雷公藤甲素及其衍生物在制备治疗和/或预防肺损伤疾病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及雷公藤甲素及其衍生物的一种新用途，具体涉及一种雷公藤甲素及其衍生物在制备治疗和/或预防肺损伤疾病的药物中的应用。

背景技术：

急性呼吸道窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ards)是一类临床重症疾病，ards发病原因多样，包括误吸、严重肺部感染等直接病因和严重创伤、弥漫性血管内凝血、休克等间接病因。ards具体发病机制目前尚未完全明了，较为公认的是病原微生物及其它损伤因素破坏呼吸系统组织和细胞、淋巴细胞过度活化，导致促炎/抗炎反应失衡，炎症因子过度释放导致肺毛细血管损伤，引发氧合功能障碍。ards治疗手段有呼吸支持、药物治疗等，这些治疗药物包括糖皮质激素、神经肌肉阻断剂、中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、β2肾上腺素受体激动剂、血管扩张剂等，尽管有很多种类的药物被用于ards的治疗，但多个报道显示ards死亡率仍达到30％～50％。

ards治疗中采用糖皮质激素(glucocorticoid)是为了缓解过度的急性炎症反应，在临床上用途很多，其中一类用途是病毒感染导致的ards治疗，如应用于重症急性呼吸综合征(sars)冠状病毒、h1n1型流感病毒、禽流感病毒引起的ards。但其疗效并未取得广泛认可，多个文献报道显示该类药物用于ards治疗疗效有限，且因为引起股骨头坏死等副反应，限制了其应用范围。甲泼尼龙(methylprednisolone，me)是临床上常用的糖皮质激素类药物，糖皮质激素可以换算成甲泼尼龙当量进行使用，在国内常用于ards的治疗。

中药是我国传统医学最重要的组成部分之一，中药的免疫调节作用已在临床治疗中得到广泛应用。但中药成分复杂，难以标准化、定量化测定其效果。我们使用细胞模型从中药材来源活性分子中筛选具有免疫抑制效应的分子，从208个纯化药物分子发现雷公藤甲素(triptolide，tp)的免疫抑制最强，雷公藤甲素也称为雷公藤内酯醇，分子式为c20h24o6，化学物质登录号为cas#38748-32-2，分子结构式如式(ⅰ)所示：

是一种环氧二萜内酯类化合物，是雷公藤多甙中活性分子之一，是雷公藤多苷的主要有效成分。雷公藤甲素的免疫抑制效应很强，主要应用于类风湿性疾病、肾病综合征、红斑狼疮等自身免疫性疾病及肿瘤治疗，常用的药剂方式有雷公藤片、雷公藤多苷片、昆明山海棠片等。目前，尚未见到雷公藤多苷及雷公藤甲素被用于ards治疗的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种雷公藤甲素及其衍生物在制备治疗和/或预防肺损伤疾病的药物中的应用。

本发明第一方面提供了雷公藤甲素及其衍生物在制备治疗和/或预防肺损伤疾病的药物中的应用。

其中，所述肺损伤疾病包括急性肺损伤疾病或慢性肺损伤疾病。

其中，所述肺损伤疾病包括急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、特发性肺纤维化、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病慢性支气管炎和肺气肿中的至少一种。

其中，所述肺损伤疾病包括病毒感染引起的急性呼吸窘迫综合征。

其中，所述雷公藤甲素及其衍生物作为单一活性成分或与其他药学上可接受的活性成分构成组合物以制备所述药物。

其中，所述其他药学上可接受的活性成分包括甘草次酸、甘草酸铵、甘草合剂、阿魏酸、白藜芦醇、白芍总苷、凤尾草提取物和金钱草提取物中的至少一种。

其中，所述药物包括以下重量份数的组分：

其中，所述药物与其他活性药剂联合使用，所述其他活性药剂包括糖皮质激素药物。

其中，所述药物的给药方式包括局部给药、消化道给药或非消化道给药。

其中，所述药物的给药方式包括口服、注射、呼吸道吸入或经皮给药。

其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的用量按不同用药途径分别为：口服按0.5-10ug/kg体重/日，肌肉或静脉注射按0.1-3ug/kg体重/日，呼吸道吸入按0.01-2ug/kg体重/日。

