭活完整或部分制剂，或者是通过遗传过程技术或化学合成获得的抗原分子。按照本发明适合应用的其他抗原包括但不限于源自下述的那些：病原病毒，诸如犬瘟病毒、犬疱疹病毒、犬流感病毒、狂犬病病毒；病原菌，诸如布拉迪斯拉发钩端螺旋体(leptospirabratislava)、犬钩端螺旋体(leptospiracanicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(leptospiragrippotyphosa)、黄疸出血钩端螺旋体(leptospiraicterohaemorrhagiae)、波摩那钩端螺旋体(leptospirapomona)、哈德焦钩端螺旋体(leptospirahardjobovis)、卟啉单胞菌属(porphyromonasspp.)、类杆菌属(bacteriodesspp.)、疏螺旋体属(borreliaspp.)、链球菌属(streptococcusspp.)(包括马链球菌亚种兽疫(streptococcusequisubspecieszooepidemicus))、埃里希氏体属(ehrlichiaspp.)、支原菌属(mycoplasmaspp.)(包括犬支原体(mycoplasmacynos))和小孢子菌(microsporumcanis)。抗原还可源自致病真菌，诸如念珠菌属，源自原生动物，诸如隐孢子虫、新孢子虫、弓形虫、艾美球虫属、巴贝虫属、贾第虫属、利什曼原虫属，或寄生虫，诸如绦虫属、黄蝇属、棘球绦虫属和并殖吸虫属。
形式、剂量和给药途径
本发明所包括的免疫原性组合物和疫苗可施用于动物，以诱导针对cirdc的有效免疫反应。因此，本发明提供了通过向动物施用本文所述的治疗有效量的免疫原性组合物或疫苗而刺激有效免疫反应的方法。
本文所述的免疫原性组合物和疫苗可施用于动物，以便为动物接种抗的cirdc疫苗。所述免疫原性组合物和疫苗可以施用于动物，以在动物中预防或治疗cirdc。因此，本文所述的是针对cirdc为动物接种的方法，以及预防或治疗cirdc的方法，包括向所述动物施用治疗有效量的本文所述的免疫原性组合物或疫苗。
取决于给药途径，本发明所包括的免疫原性组合物和疫苗可以各种形式制备。例如，所述免疫原性组合物和疫苗可以适合注射应用的无菌水溶液或分散体来制备，或者利用冷冻干燥技术以冻干形式制备。冻干的免疫原性组合物和疫苗通常保持在约4℃，并且可在含或不含佐剂的稳定溶液(例如，盐水或hepes)中重构。所述免疫原性组合物和疫苗可以混悬剂或乳剂形式制备。
本发明的免疫原性组合物和疫苗包括治疗有效量的一种或多种上述微生物。纯化的病毒和/或细菌可直接用在免疫原性组合物或疫苗中，或者可进一步减毒或灭活。通常，免疫原性组合物或疫苗含约1×102至约1×1012病毒或细菌颗粒，或者约1×103至约1×1011颗粒，或者约1×104至约1×1010颗粒，或者约1×105至约1×109颗粒，或者约1×106至约1×108颗粒。免疫原性组合物或疫苗中有效提高保护效应的微生物的精确量可由本领域人员确定。
所述免疫原性组合物和疫苗通常包含兽医学可接受的的载体，其体积为约0.5ml至约5ml。在另一实施方式中，载体的体积为约1ml至约4，或约2ml至约3ml。在另一实施方式中，载体的体积为约1ml，或约2ml，或约5ml。适合用于免疫原性组合物和疫苗中的兽医学可接受载体可以是上文所述那些中的任一种。
