载泰能羟基磷灰石‑酶解骨胶原蛋白纳米人工骨的制作方法

本发明属于医用材料，涉及一种载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白纳米人工骨。

背景技术：

慢性创伤性骨髓炎多为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等革兰氏阳性、革兰氏阴性菌感染，这些耐药细菌可以在细胞表面产生多糖蛋白复合物，形成生物膜包裹细菌，保护细菌。要杀灭保护在生物蛋白膜内的细菌，到达骨髓炎病灶的抗生素必须对上述致病细菌敏感，而且病灶局部抗生素浓度必须高于致病菌最低抑菌浓度许多倍，全身静脉滴注抗生素难以达到这样的治疗要求。与此同时，骨髓炎病灶清除后，会残留留空腔，需要植骨材料填充骨腔。

为了弥补全身用药的不足，以及同时达到植骨的作用，各国学者对载抗生素人工骨进行了多年研究。目前临床应用较多的载抗生素人工骨是医用型caso4，它由全球最大的骨科生物材料生产公司wright研制，其基础晶体是α-半水硫酸钙，水溶性抗生素能够和它结合成固体植入物，而不影响抗菌效果。因此临床上多将万古霉素或庆大霉素与α-半水硫酸钙混合，制成载万古霉素/载庆大霉素硫酸钙人工骨，广泛应用于治疗骨髓炎患者。

但是载万古霉素硫酸钙人工骨只针对金黄色葡萄球等革兰氏阳性菌感染的骨髓炎，载庆大霉素人工骨也只对普通的非耐药革兰氏阴性菌感染骨髓炎有效；对于耐药型大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等革兰氏阴性菌感染的骨髓炎，上述两种载抗生素人工骨并不敏感，而上述耐药型革兰氏阴性菌感染的骨髓炎在临床上占了将近42％。所以国际上流行通用的载万古霉素和庆大霉素硫酸钙人工骨已经远远满足不了，临床上治疗耐药型革兰氏阴性菌感染骨髓炎的需要。为了针对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等耐药型革兰氏阴性感染的骨髓炎，国內外曾有学者在硫酸钙人工骨中加入新型抗生素泰能，即亚胺培南/西司他丁；因为亚胺培南/西司他丁是碳青霉烯类抗生素，它对革兰氏阴性菌敏感，尤其是对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等骨髓炎中的耐药菌临床有效率达93％。学者也希望通过在人工骨中加载亚胺培南，达到治疗耐药型革兰氏阴性菌感染骨髓炎的目的。但是，将泰能(亚胺培南/西司他丁)加载至硫酸钙，合成载抗生素硫酸钙人工骨并不简单。因为，亚胺培南与α-半水硫酸钙混合后不能凝固成型，而是变成粉末；而粉末状载亚胺培南硫酸钙人工骨放置于患者骨髓炎病灶中，一经骨髓腔内血液冲刷，立即流失；无法达到缓释抗生素，治疗骨髓炎的效果。

而且，载万古霉素/庆大霉素硫酸钙人工骨还有一个致命缺点就是：其人工骨的化学成分和分子结构与人类天然骨组织并不一致，并不能替代自身骨组织植骨。因为，人类自身天然骨组织由有机大分子i型胶原蛋白和无机矿物质羟基磷灰石钙晶体生物矿化组成；羟基磷灰石钙晶体呈片状镶嵌在胶原纤维中，沿着胶原纤维的长轴纵向生物矿化。而美国wright公司所研发的载抗生素半水硫酸钙人工骨，其分子方程式为1/2h2o.caso4，只是单纯的无机物，不含有有机大分子i型胶原蛋白，更不用说i型胶原蛋白与羟基磷灰石钙生物矿化的分子结构；无论是其化学成分，还是分子结构都与天然骨组织相去甚远。因此，如何研发与人类自体骨组织化学成分、分子结构接近的，i型胶原蛋白/羟基磷灰石钙骨移植材料，成为全世界骨组织工程学学者孜孜以求的目标。