雷公藤甲素能显著抑制佛波酯(pma)活化的淋巴细胞模型中gfp荧光蛋白(细胞活化胞内指标)和p24抗原(细胞分泌的病毒抗原指标)的升高效应，雷公藤甲素浓度越高，gfp阳性细胞百分比和p24抗原浓度越低，存在负的剂量-效应关系,相关系数分别为-0.954和-0.945,p值分别为0.003和0.004。其原理为雷公藤甲素抑制了pma所导致的g0/g1期细胞比例升高和s期细胞比例下降，促使细胞周期停滞于未活化状态，雷公藤甲素通过调节细胞周期起到抑制淋巴细胞增殖、活化的作用；同时，也起到抑制病毒复制的作用。

附图说明

图1为各浓度雷公藤甲素对细胞周期分布的影响图；

图2为活细胞设门及三种荧光补偿调整分析图；

图3为各剂量雷公藤甲素实验组凋亡/死亡细胞分布图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

除非特殊声明，所有本文中的技术性和科学名词在该发明中和普遍使用的含义相同。尽管有些方法和材料的叙述可以用于本发明的描述。

本文中，“一”用于指一个或多于一个(比如至少一个)。举例说明，“一种成分”的含义是一种成分或多于一种成分。

本文中，“组合”或者“药物组合”指的是本发明中所使用的一种以上药物的混合，使用药物学上可接受的载体。药物组合帮助药物更容易到达病人或实验动物病灶。条款中描述多种技术包括，并不局限于，静脉给药、口服、气雾吸入、肠胃外、眼部、鼻腔、肺部和局部给药。

本文中“疾病”指的是实验动物的健康状态不能维持稳态，所以在本文中疾病不改善，动物的健康状态持续恶化。

本文中“有效剂量”，“药物学有效剂量”和“治疗有效剂量”指非毒理性但足够剂量能够引起所需的生物学结果。这些结果包括减少或减轻疾病的特征症状或减弱疾病的病因，或者向其它生物学系统的良好方向发展。针对个体合适的治疗剂量可根据常规实验数据正常范围得出。

本文中“病人”，“实验对象”，“个体”可以相互转化使用，对于实验动物和实验细胞而言也是如此，体内和体外都一样。在没有限制的实施例中，病人，实验对象和个体指的是人。

本文中，“药物学可接受的”指的是一种材料，比如载体或者稀释剂，他们本身不影响药物的生物学活性，而且相对是无毒的，比如该材料可以注入个体体内而不会引起不好的生物学反应或和其携带的药物发生严重的反应。

本文中，“药物学可接受的载体”指的是药学上可接受的材料，组和或者载体，比如液体，固体填料，缓释剂，稳定剂，分散剂，悬浮剂，稀释剂，赋形剂，增稠剂，溶剂或包封材料，他们的作用是运输本发明中的有效成分，使其在患者体能发挥应有的作用。一般而言，运输是从一个器官，或者身体的某一部分到达另外一个器官或者身体的另外一个部分。每一个载体必须和各个配方成分相兼容，包括发明中的有效成分，使其对患者不产生负面影响。这些材料在药物学上可接受的载体包括：糖类，比如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，以及其衍生物，比如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及其它无毒在药物学上配方相容物质。

本文中，“药物学上可接受的载体”也包括所有的表面涂料，抗菌和抗真菌制剂，吸收延迟剂，和与本发明中有用的化合物的活性相容的类似物，这些在生理学上能被病人所接受。

“药物学上可接受的载体”也可以进一步包括发明中在药物学上可接受的有效盐成分。其它成分也包括制药学上的成分组成，在条例中描述和使用的该项发明，比如在remington制药学科学((genaro,ed.,mackpublishingco.,1985,easton,pa),在此引用作为参考。

本文中，“预防”含义为在给予了药物后未发病的实验者能避免或者延迟和疾病或状况相关的症状发生。

本文中“治疗”或者“治疗过程”定义为使用治疗上的药物，比如本发明中的化合物(单独使用或者跟其它药物联合使用)，用在病人，或者用在病人身体提取分离的组织或者细胞系(比如为了诊断和体外培养)。该病人其具有本文考虑的病症，病症的症状或能发展成本文考虑的病症的可能性，为了治愈，治疗，减轻，改变，减弱，提高或者影响本文考虑的病症和或者发展出该病症状的可能性。这些治疗可以根据不同药物基因组学的最新知识在适当情况下量体裁衣。