本领域技术人员可容易地确定病毒或细菌是否需要在施用之前减毒或灭活。在本发明的另一实施方式中，病毒或细菌可直接施用于动物而无需额外减毒。治疗有效的微生物量取决于所用的特定微生物、动物的状况和/或感染的程度可以变化，而且可由本领域技术人员确定。
按照本发明的方法，可将单剂量施用给动物，或者可选地，可间隔约两周至约十周进行两次或多次接种。可需要加强方案，而且剂量方案可进行调整以提供最佳免疫。本领域技术人员可容易地确定最佳施用方案。
免疫原性组合物和疫苗可直接施用于血流中、肌内、内脏中或皮下。用于肠胃外施用的合适的方法包括静脉内、动脉内、肌内和皮下施用。用于肠胃外施用的合适的器械包括针(包括显微操作针)注射器和无针注射器。
肠胃外制剂通常是水溶液，其可含诸如盐、碳水化合物、蛋白质和缓冲剂(优选达到下述ph：约3至约9，约4至约8，或约5至约7.5，或约6至约7.5，或约7至约7.5)的赋形剂，但是在一些应用中，其可更适合配制成无菌非水溶液或干燥形式，或者与合适的媒介物(无菌、无热原的水或盐水)结合使用。
通过例如冻干在无菌条件下制备肠胃外制剂可利用本领域技术人员已知的标准制药技术容易地完成。
肠胃外溶液的制备中所用的材料的溶度可利用本领域技术人员已知的合适的配制技术来增加，诸如引入溶解增强剂，其包括缓冲剂、盐、表面活性剂、脂质体、环糊精等。
用于肠胃外施用的组合物可以配制成立即释放或缓和释放。缓和释放制剂包括延迟的、持续的、脉冲的、受控的、定向的以及程序化释放。因此，免疫原性组合物和疫苗可作为固体、半固体或触变性液体配制，用于作为植入贮剂施用，提供所述免疫原性组合物和疫苗的缓和释放。
免疫原性组合物或疫苗施用的其他方式包括通过显微操作针或无针(例如，powderjecttm,biojecttm等)注射来递送。
在利用皮下或肌内注射的情况中，优等渗制剂。一般而言，用于等渗性的添加剂可包括绿环、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在具体情况中，采用诸如磷酸盐缓冲盐水的等渗溶液。所述制剂还可包括诸恶u凝胶和白蛋白的稳定剂。在一些实施方式中，将血管收缩剂添加至所述制剂中。根据本发明的药物制剂通过配制成无菌且无热原的。然而，对于任何犬疫苗、多肽(抗原)亚单位免疫原性组合物和疫苗、重组病毒载体疫苗和dna疫苗而言，本领域技术人员熟知药学上可接受的载体的配方是美国农业部或者等价的外国政府机关(诸如加拿大或墨西哥)或者任一欧洲国家公布的法规中所批准的那些药物载体。因此，用于免疫原性组合物或疫苗商业化生产的药学上可接受的载体是已经经美国或外国的适宜政府机关批准或者将要批准的载体。所述免疫原性组合物和疫苗还可与药学上可接受的佐剂相混合。在所述免疫原性组合物和疫苗的某些配制中，该免疫原性组合物或疫苗与其他犬免疫原性组合物或疫苗相结合，生产出能够使犬免受他犬病原体引起的多种疾病的多价产品。
检测和诊断方法
在动物体内诱导的免疫反应的程度和性质可通过利用各种技术进行评价。例如，可从接种动物收集血清并测试对免疫原具有特异性的抗体存在与否。通过诸如t细胞增殖的测定可实现对淋巴组织中的相应细胞毒性t-淋巴细胞(ctls)的检测，其表示诱导了细胞免疫反应。现有技术中充分描述了相关技术。
试剂盒
由于可能期望结合其他组合物或混合物来施用免疫原性组合物或疫苗，例如目的是治疗特定疾病或病症，因此，免疫原性组合物或疫苗可适宜地包括在适合施用或共施用所述组合物的试剂盒形式中，或者结合到其中，这在本发明的范围内。
