本发明属于组织工程皮肤
技术领域：
，具体涉及一种异种脱细胞真皮基质的制备方法。
背景技术：
：烧伤、创伤、上皮癌切除及皮肤疾病等因素造成的皮肤缺损常遗留瘢痕增生和挛缩畸形，严重影响外观和功能。目前，用于修复创面的修复材料除了自体皮、皮瓣外，主要有异体皮、异种皮以及各种人工合成的创面覆盖物。在治疗大面积烧伤患者时，患者自体皮源有限，就需要应用这些皮肤替代物；异体皮来源有限，并有传染疾病的风险，且受到伦理学的制约；人工合成材料技术尚不成熟，抗感染能力较差，且价格昂贵。因此寻求能植入人体内，组织相容好，免疫性低的用于烧伤、整形美容及作为组织填充物的异种真皮是目前国内外研究的热点。脱细胞真皮基质(acellulardermalmatrix，adm)是一种去表皮、脱细胞，无细菌生长、无毒性、无刺激性、无免疫排斥反应，有弹性、质地柔软、不断裂的组织工程学材料，主要应用于组织创面修复。脱细胞真皮基质取材于天然的皮肤组织，经过特殊的理化处理，将组织中可能引起人体植入后的免疫排异反应的成分去除，同时保留了原有组织的立体支架结构，可诱导成纤维细胞、血管内皮细胞长入，具有诱导组织再生的作用，是治疗需要植皮的全层皮肤缺损有效的方法。但是，已有的脱细胞真皮基质生产工艺存在以下不足：不能有效去除异种皮细胞，降低异种皮肤抗原性的同时保留完整的真皮胶原纤维的三维结构；脱细胞真皮基质在制备过程中，透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸肝素等细胞外无定形基质成分也随细胞成分同时被洗出，使胶原支架失去原有的外环境保护，移植于创面后，降解速度较快，存在局部溶解倾向；此外，脱细胞真皮基质在使用时容易容易导致创面感染。因此临床上迫切需要一种低免疫原性、可供移植的皮肤替代物。公开号为cn102580153b的中国专利申请“一种制备脱细胞真皮基质医用组织补片的方法”，将动物皮肤通过制备断层皮片、病毒灭活、脱脂、脱细胞、冻干、裁剪、成型、包装和辐照消毒工艺后得到脱细胞真皮基质医用组织补片，具有脱细胞彻底，对真皮细胞外基质天然结构损害轻的优点。技术实现要素：为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种异种脱细胞真皮基质的制备方法。本发明提供的技术方案为如下：本发明提供一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，其包括以下步骤：(1)选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮机取下大张皮肤，无菌生理盐水清洗，皮鼓反取成0.25～0.5mm的断层皮片，采用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，备用；(2)将步骤(1)制得的断层皮片浸泡于0.5～1.0％(m/v)的邻苯基苯酚钠水溶液中，处理6～8min，无菌生理盐水清洗3～4次，然后加入1～2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液，超声震荡处理6～12h，每2h更换一次溶液，其中加入的三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液与断层皮片的重量比为10:1，得到去表皮的真皮；(3)将步骤(2)得到的去表皮的真皮置于0.2～0.4％tritonx-100(v/v)溶液中，室温下振荡洗涤6～12h，用含4000u/l庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，加入脱细胞处理液，在37℃条件下作用12～24h，所述的脱细胞处理液与去表皮的真皮的重量比为10:1，用含4000u/l庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，再用无菌生理盐水清洗3～4次，得到脱细胞真皮；(4)将步骤(3)得到的脱细胞真皮放入转鼓中，然后分次加入温度为35℃、ph为5.7的羧甲基壳聚糖溶液，反应30min后调节ph值至5.0，再反应75min，调节ph值至6.8，处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用无菌生理盐水洗2次，每次15分钟，洗后控干水，得到脱细胞真皮基质；(5)将经步骤(4)处理得到的脱细胞真皮基质浸泡于体积浓度为0.1～0.3％(v/v)的戊二醛溶液中交联15～30min，无菌生理盐水冲洗10～15min，然后置于柔化剂溶液中浸泡30～60min，清洗后再放入保湿剂溶液中，37℃保温处理30～60min，最后用无菌生理盐水充分冲洗去除残留；(6)将经步骤(5)处理得到的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，成型包装，再经γ射线辐照消毒灭菌，即为成品。进一步地，上述步骤(2)中的邻苯基苯酚钠水溶液含有0.01～0.1％(v/v)的二丙二醇二甲醚；三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液含有1～3％(m/v)三聚磷酸钠、0.01～0.04％(v/v)的二丙二醇二甲醚和0.1～0.4％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯。上述步骤(3)中的脱细胞处理液为含有0.025％(m/v)的胰酶、0.02％(m/v)edta、0.4～1.0％(m/v)十二酰基甘氨酸钠和0.1～1.0％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，浓度为1～2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液。