本发明实施方式提供了雷公藤甲素及其衍生物在制备治疗和/或预防肺损伤疾病的药物中的应用。

本发明实施方式中，所述肺损伤疾病包括急性肺损伤疾病或慢性肺损伤疾病。可选地，所述肺损伤疾病包括肺部急性炎症性疾病。进一步可选地，所述肺损伤疾病包括急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、特发性肺纤维化、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病慢性支气管炎和肺气肿中的至少一种。具体地，所述肺损伤疾病包括病毒感染引起的急性呼吸窘迫综合征。

本发明实施方式中，所述雷公藤甲素的衍生物包括雷公藤氯内酯醇、琥珀酰雷公藤甲素单酯钠、2-甲胺基乙酸雷公藤甲素酯柠檬酸盐和5-羟基雷公藤内酯醇中的至少一种。

本发明实施方式中，所述雷公藤甲素及其衍生物作为单一活性成分或与其他药学上可接受的活性成分构成组合物以制备所述药物。可选地，所述其他药学上可接受的活性成分包括甘草次酸、甘草酸铵、甘草合剂、阿魏酸、白藜芦醇、白芍总苷、凤尾草提取物和金钱草提取物中的至少一种。本发明将雷公藤甲素与甘草次酸等成分组合使用，可以降低雷公藤甲素的毒性。可选地，雷公藤甲素及其衍生物与所述其他药学上可接受的活性成分的摩尔比为1:1-1:10。

本发明实施方式中，所述雷公藤甲素及其衍生物在制备治疗和/或预防肺损伤疾病的药物中的应用的具体形式可以为雷公藤片、雷公藤多苷片或昆明山海棠片。

本发明实施方式中，所述药物与其他活性药剂联合使用。其它活性药剂是可以买到的，已知的可以预防或减轻肺损伤疾病症状的药物。可选地，其它活性药剂包括甲泼尼龙等糖皮质激素。联合使用时，甲泼尼龙可以是常规剂量或可以低于常规剂量。

本发明实施方式中，所述雷公藤甲素及其衍生物可与药学上可接受的载体形成组合物。本文中，“药学上可接受的载体”指的是药学上可接受的材料或者载体，比如液体，固体填料，缓释剂，稳定剂，分散剂，悬浮剂，稀释剂，赋形剂，增稠剂，溶剂或包封材料，他们的作用是运输本发明中的有效成分，使其在患者体内发挥应有的作用。一般而言，运输是从一个器官，或者身体的某一部分到达另外一个器官或者身体的另外一个部分。每一个载体必须和各个配方成分相兼容，包括发明中的有效成分，使其对患者不产生负面影响。这些材料在药物学上可接受的载体包括：糖类，比如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，以及其衍生物，比如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及其它无毒在药物学上配方相容物质。

合适的组成和给与药物形式包括例如分散体，悬浮液，溶液，糖浆，颗粒，珠，粉末，丸剂，用于鼻或口服的液体喷雾剂，用于吸入的干粉或气雾化制剂等。值得注意的是应用于本发明的制药方式和组成并不局限于本文中描述某种特定的方法和组成。

本发明实施方式中，所述药物的给药方式包括局部给药、消化道给药或非消化道给药。局部给药是指直接用药于要影响的身体部位，包括：表皮给药，呼吸道吸入给药，灌肠给药，眼部给药，鼻腔给药。消化道给药，包括口服、肛门给药。非消化道给药包括经动脉注射、静脉注射、肌肉注射、心内注射、皮下注射、骨髓腔内注射、皮内注射、颅内植入或透皮给药。可选地，所述药物的给药方式包括口服、注射或雾化吸入。

本发明实施方式中，所述药物的给药方式包括口服、注射、呼吸道吸入或经皮给药。

给药方案可以影响有效量的组成成分。本发明治疗制剂可以在发病前或者发病后给与实验对象。此外，几次分开的剂量以及交错剂量可以每日或顺序给药，或者剂量可以连续输注，或者可以是推注。还有，治疗制剂的剂量可根据治疗或预防情况的紧急情况按比例地增加或减少。可以通过调整剂量方案以提供最佳治疗效果。