因此，本发明所包括的试剂盒可包含一种或多种单独的药物组合物，其中至少一种是按照本发明的免疫原性组合物或疫苗；以及用于单独保存所述组合物的装置，诸如容器、分隔瓶或分隔的箔包装。此类试剂盒的实例是注射器和针等。本发明的试剂盒特别适合施用不同的剂型，例如经口或肠胃外剂型，适合在不同的剂量间隔施用单独的组合物，或者相互间滴定不同的组合物。为帮助施用本发明所包括的组合物，所述试剂盒通常包括施用说明。
本发明包括的另一试剂盒进而保护一种或多种用于检测感染动物的试剂。所述试剂盒可包括用于分析样品中是否存在完整微生物、多肽、表位或多核苷酸序列的试剂。病毒、细菌、多肽或多核苷酸序列的存在可利用抗体、pcr、杂交以及本领域技术人员已知的其他检测方法来测定。
本发明包括的另一试剂盒可提供用于检测抗特定表位的抗体的试剂。此类试剂用于分析样品中抗体的存在，并且是本领域技术人员容易知晓和可用的。抗体的存在可利用本领域技术人员已知的标准检测方法来测定。
在某些实施方式中，试剂盒可包括一组印刷说明书或者标明该试剂盒用于检测感染动物的标签。
抗体
抗体可以是单克隆的、多克隆的或重组的。抗体可针对免疫原或其部分来制备。例如，基于所述免疫原的氨基酸序列的合成肽或通过克隆技术重组制备的合成肽，或者其天然基因产物和/或部分，可被分离并用作免疫原。通过本领域技术人员熟知的标准抗体生产技术可使用免疫原来产生抗体。抗体片段也可通过本领域技术人员已知的方法自抗体制备，并且其包括fab、f(ab')2和fv片段。
在生产抗体时，筛选所需的抗体可通过本领域已知的免疫性中的标准方法来完成。一般而言，elisas和免疫印记法优选的免疫测定类型。两种测定法都是本领域技术人员熟知的。多克隆和单克隆抗体均可用于测定。抗体可以固体载体底物结合，与可检测部分缀合，或者结合且缀合，如本领域熟知的。抗体与固体的结合也是本领域熟知的。考虑用于本发明的可检测部分可包括但不限于荧光、金属、酶和放射性标记物，诸如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酯酶、b-半乳糖苷酶、过氧化物酶、脲酶、荧光素、若丹明、氚、14c和碘化作用。
本发明进一步通过下述实施例来说明，但是其绝不限于所述实施例。
实施例
实施例1：支气管炎博德特氏菌细菌提取物亚单位疫苗的免疫原性
在研究中涉及32只约8周龄的带有低支气管炎博德特氏菌(微量凝集抗体(mat)滴度<16)的吡咯猎犬。将幼犬随机分成两个处理组(t1和t2)，每组16只。在接种之前，从t2去掉一只幼犬，原因是腹股沟疝。
按照表1所示的研究设计，在第0日和第21日将犬皮下接种适当的疫苗。第一次接种时将疫苗在右肩区域施用于每只犬，第二次接种时在左肩区域施用。
在第42日，通过在plexiglas室中雾化30分钟，用支气管炎博德特氏菌鼻内攻击来自所有处理组的犬。一次攻击四只犬，2只来自t1，2只来自t2，一组除外，该组仅有3只动物，2只来自t1，1只来自t2，因为先前一只动物已从研究中去除。
主要的效力变量是咳嗽。所有其他变量(鼻涕、眼黏分泌物、喷嚏、抑郁、干呕、呼吸音)被认为是支持性次级变量。一天两次(“观察期间”；上午和下午)临床观察呼吸性疾病的迹象(包括咳嗽)，每个期间每个房间约30分钟，从第42日直到第70日(研究结尾)。无论动物在两个连续观察期间咳嗽与否，计算各动物的攻击后(post-challenge)。计算各动物在两个连续观察期间的咳嗽/不咳嗽的频率分布。用cohran-armitage试验分析两个连续观察期间的咳嗽/不咳嗽，针对房间进行调整，原因在于利用概括性线性混合模型来分析数据是不可能的。计算各处理和时间点的鼻细菌分离的频率分布(+/-)。还要测定各动物是否曾经具有攻击后分离的细菌(bacteriaisolatedpost-challenge)。