进一步地，所述步骤(4)中的脱细胞真皮与羧甲基壳聚糖溶液的重量比为1:2～4。进一步地，所述步骤(5)中的柔化剂溶液浓度为1～5％(m/v)，所述的柔化剂选自十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十七烷基-n-氨乙基咪唑啉环氧丙烷、十八烷基二甲基苄基氯化铵中的至少一种。进一步地，所述步骤(5)中保湿剂溶液浓度为0.2～1％(m/v)，所述的保湿剂选自丙三醇、透明质酸、吡咯烷酮羧酸钠、二甲基氨酸脯氨酸、十八烷基二甲基氧化胺中的至少一种。本发明所述的巴马香猪皮断层皮片经含二丙二醇二甲醚的邻苯基苯酚钠水溶液处理后，可有效杀灭皮片表面上的细菌和病毒，所述的邻苯基苯酚钠在二丙二醇二甲醚作用下，深入到皮片的皮脂腺下，发挥较佳的防腐保鲜作用。本发明以含有1～3％(m/v)三聚磷酸钠、0.01～0.04％(v/v)的二丙二醇二甲醚和0.1～0.4％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，浓度为1～2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液作为断层皮片脱去表皮的处理液，可使皮片的透明角蛋白层充分脱落，并可防止脱落的透明角蛋白层与真皮发生粘连，充分除去皮片的表皮。同时所述的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯可有效防止脱去表皮后裸露的真皮层上的胶原纤维、弹力纤维、网状纤维等成分在三聚磷酸钠作用下发生水解，引发真皮胶原纤维的三维结构坍塌现象，保持较佳的立体构造。此外，本发明以含有0.025％(m/v)的胰酶、0.02％(m/v)edta、0.4～1.0％(m/v)十二酰基甘氨酸钠和0.1～1.0％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，浓度为1～2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液作为真皮的脱细胞处理液，在十二酰基甘氨酸钠的作用下以较低浓度的胰酶对真皮进行细胞消化，可促使细胞充分脱落，同时防止高浓度的胰酶对真皮的无定形基质如透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸肝素的消化溶解作用，提高真皮胶原纤维的三维结构的稳定性。所述的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯可有效防止脱落的真皮细胞凝聚成团，保持较佳的悬浮性，有利于清洗去除脱细胞。进一步地，本发明将制得的脱细胞真皮与羧甲基壳聚糖进行反应，制成的脱细胞真皮基质具有较佳的生物相容性，可有效促进创面愈合的同时发挥较佳的抗菌性，改善脱细胞真皮基质应用的效果，同时将制得的脱细胞真皮基质与柔化剂和保湿剂进行处理，使脱细胞真皮基质更贴近天然的皮肤质地，提高其使用的依从性。本发明人还请求保护根据上述的异种脱细胞真皮基质的制备方法制得的异种脱细胞真皮基质。本发明提供的异种脱细胞真皮基质的制备方法还适用于以羊皮、牛皮、兔皮等为原料的异种脱细胞真皮基质的制备。与现有技术相比，本发明的优势在于：本发明提供的一种异种脱细胞真皮基质的制备方法可使断层皮片的透明角蛋白层充分脱落，并可防止脱落的透明角蛋白层与真皮发生粘连，充分除去皮片的表皮，并可使脱表皮的真皮细胞充分脱落，降低免疫原性。同时可有效防止脱去表皮后裸露的真皮层上的胶原纤维、弹力纤维、网状纤维发生水解，引发真皮胶原纤维的三维结构坍塌现象，保持较佳的立体构造，提高真皮胶原纤维的三维结构的稳定性。制得的脱细胞真皮基质具有较佳的生物相容性，可有效促进创面愈合的同时发挥较佳的抗菌性，改善脱细胞真皮基质应用的效果，同时更贴近天然的皮肤质地，提高其使用的依从性。具体实施方式以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。实施例1一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，其包括以下步骤：(1)选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮机取下大张皮肤，无菌生理盐水清洗，皮鼓反取成0.30mm的断层皮片，采用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，备用；(2)将步骤(1)制得的断层皮片浸泡于含有0.02％(v/v)的二丙二醇二甲醚，浓度为0.8％(m/v)的邻苯基苯酚钠水溶液中，处理6min，无菌生理盐水清洗3次，然后加入含有2％(m/v)三聚磷酸钠、0.02％(v/v)的二丙二醇二甲醚和0.2％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，浓度为2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液，超声震荡处理8h，每2h更换一次溶液，其中加入的三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液与断层皮片的重量比为10:1，得到去表皮的真皮；(3)将步骤(2)得到的去表皮的真皮置于0.25％tritonx-100(v/v)溶液中，室温下振荡洗涤8h，用含4000u/l庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