向患者，优选哺乳动物，更优选人施用本发明中的药物可以使用已知的给药程序，用本发明中陈述的疾病或紊乱的剂量和治疗时间给与执行。本研究中有效治疗剂量需要根据不同因素来调整，包括病人疾病和紊乱的发展阶段，年龄，性别，体重；还有治疗药物的活性。比如，可以每天施用几个分开的剂量，或者可以按照治疗情况的紧急情况按比例减少剂量。其中一个非限制性示例为本发明的治疗药物有效剂量范围约为：口服按0.5-10ug/kg体重/日，肌肉或静脉注射按0.1-3ug/kg体重/日，呼吸道吸入按0.01-2ug/kg体重/日。具体地，对呼吸内科感冒发烧症状加重，出现ards症状患者，临床检验显示为呼吸道病毒感染，拟根据情况，按上述剂量服用3-10天常规剂量的雷公藤甲素(每日分三次服用)。

在其中一个实施例中，本研究的药物给与病人的频率为一天一次到五次以上。在另一实施例中，本研究药物给药频率可以是但并不局限于每天一次，每两天一次，每三天一次，直到每周一次，每两周一次。很明显的是，目前给药多种组合的频率不尽相同，取决于但不局限于年龄，疾病和紊乱是否进行过治疗，性别，健康状况以及其它因素。因此，本发明不应被理解为限于任何特定的剂量方案，并且给予任何患者的精确剂量和组合物，要通过考虑到患者的所有其他因素而进行物理确定后来决定。

可以理解的是每天给与的药物可以但并不局限于每天一次，每两天一次，每三天一次，每四天一次，每五天一次。比如说，针对每两天给与的频率，一天给与10μg，可以由周一开始给与第一个10μg，然后周三10μg，周五10μg，依次进行下去。

在患者状态改善的情况下，根据医生的判断，可以连续给予本发明的药物；或者，所施用的药物的剂量暂时减少或暂时中止一段时间(比如“药物假期”)。药物假期的长短可以从2天到1年，包括2天，3天，4天，5天，6天，7天，10天，12天，15天，20天，28天，35天，50天，70天，100天，120天，150天，180天，200天，250天，280天，300天，320天，350天或者365天。药物假期中剂量减少范围是10％-100％，可包括10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,或者100％。

一旦病人出现症状改善，维持治疗的剂量可以给与。另外，也可以将剂量或频率，或者两者都降低，如果患者的身体功能在疾病和紊乱情况下都有所改善。在其中一个实施例中，病人需要长期间断性的智力，因为症状的反复出现和/或感染。

雷公藤甲素抑制了pma所导致的g0/g1期细胞比例升高和s期细胞比例下降，促使细胞周期停滞于未活化状态，雷公藤甲素通过调节细胞周期起到抑制淋巴细胞增殖、活化的作用；同时，也起到抑制病毒复制的作用。本发明雷公藤甲素及其衍生物可替代或与甲泼尼龙等糖皮质激素类似物联合使用，用于治疗和/或预防肺损伤疾病，可以抑制过度免疫，尤其是肺部的过度免疫，改善症状，提高患者生存率。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用雷公藤甲素的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。

我们拟将雷公藤甲素替代糖皮质激素应用于ards治疗中，设计了专门的试验验证雷公藤甲素在毒性允许范围内其效果优于甲泼尼龙，药物毒性作用测试采用细胞凋亡试验；同时测试这两种药物分子对细胞周期的影响，以阐述其药物作用的机理。

试验采用的细胞模型是以传代淋巴细胞(急性t淋巴细胞白血病细胞系)为载体，将带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)的基因及一段病毒基因整合入细胞中，gfp基因受到活化激发后可以在细胞中产生gfp蛋白，带有gfp荧光蛋白的细胞比例越高，说明细胞模型的活化程度越高，以此模拟ards时肺部浸润的淋巴细胞活化程度的升高；细胞模型中的病毒基因在受到激发时可以产生p24抗原并分泌至细胞培养液中，激发越强，细胞培养液中p24抗原的浓度越高，以此模拟感染所致ards时病原微生物在肺部组织大量繁殖，损伤组织和细胞。

佛波酯(phorbolester，pma)可以诱导细胞增殖、分化，影响细胞信号通路中多个分子的表达，是最强的的t淋巴细胞激活剂之一，本次实验采用佛波酯作为激活剂作用于细胞模型，模拟ards时淋巴细胞被激发后的状态。如果测试药物能降低被pma激发的细胞模型中gfp阳性细胞百分比，说明该药物可以抑制淋巴细胞过度的活化。如果测试药物可以降低被pma激发的细胞模型p24抗原的表达强度，说明该药物具有抑制病原微生物在细胞内复制的作用。

