本发明属于生物制剂领域；具体涉及一种防治猪腹泻生物制剂及其制备方法。
背景技术：
：近年来，我国养猪业得到了迅速的发展，规模化和集约化猪场日益增多，生猪养殖数量增大的同时，诸多疾病引发危害不断受到人们的关注。仔猪腹泻是引起仔猪生长性能下降及死亡的重要病因之一，给养猪业造成了重大经济损失，目前，抗生素大量应用于临床防治仔猪腹泻，导致抗生素及药物残问题，造成了诸多食品安全隐患。此外，腹泻仔猪粪便中含有大量病原微生物，会造成土壤、水体等环境污染，导致一系列公共卫生安全问题。技术实现要素：本发明的目的是提供一种特异性强、活菌数高、绿色安全、无毒副作用的防治猪腹泻生物制剂及其制备方法。本发明的一种防治猪腹泻生物制剂是将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酪酸梭菌菌株分别依次经过活化，二级种子培养，发酵培养，离心浓缩和喷雾干燥处理后混合制成的；具体是按下述步骤进行的：步骤a、将嗜酸乳杆菌活化，分别进行一级、二级液体培养用种子液制备，再将制备好的二级种子液分别接种于发酵罐，进行液体深层培养，待活菌数达1.0×109cfu/ml时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂a；步骤b、植物乳杆菌活化分别进行一级、二级液体培养用种子液制备，再将制备好的二级种子液分别接种于发酵罐，进行液体深层培养，待活菌数达1.0×109cfu/ml时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂b；步骤c、枯草芽孢杆菌活化，分别进行一级、二级液体培养用种子液制备，再将制备好的二级种子液分别接种于发酵罐，进行液体深层培养，待活菌数达1.0×109cfu/ml时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂c；步骤d、解淀粉芽孢杆菌活化，分别进行一级、二级液体培养用种子液制备，再将制备好的二级种子液分别接种于发酵罐，进行液体深层培养，待活菌数达1.0×109cfu/ml时，收集发酵液，再经离心浓缩、喷雾干燥，得到粉状制剂d；步骤e、然后将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c、粉状制剂d混合；即得到防治猪腹泻生物制剂。步骤a所述嗜酸乳杆菌二级生产种子制备：将嗜酸乳杆菌sy1菌种接种mrs液体培养基中，置于35-37℃厌氧培养36-48h，完成活化，然后划线接种于mrsa平板上，选取5个以上典型菌落，接种于mrsa斜面若干支，置于35-37℃培养36-48h，作为一级种子，取一级种子接种于mrs液体培养基中，置于35-37℃培养36-48h，即为二级种子。步骤b所述植物乳酸杆菌二级生产种子制备：将植物乳酸杆菌sy4菌种接种mrs液体培养基中，置于37℃厌氧培养36-48h，完成活化，然后划线接种于mrsa平板上，选取5个以上典型菌落，接种于mrsa斜面若干支，置于35-37℃培养36-48h，作为一级种子，取一级种子接种于mrs液体培养基中，置于35-37℃培养36-48h，即为二级种子。步骤c所述枯草芽孢杆菌二级生产种子制备：将枯草芽孢杆菌sy6菌种接种营养肉汤中，置于35-37℃培养24-36h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于营养琼脂斜面若干支，置于35-37℃培养24-36h，作为一级种子，取一级种子接种于营养肉汤中，置于35-37℃培养24-36h，即为二级种子。步骤d所述解淀粉芽孢杆菌二级生产种子制备：将解淀粉芽孢杆菌ssyb菌种接种营养肉汤中，置于35-37℃培养24-36h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于营养琼脂斜面若干支，置于35-37℃培养24-36h，作为一级种子，取一级种子接种于营养肉汤中，置于35-37℃培养24-36h，即为二级种子。步骤a所述嗜酸乳杆菌的发酵是：将嗜酸乳杆菌二级种子接种到发酵罐中，进行液体深层培养，液体培养基为mrs，接种量为2％～5％，装液量70％-80％，35-37℃和ph值6.0～7.0条件下静置培养。步骤b所述植物乳杆菌的发酵是：将植物乳杆菌二级种子接种到发酵罐中，进行液体深层培养，液体培养基为mrs，接种量为2％～5％，装液量70％-80％，35-37℃和ph值6.0～7.0条件下静置培养。步骤c所述枯草芽孢杆菌的发酵是：将枯草芽孢杆菌二级种子接种到发酵罐中，进行液体深层培养，液体培养基为营养肉汤，接种量为1％～3％，装液量60％-80％，在120～190rpm/min、33～35℃和ph值6.0～7.0条件下培养。