针对各处理组，计算动物是否曾具有攻击后分离的支气管炎博德特氏菌的频率分布，并且如果可能的话，利用概括性线性混合模型对其进行分析。计算各动物的攻击后鼻腔流出物(nasalsheddingpost-challenge)的持续时间并利用概述性线性混合模型进行分析。将抗体滴度进行对数转化，并利用概括线性混合模型分析重复的测量。
结果：接种之后在任一犬中均无疼痛或发烧(>39.5℃)报告。两个处理组中一些犬被报告在接种时有抓痕。在第一次接种观察后的3-6小时期间内仅t2中的两只犬报告了小尺寸的注射肿胀(2×2×1cm)。该数据表明，接种是安全的并且犬的耐受良好。
所有盐水对照都发展了咳嗽，表示攻击足够。对照组中咳嗽的持续期间的最小二乘法(ls)平均值为20.3。对比而言，在预防接种中，疫苗使咳嗽的持续期间显著降低至5.2的ls平均值，且p-值<.0001。另外，当与对照相比时，在预防接种中的其他呼吸道临床迹象，诸如干呕和呼吸音均降低。
攻击后细菌分离数据显示，试验疫苗与盐水对照(ls平均值25.3)相比显著降低了接种组中的攻击生物体的鼻腔流出物的持续时间(ls平均值为20.5)，且p-值为0.0061。该数据表明，疫苗在降低感染水平上是有效的，如通过接种中流出(shedding)的持续期间降低所证实的。
在t2组中接种后产生的抗体应答(第21日和42日)类似于t1，这可能是由于凝集抗体测定的性质之故，而且不缺乏抗原性。相比盐水对照(ls平均值13)，在第70日时，观察到在大多数攻击后接种中诱导了强烈的既往应答(ls平均值426)，表明免疫有效。
总言之，来自该研究的数据清楚表明，支气管炎博德特氏菌细菌提取物(bacterialextract)亚单位疫苗通过降低咳嗽及鼻腔流出物的持续期间而展示出效力。
实施例2：可注射支气管炎博德特氏菌疫苗的效力和安全性评价
在研究中涉及50只约8周龄的比格猎犬。将犬随机分成5个处理组，每组10只。所有的动物健康情形良好而且没有接受任何博德特氏菌属接种。预筛血清样本的支气管炎博德特氏菌为阴性，且在首次接种前微量凝集试验(mat)的滴度<16。在首次接种前通过细菌鼻拭子分离试验测定所有动物均不含支气管炎博德特氏菌(第0日)。
按照表2所示的研究设计，在第0日和第21日将动物接种适当的疫苗。第一次接种将t01、t02、t03和t04组的疫苗在右肩区域皮下施用于每只犬，第二次接种在左肩区域施用。t05组在第0日接受商业可得的鼻内疫苗的单次鼻内接种。该组最后接种，以防止活疫苗在住所传播，并该组中的犬分开居住在不同的房间中，以防止暴露于其他组。
在第42日，通过在plexiglas室中雾化总计30分钟，用支气管炎博德特氏菌鼻内攻击来自所有处理组的犬。一次攻击来自同一围栏的五只犬(各处理组一只)。
主要的效力变量是咳嗽。细菌分离为次级变量。一天两次(“观察期间”；上午和下午)临床观察呼吸性疾病的迹象包括咳嗽)，每个期间每个房间约30分钟，从第42日直到第62日，以及在第63日一次(上午)(研究结尾)。在咳嗽分析之前，用平方根反正弦变换来变换咳嗽的观察期间百分比。利用概括线性混合模型分析咳嗽观察期间的变换百分比以及咳嗽的天数。针对各动物，计算攻击后动物咳嗽的观察期间的百分比和攻击后出现咳嗽的天数。