测定表达gfp阳性细胞百分比可以通过流式细胞仪分析，细胞培养液中p24抗原浓度可以通过酶联免疫试剂盒测定。凋亡试验用于测定药物对细胞模型的毒性，用于药物使用浓度的参考。细胞周期试验用于分析雷公藤甲素作用于细胞模型的机理。

如果试验药物的免疫抑制效果及毒性试验数据优于糖皮质激素，那么候选药物可以替代或与糖皮质激素联合使用应用于ards的治疗。

1材料

1.1细胞株及培养基

细胞模型：带有gfp荧光蛋白基因和p24抗原基因的jurkat传代细胞株，用含10％胎牛血清(fbs)、链霉素100u/ml、青霉素100u/ml的1640培养基培养。1.2仪器

1.3主要试剂与耗材

1.4配制试剂

查询药物(雷公藤甲素、甲泼尼龙)的分子量，根据设定好的药物储备液浓度计算出需要称取的药物质量，采用电子分析天平分别称量所需药物(雷公藤甲素20.1mm/l、甲泼尼龙20.1mm/l)，将中药分子溶于溶剂dmso中，配置成所需浓度的药物储备液，放于-20℃冰箱储存备用。配制pma(佛波酯)储备液，用dmso配成pma工作液(2μg/ml)，pma在细胞培养液中的终浓度为0.02μg/ml。

2方法

2.1细胞培养

从液氮罐中取出细胞模型常规方法复苏后，在37℃,5％的co2孵箱中进行传代培养，倒置显微镜观察细胞，细胞状态良好方可进行进一步的试验。

2.2细胞悬液制备

取传代培养24小时的细胞模型，离心后加入新鲜培养基制成细胞悬液，并采用细胞活力计数仪进行细胞计数，调整细胞浓度为2×10⁵个/ml。分别接种于24孔板中，细胞悬液体积为1800μl。

2.3药物处理

设置3个对照组(空白组、dmso溶剂组、pma溶剂组)，设置3个药物组，每组分别有5个药物浓度，雷公藤甲素药物组(0.04μmol/l、0.02μmol/l、0.01μmol/l、0.005μmol/l、0.0025μmol/l)、甲泼尼龙药物组(400μmol/l、350μmol/l、300μmol/l、250μmol/l、200μmol/l)及雷公藤甲素和甲泼尼龙混合药物组[(0.02+200)μmol/l、(0.01+175)μmol/l、(0.005+150)μmol/l、(0.0025+125)μmol/l、(0.00125+100)μmol/l]。

细胞培养板上每孔加入1800μl细胞悬液，对照组中的dmso组加入18μldmso、pma组加9μldmso+9μlpma，药物组均加入9μlpma+9μl药物。细胞培养板放置37℃5％co2恒温培养箱24h后进行流式细胞分析，分别检测gfp阳性细胞百分比、细胞凋亡及细胞周期变化。用带内标的双抗体酶联免疫法测定各孔细胞培养液中p24抗原浓度。

2.4流式细胞检测

2.4.1gfp荧光信号强度的检测

细胞模型处理24h后，将细胞吹吸混匀，取200μl细胞悬液到bd公司流式细胞上样管内，添加1000μlpbs，500g离心6min，倒去上清，加500μlpbs混匀，流式细胞仪上检测不同浓度药物处理后gfp阳性细胞百分比的变化。

2.4.2细胞周期检测

细胞模型处理24h后，将细胞吹吸混匀，取出300μl细胞于流式细胞分析上样管内，按照bdcycletestplusdnareagentkit细胞周期试剂盒的实验步骤处理细胞模型。最后用35μm滤膜流式上样管过滤粘连细胞，用流式细胞仪488nm激发波长激发细胞，收集pi通路的线性荧光信号，分析不同药物处理浓度对细胞周期的影响。

2.4.3细胞凋亡检测

细胞模型处理24h后，将细胞吹吸混匀，取出300μl细胞于流式细胞分析上样管内，按照bd公司annexinv-fitc/pi细胞凋亡双染试剂盒的实验步骤处理细胞，放置冰浴中于一小时内完成凋亡分析。

2.4.4细胞培养液p24抗原的检测

将处理好的24孔板放于37℃，5％co2细胞培养箱中孵育24h后，收集细胞于1.5ml离心管中，300g离心5min，取细胞上清液进行检验。采用biorad公司p24抗原酶联免疫检测试剂盒，绘制p24抗原内标的标准曲线，计算出每个药物浓度细胞模型对应的p24抗原浓度。