国外有学者用皮肤、肌腱等软组织上的i型胶原蛋白进行生物矿化，以合成i型胶原蛋白/羟基磷灰石钙人工骨材料，但是其生物矿化程度不如人体自身骨组织。因为，虽然骨胶原蛋白与皮肤、肌腱等软组织上的胶原蛋白同属于i型胶原蛋白，都由[α1(i)]2α2(i)构成，但是每条肽链上的氨基酸残基上却存在着差异，骨i型胶原蛋白含有大量的磷酸丝氨酸残基、乳酸根以及谷氨酸残基；由于钙的电荷与离子半径之比较大，易与磷酸丝氨酸的磷酸基氧、羧基谷氨酸的羧基氧，以及乳酸根的糖羟基氧结合；从而富集高浓度钙离子，成为羟基磷灰石晶核形成和生长的部位。而肌腱等软组织上的i型胶原蛋白含这类氨基酸残基较少，所以用皮肤、肌腱等组织提取的i型胶原蛋白进行生物矿化，其胶原内的矿化程度也低于天然骨组织。因此本发明不用肌腱等软组织上的i型胶原蛋白进行生物矿化，而是直接从骨组织中提取i型胶原蛋白，骨胶原蛋白所含有的现成磷酸丝氨酸残基、乳酸根以及谷氨酸残基，可以直接为生物矿化提供晶核，从而促进胶原的生物矿化。

国际上胶原的提取方法主要有：碱法、酸法、盐法、酶法。(1)碱法提取：由于碱容易造成i型胶原蛋白三螺旋结构上的肽键水解，因此得到的水解产物相对分子质量较小，甚至是明胶，而非胶原。水解严重时，还会产生d型、l型氨基酸消旋混合物。因为不对称碳原子经过对称状态的中间阶段，发生消旋现象，并转变为d型和l型的等物质量的混合物。其中，若d型氨基酸多于l型氨基酸，则会抑制l型氨基酸的吸收。而有些d型氨基酸是有毒的，有的甚至有致癌、致畸和致突变作用。因此碱法不适合用于生物医用材料的胶原蛋白的提取。(2)盐法提取：常用的中性盐有氯化钠、乙酸钠、氯化钾、柠檬酸盐。而一般情况下，可采用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析，以沉淀出不同类型的胶原蛋白。有些中性盐会降低i型胶原蛋白构象稳定性，盐法提取胶原蛋白也不能保证其三螺旋结构的稳定，因此这种方法受到一定的限制。(3)酸法提取：就是利用低浓度的酸性条件破坏胶原分子间的希夫碱和盐键，将失去交联的胶原分子溶解出来，从而提取胶原。这样提取的胶原蛋白称为酸溶性胶原蛋白。常用的酸溶剂集中于乙酸。但是酸处理后胶原的溶解量很少，酸法提取胶原的产率过低，不适合生物医用材料的大批量生产。(4)酶法提取：是利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜酶等胶原酶在一定的反应条件下提取胶原蛋白，酶只作用于胶原蛋白的非螺旋端肽，不会改变其三螺旋结构，保证了i型胶原分子完整稳定的三螺旋结构。故本发明用酶法提取骨胶原。

而且从i型胶原蛋白的免疫原性来看，其免疫原性来源于三点，一是α螺旋多肽链中脯氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸的重复序列；二是α螺旋多肽链三维空间结构；以上两点各个物种之间差别非常微小，最主要的免疫原性还是来自第三点：i型胶原蛋白分子链两端的非螺旋结构，即-n端残基和-c端残基。而酶法提取胶原，恰恰可以水解切除i型胶原蛋白分子链两端的-n端残基和-c端残基，大大降低了i胶原蛋白分子的抗原性。尤其是在酸性条件下，用胃蛋白酶处理胶原，不仅使胶原肽链的末端非螺旋区水解，而且还可促使被切除末端肽的胶原分子更加可溶，提高胶原蛋白的产率。所以本发明选择在酸性条件下，以胃蛋白酶水解提取i型胶原蛋白，并且选择以猪股骨皮质骨作为i型胶原蛋白的来源，因为猪与人类的各系统器官以及基因组相近，使提取的i型胶原蛋白免疫原性更小。

因此本发明通过胃蛋白酶，水解猪骨；猪骨酶解成骨胶原蛋白；接着加载泰能(亚胺培南/西司他丁)，然后对骨胶原蛋白进行生物矿化，从而形成载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨，以针对骨髓炎耐药型革兰氏阴性致病菌的感染，以及植骨的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是针对目前临床上应用的载万古霉素/庆大霉素硫酸钙人工骨，其化学成分和分子机构与人类天然骨组织不符；而且无法加载针对耐药型革兰氏阴性致病菌敏感的抗生素，亚胺培南/西司他丁。同时，针对目前国际上制备仿生骨的i型胶原蛋白，多从皮肤、肌腱等软组织中提取，而非真正从骨组织中提取。本发明通过胃蛋白酶，水解猪骨；猪骨酶解成骨胶原蛋白；接着加载泰能(亚胺培南/西司他丁)，然后将对骨胶原蛋白进行生物矿化，从而形成载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨。其化学成分和分子机构与天然骨组织一致，并能释放出对骨髓炎耐药型革兰氏阴性致病菌敏感的抗生素。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白纳米人工骨，主要由泰能加载在羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白纳米人工骨构成，其中羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白纳米人工骨为羟基磷灰石晶体沿着骨胶原纤维矿化生长，经生物矿化最终形成仿生骨；其中骨胶原纤维具有特征性明暗间隔周期性条纹结构，即d-band结构。