步骤d所述解淀粉芽孢杆菌的发酵是：将解淀粉芽孢杆菌二级种子接种到发酵罐中，进行液体深层培养，液体培养基为营养肉汤，接种量为1％～3％，装液量60％-80％，在120～190rpm/min、33～35℃和ph值6.0～7.0条件下培养。步骤a所述喷雾是:将嗜酸乳杆菌培养液体100ml，5000-8000rpm离心10-15min，100ml无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量15-18w/v％，制备料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度70-80℃、入口温度120-140℃、入料速度1000-1200ml/h，进行喷雾干燥。步骤b所述喷雾是:将植物乳杆菌培养液体100ml，5000-8000rpm离心10-15min，100ml无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量15-18w/v％，制备料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度70-80℃、入口温度120-140℃、入料速度1000-1200ml/h，进行喷雾干燥。步骤c所述喷雾是:将枯草芽孢杆菌培养液体100ml，5000-8000rpm离心10-15min，100ml无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量17-20％w/v％，制备料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度80-85℃、入口温度140-150℃、入料速度1300-1500ml/h，进行喷雾干燥。步骤d所述喷雾是:将解淀粉芽孢杆菌培养液体100ml，5000-8000rpm离心10-15min，100ml无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量17-20％w/v％，制备料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度80-85℃、入口温度140-150℃、入料速度1300-1500ml/h，进行喷雾干燥。防治猪腹泻生物制剂的预防剂量为1.0×108cfu/d/头，治疗剂量为1.0×109cfu/d/头一日3次，一般2周一疗程。本发明的防治猪腹泻生物制剂具有特异性强、活菌数高、绿色安全、无毒副作用等优点。临床应用证实，防治猪腹泻生物制剂在有效防治仔猪腹泻，减少抗生素使用量的同时，还可提高仔猪头均日增重及饲料转化率。适于在规模化养殖场，尤其是绿色生态养猪小区推广应用，从而实现健康养殖，满足人们对绿色猪的需求。本发明产品提高仔猪日增重，降低料重比，从而提高生长性能5-8％，此外，降低仔猪腹泻发病率10-15％，降低仔猪死亡率1-2％，提高了生猪养殖经济效益，按平均每头猪可增加创收20元计算，推广应用2万头仔猪，可提高经济效益20元×20000头＝40万元。本发明所述的生物制剂可减少临床上治疗仔猪腹泻抗生素的使用量。在一定程度上降低抗生素残留问题对人类生产生活的影响，满足人们对绿色猪的需求，可大幅度推动我国规模化生猪养猪业的迅猛发展，并加快绿色生猪生产基地建设的步伐，对我国农民养殖户增收和农村经济发展具有重大意义。具体实施方式下述使用的sy1-嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)sy1，出自文章《齐齐哈尔周边地区仔猪肠道乳酸杆菌的分离与鉴定》。和sy4-植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)都sy4公开自2011第7期《猪业科学》94～97页的《齐齐哈尔周边地区仔猪肠道乳酸杆菌的分离与鉴定》。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sy6公开自2013年第26卷第1期《中国生物制品学杂志》122-128页的《猪源枯草芽孢杆菌喷雾干燥工艺的优化》。。解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ssyb公开自2016年第46卷第10期《中国兽医科学》1328-1334页的《解淀粉芽胞杆菌固态发酵黄芪培养基的研究》。具体实施方式一、本实施方式中一种防治猪腹泻生物制剂的制备方法，其特征在于该腹泻生物制剂是按下述步骤进行的：步骤a、将sy1-嗜酸乳杆菌菌种接种mrs液体培养基中，置于37℃厌氧培养36-48h，完成活化，然后划线接种于mrsa平板上，选取5个以上典型菌落，接种于mrsa斜面若干支，置于37℃培养348h，作为一级种子，取一级种子接种于mrs液体培养基中，置于37℃培养48h，即为二级种子。