，加入含有0.025％(m/v)的胰酶、0.02％(m/v)edta、0.4％(m/v)十二酰基甘氨酸钠和0.6％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，浓度为2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液，在37℃条件下作用24h，所述的脱细胞处理液与去表皮的真皮的重量比为10:1，用含4000u/l庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，再用无菌生理盐水清洗4次，得到脱细胞真皮；(4)将步骤(3)得到的脱细胞真皮放入转鼓中，然后分次加入温度为35℃、ph为5.7的羧甲基壳聚糖溶液，所述脱细胞真皮与羧甲基壳聚糖溶液的重量比为1:3，反应30min后调节ph值至5.0，再反应75min，调节ph值至6.8，处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用无菌生理盐水洗2次，每次15分钟，洗后控干水，得到脱细胞真皮基质；(5)将经步骤(4)处理得到的脱细胞真皮基质浸泡于体积浓度为0.2％(v/v)的戊二醛溶液中交联20min，无菌生理盐水冲洗15min，然后置于浓度为2％(m/v)十六烷基三甲基氯化铵溶液中浸泡40min，清洗后再放入浓度为0.5％(m/v)二甲基氨酸脯氨酸溶液中，37℃保温处理40min，最后用无菌生理盐水充分冲洗去除残留；(6)将经步骤(5)处理得到的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，成型包装，再经γ射线辐照消毒灭菌，即为成品。实施例2一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，其包括以下步骤：(1)选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮机取下大张皮肤，无菌生理盐水清洗，皮鼓反取成0.35mm的断层皮片，采用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，备用；(2)将步骤(1)制得的断层皮片浸泡于含有0.04％(v/v)的二丙二醇二甲醚，浓度为0.6％(m/v)的邻苯基苯酚钠水溶液中，处理8min，无菌生理盐水清洗4次，然后加入含有3％(m/v)三聚磷酸钠、0.02％(v/v)的二丙二醇二甲醚和0.1％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，浓度为2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液，超声震荡处理12h，每2h更换一次溶液，其中加入的三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液与断层皮片的重量比为10:1，得到去表皮的真皮；(3)将步骤(2)得到的去表皮的真皮置于0.2％tritonx-100(v/v)溶液中，室温下振荡洗涤12h，用含4000u/l庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，加入含有0.025％(m/v)的胰酶、0.02％(m/v)edta、0.8％(m/v)十二酰基甘氨酸钠和0.6％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，浓度为2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液，在37℃条件下作用12h，所述的脱细胞处理液与去表皮的真皮的重量比为10:1，用含4000u/l庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，再用无菌生理盐水清洗4次，得到脱细胞真皮；(4)将步骤(3)得到的脱细胞真皮放入转鼓中，然后分次加入温度为35℃、ph为5.7的羧甲基壳聚糖溶液，所述脱细胞真皮与羧甲基壳聚糖溶液的重量比为1:2，反应30min后调节ph值至5.0，再反应75min，调节ph值至6.8，处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用无菌生理盐水洗2次，每次15分钟，洗后控干水，得到脱细胞真皮基质；(5)将经步骤(4)处理得到的脱细胞真皮基质浸泡于体积浓度为0.2％(v/v)的戊二醛溶液中交联20min，无菌生理盐水冲洗15min，然后置于浓度为4％(m/v)十八烷基二甲基苄基氯化铵溶液中浸泡30min，清洗后再放入浓度为0.8％(m/v)吡咯烷酮羧酸钠溶液中，37℃保温处理30min，最后用无菌生理盐水充分冲洗去除残留；(6)将经步骤(5)处理得到的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，成型包装，再经γ射线辐照消毒灭菌，即为成品。对比例1对比例1所述的异种脱细胞真皮基质的制备方法与实施例1基本相同，区别在于，所述步骤(2)中的断层皮片脱去表皮的处理液不含聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，即以含有1～3％(m/v)三聚磷酸钠、0.01～0.04％(v/v)的二丙二醇二甲醚，浓度为1～2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液作为断层皮片脱去表皮的处理液。