进一步地，泰能与羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白纳米人工骨的质量比为7～10:100。

进一步地，骨胶原纤维与羟基磷灰石晶体的质量比为0.5～1:4。

上述载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白纳米人工骨，采用以下方法制备而成：

步骤(1)、骨胶原蛋白的制备

将新鲜富含骨胶原蛋白的组织脱脂、脱钙处理，破碎后得到所需的骨料；

将预处理后的骨料加入到ph值为3的0.1m醋酸溶液中，酶解得到透明、黏稠的骨胶原蛋白；骨料与醋酸溶液的质量体积比为1g：10～20ml；

酶解条件是每克骨料加入200～250mg胃蛋白酶，酶解温度为30～37℃，酶解时间为30～60天；

步骤(2)、加载泰能：

将步骤(1)获得的骨胶原蛋白与泰能溶液混合，充分搅拌后置于37℃恒温箱中，静置24小时，获得加载泰能的骨胶原蛋白。

所述的泰能溶液为每0.5～1g泰能与100ml0.9wt％生理盐水混合而成；

骨胶原蛋白与泰能溶液的体积比为10～9：1；

步骤(3)、骨胶原蛋白胶体的制备：

将步骤(2)获得的加载泰能的骨胶原蛋白，经氨气扩散1小时，然后再放入戊二醛进行交联；交联1小时后，骨胶原蛋白自组装成果冻样胶体；最后将胶体放置在去离子水中浸泡1小时，接着再反复冲洗3遍，洗去多余的戊二醛，得到加载泰能的骨胶原蛋白胶体。

加载泰能的骨胶原蛋白与戊二醛的质量体积比为1g：10～20ml。

交联温度为20～25℃。

步骤(4)、生物矿化：

将步骤(3)获得的载泰能的骨胶原蛋白胶体浸泡在矿化液中，进行生物矿化，矿化7～9天，从而形成载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨。

矿化液的配置：钙液25ml倒入烧杯中，滴入paa浓度350ug/ml；滴加1m的hcl，调节ph至7.4。然后缓慢滴入磷液25ml，约16滴/分钟，配置矿化液。

25ml钙液由以下组分构成：10mmcacl2.2h2o、150mmnacl、50mm.tris、0.02wt％nan3；

25ml磷液:6mmna2hpo4；

抑菌圈实验显示：将上述制备得到的载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨放置在耐药型革兰氏阴性菌大肠杆菌的培养基中，在载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨周围形成抑菌圈。在模拟体液缓释实验中：载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨，缓释的亚胺培南药物浓度为1ug/ml,是亚胺培南/西司他丁对大肠杆菌的最低抑菌浓度0.125ug/ml的8倍，远大于最低抑菌浓度。

本发明的有益效果是：

1.本发明通过胃蛋白酶，酶解猪骨；使猪骨水解成i型胶原蛋白，此i型胶原蛋白适合羟基磷灰石钙的生物矿化，而且酶解切除了i型胶原蛋白分子链两端的-n端残基和-c端残基，大大降低了i胶原蛋白分子的抗原性。而且载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨，所含的胶原蛋白直接从骨组织提取，而且能组装成胶原纤维，此胶原纤维具有特征性明暗间隔周期性条纹结构，即d-band结构；与人类骨组织的i型胶原蛋白纤维的d-band结构一致，并能促进生物矿化。

2.人类自身骨组织是由有机大分子i型胶原蛋白和无机羟基磷灰石钙组成，在分子结构上，羟基磷灰石钙晶体是以i型胶原蛋白纤维为模板，镶嵌在胶原纤维分子间隙，沿着胶原纤维的长轴纵向矿化生长。而本发明，先是合成与人类自身骨组织中i型胶原蛋白纤维的d-band结构一致的，i型胶原蛋白胶体。然后，模拟生物矿化，羟基磷灰石晶体沿着胶原蛋白纤维矿化生长，最终形成生物矿化仿生骨。其化学成分和分子结构与人类自身骨组织一致，可以作为植骨材料，填充骨髓病灶清除后残留的空腔。