3实验结果

3.1雷公藤甲素、甲泼尼龙与两种药物联合使用抑制效应分析

表1-3中数据分别是三次试验gfp阳性细胞百分比和p24抗原浓度(两个指标)的均值±标准差(m±std)。从表1-表3数据可以看出，空白对照和溶剂对照gfp阳性细胞百分比和p24抗原浓度(两个指标)均很低，为细胞模型未活化状态；溶剂对照由于溶剂效应导致两个指标略高于空白对照；pma阳性活化对照两个指标最高，为完全活化组。

表1数据可以看出，随着雷公藤甲素浓度递减，gfp阳性细胞百分比和p24抗原浓度均逐渐升高，存在明显的剂量-效应关系，gfp阳性细胞百分比和p24抗原浓度对数值与药物浓度的相关性具有统计学意义，相关系数分别为-0.954和-0.945，p值分别为0.003和0.004，说明药物的抑制作用随着浓度的降低而下降。结合后续的细胞凋亡分析，雷公藤甲素终浓度为0.02μm时抑制效应显著而毒性较低，是比较好的应用浓度。

雷公藤甲素按照浓度梯度每组减半的趋势递减，甲泼尼龙由于抑制效应偏低而高浓度时毒性较大，不同药物组浓度梯度下降间隔短。表2数据可以看出，甲泼尼龙对gfp阳性细胞百分比和p24抗原浓度均有一定抑制效应，也有明显的剂量-效应关系，但抑制效应不如雷公藤甲素强，尤其表现在p24抗原浓度的下降斜率较小。即使在最高浓度400μm浓度，其抑制效果也不如0.02μm浓度的雷公藤甲素，而细胞凋亡比例已明显超过雷公藤甲素。

表3数据可以看出，与雷公藤甲素单独使用相比，雷公藤甲素和甲泼尼龙的联合使用较单独使用具有更强的抑制效应而细胞凋亡下降，也就是说具有好的协同效应，这种协同效应在低浓度组(雷公藤甲素0.01-0.005μm)更明显。

表1雷公藤甲素对gfp和p24抗原表达抑制效应分析(m±std)

表2甲泼尼龙对gfp和p24抗原表达抑制效应分析(m±std)

表3雷公藤甲素与甲泼尼龙混合物对gfp和p24抗原表达抑制效应分析

(m±std)

3.2雷公藤甲素与甲泼尼龙对细胞周期的影响

表4-5中数据分别是三次试验细胞周期g0/g1期、g2/m期和s期细胞所占总细胞数百分比的均值±标准差。三次试验，不同药物采用的空白对照、溶剂对照和pma阳性活化对照是一样的。图1为各浓度雷公藤甲素对细胞周期分布的影响图。其中，图1中a、b、c分别是空白对照、溶剂效应组、pma阳性活化对照图形，图1中d、e、f雷公藤甲素药物浓度分别为0.01、0.02、0.04μm时图形。每个图左侧的峰为g0/g1期细胞峰，右侧矮峰为g2/m期细胞峰，中间为s期细胞峰。

根据表4-5三个对照数据以及图1分析，空白对照和溶剂对照g0/g1期细胞所占比例(g0/g1期细胞)最低，由于溶剂效应，溶剂对照g1期细胞高于空白对照。pma阳性活化对照g0/g1期细胞显著高于空白对照和溶剂对照，而s期细胞所占比例(s期细胞)显著低于空白对照和溶剂对照，这说明细胞活化时，g0/g1期细胞增加，s期细胞下降。g2/m期细胞所占比例(g2/m期细胞)在细胞活化时也有下降，但变化不大(如图1中a、b、c所示)。

从表4中数据可以看出，随着雷公藤甲素浓度的增加，细胞模型的细胞周期发生较为规律性变化，雷公藤甲素低浓度时(0.0025、0.005、0.01μm)抑制效应低，g0/g1期细胞甚至高于阳性活化对照；在高浓度时(0.02、0.04μm)，g0/g1期细胞开始逐步下降；0.04μm时，由于高浓度雷公藤甲素抑制了细胞的活化，g0/g1期细胞已经降低到接近于溶剂对照。随着雷公藤甲素浓度的增加，s期细胞的变化与g0/g1期细胞相反，雷公藤甲素低浓度时(0.01μm)抑制效应低，s期细胞甚至高于阳性活化对照；在高浓度时(0.02、0.04μm)，s期细胞逐步上升，0.04μm时，由于高浓度雷公藤甲素抑制了细胞的活化，s期细胞已经升高到接近于溶剂对照(如图1中d、e、f所示)。