嗜酸乳杆菌二级种子接种到发酵罐中，进行液体深层培养，液体培养基为mrs，接种量为5％，装液量80％，37℃和ph值7.0条件下静置培养，待活菌数达1.0×109cfu/ml时，取嗜酸乳杆菌培养液体100ml，5000rpm/min离心15min，100ml无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量18w/v％，制备料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度75℃、入口温度120℃、入料速度1000ml/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂a；步骤b、将sy4-植物乳酸杆菌菌种接种mrs液体培养基中，置于37℃厌氧培养48h，完成活化，然后划线接种于mrsa平板上，选取5个以上典型菌落，接种于mrsa斜面若干支，置于37℃培养48h，作为一级种子，取一级种子接种于mrs液体培养基中，置于37℃培养48h，即为二级种子。植物乳杆菌二级种子接种到发酵罐中，进行液体深层培养，液体培养基为mrs，接种量为5％，装液量80％，37℃和ph值7.0条件下静置培养，待活菌数达1.0×109cfu/ml时，取植物乳杆菌培养液体100ml，5000rpm离心10-15min，100ml无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量18w/v％，制备料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度75℃、入口温度120℃、入料速度1000ml/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂b；步骤c、将枯草芽孢杆菌sy6菌种接种营养肉汤中，置于37℃培养36h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于营养琼脂斜面若干支，置于37℃培养36h，作为一级种子，取一级种子接种于营养肉汤中，置于37℃培养36h，即为二级种子。枯草芽孢杆菌二级种子接种到发酵罐中，进行液体深层培养，液体培养基为营养肉汤，接种量为3％，装液量70％，在185rpm/min、35℃和ph值7.0条件下培养，待活菌数达1.0×109cfu/ml时，取枯草芽孢杆菌培养液体100ml，5000rpm离心15min，100ml无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量20％w/v％，制备料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度85℃、入口温度150℃、入料速度1500ml/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂c；步骤d、将解淀粉芽孢杆菌ssyb菌种接种营养肉汤中，置于37℃培养36h，完成活化，然后划线接种于营养琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种于营养琼脂斜面若干支，置于37℃培养36h，作为一级种子，取一级种子接种于营养肉汤中，置于37℃培养36h，即为二级种子。枯草芽孢杆菌二级种子接种到发酵罐中，进行液体深层培养，液体培养基为营养肉汤，接种量为3％，装液量70％，在185rpm/min、35℃和ph值7.0条件下培养，待活菌数达1.0×109cfu/ml时，取解淀粉芽孢杆菌培养液体100ml，5000rpm离心15min，100ml无菌生理盐水重悬菌泥，脱脂乳保护剂添加量20％w/v％，制备料液。设定喷雾干燥机各项喷雾干燥条件参数：出口温度85℃、入口温度150℃、入料速度1500ml/h，进行喷雾干燥，得到粉状制剂c；步骤e、然后将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c、粉状制剂d按质量比1:1:1:1混合；即得到防治猪腹泻生物制剂。1、复合益生菌制剂防治猪腹泻生物制剂应用试验(1)防治猪腹泻生物制剂对仔猪生长性能及腹泻影响在现地相关猪场进行防治猪腹泻生物制剂应用试验，选择28日龄健康仔猪18000头，断奶日龄为35d。健康仔猪随即分成3组，每组6000头。其中，试验1组：饮水饲喂液态制剂；试验2组：拌料饲喂粉状制剂；对照组：不添加制剂，试验周期为2周。防治猪腹泻生物制剂饲喂量为1.0×108cfu/d/头。