对比例2对比例2所述的异种脱细胞真皮基质的制备方法与实施例1基本相同，区别在于，所述步骤(3)中的真皮的细胞处理液不含十二酰基甘氨酸钠，即以含有0.025％(m/v)的胰酶、0.02％(m/v)edta和0.1～1.0％(m/v)聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，浓度为1～2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液作为真皮的脱细胞处理液。对比例3对比例3所述的异种脱细胞真皮基质的制备方法与实施例1基本相同，区别在于，所述步骤(3)中的真皮的细胞处理液不含聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，即以含有0.025％(m/v)的胰酶、0.02％(m/v)edta和0.4％(m/v)十二酰基甘氨酸钠，浓度为2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液作为真皮的脱细胞处理液。试验例一、异种脱细胞真皮基质的生物力学检测采用instron4302拉伸机，夹持标本用的特制夹头，适用100n的传感器，载荷范围设定为20n，分别对实施例1-2、对比例1-3制得的脱细胞真皮基质进行强度和应力测试，其中强度测试以10mm/min速度将脱细胞真皮基质拉断，记录此时力大小，各标本强度均以标本被拉断瞬间时的力除以标本的初始截面积表示；应力测试：将脱细胞真皮基质拉到2.0mpa柯希应力时卸载，预调3次，记录第4次，对在生理范围内的应力(300kpa)时测出其对应的弹性模量(应变量)，并作出相应应力-应变曲线，通过应力-应变曲线而得到延伸率参数。试件延伸率为应力等于300kpa时弹性模量斜率与应变轴交叉点，结果见下表1所示。表1生物力学检测结果组别强度(mpa)延伸率(％)实施例15.842±0.254*#▽1.078±0.038*#▽实施例25.906±0.312*#▽1.092±0.045*#▽对比例15.275±0.2200.896±0.032对比例25.321±0.1920.905±0.027对比例35.280±0.2260.874±0.030注：与对比例1比较，*p<0.05，与对比例2比较，#p<0.05，与对比例3比较，▽p<0.05。由上表可知，对比例1-3制得的脱细胞真皮基质的强度和延伸率与实施例1-2比较，均有不同程度的降低，表明对比例1-3制得的脱细胞真皮基质发生了不同程度的降解，使基质的强度降低，胶原纤维结构遭到破坏，使基质的延伸率大大降低。试验例二、异种脱细胞真皮基质的细胞相容性检测将新生3d内新西兰大白兔来源的软骨细胞和骨髓基质细胞以3:7比例共培养至第3代作为种子细胞，分别接种于实施例1-2、对比例1-3制得的脱细胞真皮基质上，于37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养48h，扫描电镜观察细胞在基质上黏附情况。同时以接种于脱细胞真皮基质上进行培养的种子细胞作为实验组，单纯种子细胞作为对照组，培养2周后，通过rt-pcr检测ⅱ型胶原mrna表达，引物由博奥生物技术有限公司合成。引物序列：ⅱ型胶原上游引物：5'-accaaagggacagaaag-3'，下游引物：5'-acagcataacatggggcttc-3'，产物长度：470bp；β-actin上游引物：5'-agtgcgacgtggacatccttg-3'，下游引物：5'-tggctctaacagtccgcctagagcta-3'，产物长度302bp。反应条件：94℃预变性2min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。取5mlpcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统扫描照相。scnimage图像分析软件测定灰度值，以ⅱ型胶原与β-actin灰度值的比值作为ⅱ型胶原mrna的相对表达量。每组6个样本。结果下表2所示。表2细胞相容性检测结果注：与对比例1比较，*p<0.05，与对比例2比较，#p<0.05，与对比例3比较，▽p<0.05。由上表可知，本发明实施例1-2制得的脱细胞真皮基质可有效维持共培养种子细胞的生长状态，与没有共培养的种子细胞的生长状态比较(对照组)差异不显著。而对比例1-3制得的脱细胞真皮基质对共培养种子细胞的生长状态均有一定的影响，出现少量的细胞漂浮，且个别细胞形状不规则、轮廓不清晰，细胞生长状态不好。试验例三、异种脱细胞真皮基质抗原成分检测采用免疫组化半定量分析本发明实施例1-2和对比例1-3制得的异种脱细胞真皮基质的高免疫原性成分：ⅳ胶原蛋白、中层纤连蛋白、层粘连蛋白，结果见下表3-5所示。表3ⅳ胶原蛋白免疫组化染色半定量检测结果(n)等级实施例1实施例2对比例1对比例2对比例3-1010655+00343++00112+++00000表4中层纤连蛋白免疫组化染色半定量检测结果(n)等级实施例1实施例2对比例1对比例2对比例3-1010765+00233++00112+++00000表5层粘连蛋白免疫组化染色半定量检测结果(n)由上表可知，本发明实施例1-2制得的脱细胞真皮基质基本完全去除了ⅳ胶原蛋白、中层纤连蛋白、层粘连蛋白等高免疫原性成分，同时保持真皮胶原支架的正常组织结构，在一定程度上降低了真皮基质的免疫原性，提高真皮基质使用的安全性。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12