3.针对耐药型革兰氏阴性致病菌感染的难治型骨髓炎，将药敏高度敏感的碳青霉烯类抗生素(亚胺培南/西司他丁)与人工骨结合；合成载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨。此人工骨可以缓释出亚胺培南，抑制大肠杆菌等耐药型革兰氏阴性致病菌的感染；从而弥补了目前临床上使用的载万古霉素/庆大霉素硫酸钙人工骨，不能涵盖骨髓炎所有菌谱的缺点。

附图说明

图1为载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨抑菌实验结果；

图2为载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨的透射电子显微镜图；

图3为载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨的电子衍射图像。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的分析。

实施例1：

步骤(1)、骨胶原蛋白的制备

1.1将新鲜猪股骨，去除两端关节的周围软组织，截取长骨，再去除骨膜、骨端松质骨，刮除骨髓，用水清洗去除骨中大量的脂肪和血红蛋白，剩余管状长骨。清洗后的骨料在密闭的脱脂容器中，控制温度60～65℃，采用石油醚逆流循环的方式回流3～4h，除去骨料中的油脂。

1.2脱钙：将步骤1.1处理后的猪骨放入0.5～1mol/l盐酸中脱钙，每1g猪骨颗粒，加入10～20ml盐酸；每隔48～72小时换一次盐酸，经过14～16天脱钙，骨料软化，将脱钙软化后的骨料再剪成一块块小碎片。

1.3脱脂：将碎骨料装在密闭的脱脂容器中，控制温度60～65℃，采用石油醚逆流循环的方式回流3～4h，除去骨料中剩余的油脂，得到脱钙脱脂的骨料。

1.4酶解：将脱钙脱脂的骨颗粒，放在ph值＝3的0.1m醋酸溶液中，加入胃蛋白酶。每1g猪骨颗粒，浸泡在20ml醋酸溶液中，加入200～250mg胃蛋白酶；静置在温度30～37度的恒温箱中，酸性条件下，酶解猪骨30～60天；骨颗粒酶解成为透明、黏稠的骨胶原蛋白(图3)。

步骤(2)、加载泰能：

取0.5～1g泰能，与100ml0.9％nacl混合；泰能溶解于生理盐水中，形成泰能溶液。取9～10ml骨胶原蛋白与1ml泰能溶液混合，充分搅拌后；放置于30～37度恒温箱中，静置24～48小时；泰能加载至骨胶原蛋白。

步骤(3)、骨胶原蛋白胶体的制备：

将加载了泰能的骨胶原蛋白，经氨气扩散1～2小时，然后再放入0.05％戊二醛进行交联；每1ml载泰能骨胶原蛋白浸泡在戊二醛中，交联1小时后，骨胶原蛋白自组装成果冻样胶体；最后将胶体放置在去离子水中浸泡1小时，接着再反复冲洗3遍，洗去多余的戊二醛，完成胶体的制备。

步骤(4)、生物矿化：

吸取已经配好的矿化液倒入小培养皿中，将载泰能骨胶原蛋白胶体浸泡在矿化液中，每5ml骨胶原蛋白胶体加入50ml矿化液，进行生物矿化；矿化7天，从而形成载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨。

矿化液的配置：钙液25ml倒入烧杯中，滴入paa浓度350ug/ml；滴加1m的hcl，调节ph至7.4。然后缓慢滴入磷液25ml，约16滴/分钟，配置矿化液。

25ml钙液由以下组分构成：10mmcacl2.2h2o、150mmnacl、50mm.tris、0.02wt％nan3；

25ml磷液:6mmna2hpo4

抑菌圈实验显示：将上述制备得到的载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨放置在耐药型革兰氏阴性菌大肠杆菌的培养基中，在载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨周围形成抑菌圈(图1)。在模拟体液缓释实验中：载泰能羟基磷灰石-酶解骨胶原蛋白人工骨，缓释的亚胺培南药物浓度为1ug/ml,是亚胺培南/西司他丁对大肠杆菌的最低抑菌浓度0.125ug/ml的8倍，远大于最低抑菌浓度。

图2透射电子显微镜显示：本实施例制备得到的人工骨胶原纤维具有特征性明暗间隔周期性条纹结构，即d-band结构；与天然骨组织的i型胶原蛋白纤维的d-band结构一致。

图3电子衍射图像显示：本实施例制备得到的人工骨内羟基磷灰石钙晶体形成，每个亮环对应一个羟基磷灰石钙晶面，依次是002,211。人工骨在透射电子显微镜下显示：羟基磷灰石晶体嵌入胶原蛋白纤维内部纵向生长，其分子结构与人类自身骨组织一致。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。