结果：在处理组t02和t04的犬的注射部位处观察到轻微至中等肿胀(数据未显示)。反应的严重程度和所涉及的犬的数目在第二次接种后增加。在处理组t03中的几只犬中观察到温和的注射部位反应。在盐水组t01中未观察到可测量的注射肿胀。未观察到临床发烧(>39.5℃)，只有t02组中的一只犬在接种后第4日除外。在任一接种犬中没有疼痛报告。
支气管炎博德特氏菌攻击接种在全部未接种的对照中诱导了咳嗽(53.3％，咳嗽14.7天)，说明攻击适于评价试验疫苗。所得的t05组(其接受了商业鼻内疫苗(阳性对照))的结果，显示出在攻击后直至2日观测咳嗽为4.6％，这表明攻击水平是最佳的而且不是势不可挡的。
在该研究中评价了三种试验制剂。t02在攻击后直至6日具有16.1％的观测咳嗽，t03在攻击后直至10.5日具有34.7％的观测咳嗽，而t04在攻击后直至10.7日具有34.5％的观测咳嗽。因此，相比未接种的对照，所有接种组显示出降低的咳嗽得分。接种了添加有百日咳杆菌粘附素和佐剂qcdc的支气管炎博德特氏菌细菌提取物的t02组，在咳嗽得分标准上显示出统计学显著的降低。因此，发现t02中所测试的制剂的效力是有效的。
实施例3.含支气管炎博德特氏菌的疫苗在犬中的安全性和效力
选择五十(50)只犬进行研究，将其分成5个处理组。基于第-4日的体检来确定动物是否适合该研究。
在每次接种前，在研究的第-2日、第21日和第28日在sst试管中从所有动物收集血样(约8ml)，用于血清学。在第-2日收集的血清样本用于确认动物不含支气管炎博德特氏菌。在接种前第0日收集鼻拭子，并测试支气管炎博德特氏菌的存在。在第-4日开始，收集鼓膜温度，以便在接种前建立基线。
按照表3所示的研究设计，在第0日、第21日和第28日将犬接种适当的疫苗。第一次接种时将疫苗在右肩区域皮下施用于每只犬，第二次接种时在左肩区域施用。
在接种第0、21和28日观察所有动物的接种后注射部位反应。从1-7日和第22-35日每日观察接种后所述动物的注射反应。在第0-7日和第21-35日收集鼓膜温度。
在攻击前一日，即第55日收集血样(约6ml)，用于血清学。在攻击前，于第54、55和56日收集鼓膜温度。在攻击前一日，即第55日收集鼻拭子，并测试支气管炎博德特氏菌的存在。在第54和55日，每日两次(上午和下午)，以及在第56日的上午，每次期间约30分钟，观察动物的呼吸道疾病的临床症状，以便建立基线值。
利用支气管炎博德特氏菌攻击菌株来制备109cfu/4ml/犬的目标攻击剂量。在第56日，通过在plexiglas室对被攻击的各围栏雾化总计30分钟，用支气管炎博德特氏菌鼻内攻击来自所有处理组的犬。一次攻击来自同一围栏的五只犬(各处理组一只)。
在攻击后从第56-77日，每日一次记录鼓膜温度。一天两次(“观察期间”；上午和下午)临床观察呼吸性疾病的迹象(包括咳嗽)，每个期间每个房间约30分钟，从第56日直到第76日，以及在第77日一次。简言之，利用下述计分系统观察咳嗽、鼻涕、喷嚏、眼黏分泌物、干呕和抑郁：无(0)、温和(1)、中等(2)和严重(3)。在第59、62、66、69、74、76和77日收集鼻拭子，测定攻击生物体的流出。
在第77日收集血样(约6ml)，用于血清学。利用拭子和输送介质收集鼻拭子，用于分离支气管炎博德特氏菌。
支气管炎博德特氏菌的凝集抗体通过微量凝集试验(mat)来测定。从第0、28、55和77日，滴定来自处理组t04和t05的血清样本，通过血清中和反应和ifa测定crcov抗体，以及通过hai测定civ。按照标准程序进行支气管炎博德特氏菌从鼻拭子的分离。对各样品定性测试细菌存在与否。