试验期内记录每天每组投料量，计算头均日耗料量及饲料效率(头均增重/头均耗料量×100％)。记录每天各组猪出现腹泻的头数，计算腹泻率。腹泻率＝试验期内腹泻病发生次数之和/试验天数×试验头数×100％。实验结果表明，试验组仔猪头均日增重均高于对照组(p<0.05)，且料重比也低于对照组(p<0.05)，由此可见，饲喂防治猪腹泻生物制剂可在一定程度上提高仔猪生长性能。此外，试验1组料重比略低于试验2组(p>0.05)，由此可见，在增重及料重比方面，液态制剂与粉状制剂应用效果基本相同，但明显优于对照组，具体结果见表1。表1复合活菌制剂对仔猪生长性能的影响在预防仔猪腹泻方面，试验组仔猪腹发病率均低于对照组(p<0.05)，由此可见，饲喂防治猪腹泻生物制剂可在一定程度上预防仔猪腹泻。此外，试验1组仔猪腹泻率低于试验2组(p>0.05)，液态制剂和粉状制剂预防仔猪腹泻效果基本相同。具体结果见表2。表2防治猪腹泻生物制剂对仔猪腹泻率的影响组别头数试验周期(d)腹泻发病率(％)试验1组6000147.6±0.3c试验2组6000149.8±0.4b对照组60001421.0±1.3a(2)复合活菌制剂对仔猪腹泻的治疗效果选择28日龄腹泻仔猪3000头，随即分为3组，每组1000头。其中，试验1组：应用液态制剂治疗；试验2组：应用粉状制剂治疗；对照组：应用抗生素治疗。治疗周期为3d，防治猪腹泻生物制剂治疗量为1.0×109cfu/d/头。实验结果表明，对照组仔猪腹泻治疗的有效率和治愈率均高于试验组(p<0.05)，抗生素治疗仔猪腹泻效果更好，但试验1组试验2组腹泻仔猪治疗有效率达到70％以上，治愈率可达到50％以上，由此可见，在治疗仔猪腹泻方面该防治猪腹泻生物制剂具有一定效果。此外，试验1组仔猪腹泻治疗有效率和治愈率均高于试验2组(p<0.05)，由此可见，在仔猪腹泻治疗方面，液态制剂治疗效果好于粉状制剂。具体结果见表4。表3防治猪腹泻生物制剂治疗仔猪腹泻率的效果组别头数有效率(％)治愈率(％)试验1组100080±3.2b62±2.4b试验2组100073±4.1c56±1.7bc对照组100096±2.8a88±2.2a2、复合益生菌制剂防治猪腹泻生物制剂储存试验取不同批次液态和粉状制剂，其中液体制剂成品中益生菌活菌总数达到109cfu/ml以上，粉状制剂成品中益生菌活菌总数达到1012cfu/g以上。分别储存于-20℃，4℃及室温环境中，储存试验时间为12个月，且每月检测制剂中益生菌的总活菌数，参考饲用微生物添加剂相关行业标准，在储存期内制剂成品中活菌数应达到109cfu/ml或g。实验结果表明，在-20℃储存温度条件下，液态制剂可储存至6个月，粉状制剂可储存10个月以上；在4℃储存温度条件下，液态制剂可储存至4个月，粉状制剂可储存8个月；在室温条件下，液态制剂可储存至3个月，粉状制剂可储存6个月。在储存期内液态制剂和粉状制剂成品中活菌总数分别可达到109cfu/ml和109cfu/g。具体结果见表4和表5。表4温度与储存时间对液态制剂活菌数的影响(单位：cfu/ml)储存温度1月2月3月4月5月6月室温4×1093×1091×1095×1088×1072×1074℃5×1094×1093×1092×1095×1082×108-20℃5×1095×1094×1093×1092×1091×109储存温度7月8月9月10月11月12月室温8×1063×1067×1052×1055×1046×1034℃8×1075×1077×1063×1066×1052×105-20℃6×1086×1084×1082×1086×1073×107表5温度与储存时间对粉状制剂活菌数的影响(单位：cfu/g)储存温度1月2月3月4月5月6月室温2×10121×10126×10117×10106×1093×1094℃5×10124×10128×10115×10115×10102×1010-20℃6×10123×10122×10128×10115×10115×1010储存温度7月8月9月10月11月12月室温4×1088×1073×1076×1062×1067×1054℃7×1096×1082×1085×1073×1078×106-20℃3×10107×1095×1092×1094×1082×1083、不同质量比制得的效果具体实施方式一方法的步骤e中将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c、粉状制剂d按表6中的质量比进行混合，进行腹泻试验，结果如表7所示。表6组别嗜酸乳杆菌植物乳杆菌枯草芽孢杆菌酪酸梭菌1221221222311114212252221表7由表7可知，步骤e中将粉状制剂a、粉状制剂b、粉状制剂c、粉状制剂d按1:1:1:1的质量比对腹泻的治疗效果最好。当前第1页12