结果.在第0日，五十(50)只健康的约8周龄比格小猎犬经鼻拭子培养物分离证实不含支气管炎博德特氏菌生物体。通过mat来评价血清样本的支气管炎博德特氏菌凝集抗体可证实，所有小猎犬在第-2日均易感染，mat滴度为8。
在该研究中评价的所有实验疫苗在首次接种后产生轻微至无注射肿胀。对于大部分接种而言，注射肿胀限于研究的第0日。在第二次接种后也报告了轻微至无注射肿胀。在其发生时，注射部位肿胀在第二次接种后一至三天减退。主要在5-途径联合组(t04)中报告抓痕。接种后未报告临床发烧。在盐水组中未报告注射肿胀。所述数据证实了疫苗的安全性。
在攻击接种之前和之后进行的菌落计数证实，平均1.45x108cfu博德特氏菌属/犬在室中被雾化。攻击接种在全部盐水对照犬(t02)中诱导咳嗽，其中平均观察咳嗽百分比为43.5％，咳嗽天数为12.2天。类似于盐水对照，仅接种4-途径病毒(crcov/civ/cpiv/cav2)而没有博德特氏菌属抗原的处理组t05发展了咳嗽，其中平均观察咳嗽百分比为43.4％，咳嗽天数为12.2天。这些发现表明，攻击对评价试验疫苗适当且一致。
当与对照组相比时(咳嗽12.2天)，接种博德特氏菌属疫苗的处理组t01中的犬显著地免受攻击(咳嗽3.6天，p<0.0001)。当间隔3周施用时，相同的疫苗也显著地保护t03中的犬(咳嗽5.8天，p＝0.0004)。该两组(t01对t03)中的咳嗽得分上的降低并非显著不同(p-值＝0.1883)，表明3周或4周间隔施用的疫苗的保护水平是类似的。
当与对照组相比(咳嗽12.2天)，以及与接受4-途径病毒(crcov/civ/cpiv/cav2)联合的t05相比(咳嗽12.1天，p＝0.0019)，接受不加佐剂的5-途径联合疫苗的t04中的犬显著(p＝0.0016)防御博德特氏菌属攻击(咳嗽6.6天)，这说明了博德特氏菌属部分在缺乏佐剂的联合疫苗中的效力。
对5-途径联合疫苗中病毒部分的血清学评价仅对两部分是可能的。civ和crcov，其中在研究第-2日证实犬是血清阴性的。在研究的第56日，在4-途径疫苗组(t04)中的civhai应答数字上类似于5-途径疫苗组(t05)，说明不存在博德特氏菌属部分对civ抗原的干扰。在研究的第56日，在4-途径疫苗组(t04)中的crcovsn应答数字上高于5-途径疫苗组(t05)，说明博德特氏菌属可能对crcov部分具有干扰。然而，这些发现并非决定性的，因为这些疫苗未加佐剂，而且制剂并非最佳化的，以及并未进行crcov攻击来测试效力。
单价博德特氏菌属疫苗经证实是安全且有效的。当疫苗以21或28天间隔给予时，展示了单价疫苗的效力。当以5-途径不含佐剂的联合疫苗给予时，博德特氏菌属部分也显示是有效的。
实施例4.多价血清学研究
通过微量凝集试验(mat)对约8周龄且健康情形良好的五十只犬预筛支气管炎博德特氏菌，以及通过间接荧光抗体测定(ifa)对其预筛犬呼吸道冠状病毒(crcov)。还利用血清中和反应(sn)来评价抗体水平。在第0日，如通过mat(≤16)所测定，所有犬对支气管炎博德特氏菌的抗体呈阴性，如通过ifa(<40)所测定，所有犬对crcov的抗体呈阴性。在首次接种前(第0日)，所有犬也不含支气管炎博德特氏菌和crcov，如通过鼻拭子分离试验所测定。
犬分成5个处理组，每组8只犬，并按照表4所示的研究设计接种。第一次接种时将疫苗在右肩区域施用于每只犬，第二次接种时在左肩区域施用。
在第二次接种之后，由于并发症，将t04和t05组从研究中去除。每日观察剩余组(t01、t02和t03)中的犬的接种后反应，并且在每次接种后监控体温(鼓膜)，连续7天。在第0、21、42和56日从犬中收集血样，以测量抗体应答。
对来自第0、21、42和56日的血清样本通过mat测定测试针对支气管炎博德特氏菌的凝集抗体。对来自同一天的血清样本进行滴定，以通过血清中和反应测定crcov抗体，通过hai测定civ，研究通过血清中和反应测定cav-2和cpi抗体。得到各处理组的几何平均抗体滴度。
结果：
在第二剂量后，t02和t03组中的试验疫苗在全部(100％)接种犬中诱导抗体应答，表明对病毒抗原自动免疫接种。在大部分接种犬中，第二次接种后抗体应答增加，表明第二次接种具有加强作用。重要的是注意到，在多种病毒和细菌(支气管炎博德特氏菌)抗原存在下，在病毒部分之间实现了的抗体应答，表明不存在免疫干扰。mat血清学与防御博德特氏菌属无关，但是可作为引入合适的研究动物的有价值的筛选工具。总言之，基于免疫接种犬中的免疫应答，在5途径多价疫苗中预测到病毒抗原的效力。
实施例5.免疫研究的持续时间
a.单价：
该研究的目的是证明支气管炎博德特氏菌提取物-亚单位疫苗在8周龄犬中抗病毒性支气管炎博德特氏菌攻击的免疫持续时间。
所有动物健康情形良好，并且没有接受任何博德特氏菌属接种。在首次接种前，动物对支气管炎博德特氏菌具有低抗体滴度(≤16)或者无抗体滴度，如通过微量凝集试验(mat)所测定的。在首次接种前，所有动物也不含支气管炎博德特氏菌，如通过细菌鼻拭子分离试验所测定的。
将犬分成2个处理组；一组接受安慰剂疫苗，而另一组接受补充有重组抗原的支气管炎博德特氏菌提取物。该抗原为百日咳杆菌粘附素、bsp22，或者二者。对动物接种两次，间隔约3-4周。在每次接种后，观察其注射部位反应。
接种后约6-12个月，通过用支气管炎博德特氏菌雾化来攻击所有处理组的犬。在攻击之前和之后测定攻击剂量和攻击接种物的纯度。在攻击之前和之后进行临床观察。
收集鼻拭子，用于分离支气管炎博德特氏菌。收集各动物的血液，用于血清。通过mat测定对支气管炎博德特氏菌的凝集抗体。利用elisa，滴定血清样本的百日咳杆菌粘附素-特异性igg抗体反应。根据标准程序从鼻拭子进行支气管炎博德特氏菌的分离。
咳嗽、博德特氏菌属分离(攻击后)和接种后血清学反应是用于评判研究中的疫苗效力的标准。
b.多价：
该研究的目的是证明多价呼吸道联合疫苗在犬中的免疫持续时间。所述疫苗含下述抗原组分：修饰的-活cav-2、修饰的-活cpiv、灭活的civ、灭活的crcov，以及补充有重组抗原的支气管炎博德特氏菌提取物，所述重组抗原为百日咳杆菌粘附素、bsp22，或者为两者。
所有动物健康情形良好，并且没有接受所述疫苗旨在防护的任一种病原体的接种。将犬分成多组处理组。每组由两个处理组组成。对照组接受安慰剂疫苗，接种疫苗组接受测试疫苗。对动物接种两次，间隔约2-4周。在每次接种后，观察其注射部位反应。
接种后约6-12个月，通过用疫苗旨在防护的病原体之一来攻击各组两个处理组(接种疫苗和对照)。在攻击之前和之后进行临床观察。在攻击后期间，收集鼻拭子，用于分离攻击病原体。收集各动物的血液，用于获取血清，其用于随后的分析性分析。
呼吸道疾病的临床症状、攻击后病原体流出和血清学反应是用于评判疫苗效力的标准。
因此已经详细描述了本发明的各实施方式，应理解，所附权利要求定义的本发明并不局限于上面说明书所述的特定细节，因为其很多显而易见的变体在不背离本发明精神或范围的情况下是可能的。
上述所有参考文献因此通过参考引入，如同其在本文中被完整阐述。