由此推测雷公藤甲素与pma同时加入细胞模型，抑制了pma所导致的g0/g1期细胞比例升高和s期细胞比例下降，促使细胞周期停滞于未活化状态，雷公藤甲素通过调节细胞周期起到抑制细胞增殖、活化的作用。gfp荧光蛋白和病毒基因的表达在这个过程中同时受到抑制，gfp阳性细胞百分比和p24抗原浓度下降。

甲泼尼龙作为常用的免疫抑制药物，其对细胞周期的作用效果类似于雷公藤甲素，但在最高浓度400μm时，其g0/g1期细胞大于0.04μm雷公藤甲素，s期细胞小于0.04μm雷公藤甲素，说明其对细胞增殖的抑制效果弱于雷公藤甲素。

表4雷公藤甲素对细胞周期变化的剂量-效应关系(m±std)

表5甲泼尼龙对细胞周期变化的剂量-效应关系(m±std)

3.4雷公藤甲素与甲泼尼龙对细胞凋亡的影响

3.4.1流式细胞凋亡分析示意图

图2为活细胞设门及三种荧光补偿调整分析图；图3为各剂量雷公藤甲素实验组凋亡/死亡细胞分布图。其中，图2a为流式物理图，图2b为调节gfp和7-aad荧光补偿图，图2c为调节gfp和anexin-v荧光补偿图；gfp-a为gfp荧光蛋白的荧光强度，7-aad为标记细胞死活的荧光染料信号强度，anexin-ⅴpe为标记凋亡信号的荧光分子的荧光强度。图3中a、b和c分别为0.01、0.02、0.04um的雷公藤甲素所致早、晚期凋亡示意图，图中apopotosis为早期凋亡细胞，dead+apo为晚期凋亡细胞，deadcell为死细胞，livingcell为活细胞。

从图3中可以看出，从0.01μm至0.04μm，随着药物浓度升高，右上象限(晚期凋亡细胞)和右下象限(早期凋亡细胞)细胞百分比逐渐升高，尤其在雷公藤甲素0.04μm浓度时，早期和晚期凋亡细胞所占比例明显高于0.02μm浓度。

3.4.2不同浓度雷公藤甲素和甲泼尼龙对细胞凋亡/死亡的影响

从表6可以看出，雷公藤甲素在最高剂量0.04μm时早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比明显大于空白对照和溶剂对照，但浓度降低0.02μm时，细胞凋亡百分比迅速降低至与空白对照和溶剂对照接近的程度；甲泼尼龙250μm以上剂量时凋亡细胞百分比都明显大于空白对照和溶剂对照(见表7)，但如果将浓度降低到250μm以下(200μm)，其对pma诱导的活化效应的抑制作用已经非常低，这说明雷公藤甲素在作用于细胞的终浓度0.02μm左右具有高效、低毒的药用价值。

表8说明雷公藤甲素和甲泼尼龙联合用药并没有增加同一个药物浓度作用后细胞的凋亡率，而作用效果要强于两种药物的单独作用，联合用药具有一定优越性。

表6雷公藤甲素对早、晚期凋亡细胞百分比变化的剂量-效应关系(m±std)

表7甲泼尼龙对早、晚期凋亡细胞百分比变化的剂量-效应关系(m±std)

表8雷公藤甲素和甲泼尼龙混合物对早、晚期凋亡细胞百分比变化的剂量-效应

关系(m±std)

从上述试验结果可知，雷公藤甲素能显著抑制pma活化的淋巴细胞模型中gfp荧光蛋白(细胞活化胞内指标)和p24抗原(细胞分泌的病毒抗原指标)的升高效应，雷公藤甲素浓度越高，gfp阳性细胞百分比和p24抗原浓度越低，存在负的剂量-效应关系，相关系数分别为-0.954和-0.945，p值分别为0.003和0.004。而甲泼尼龙即使在浓度高达400μm时，其抑制效果也不如0.02μm浓度的雷公藤甲素，而细胞凋亡比例已明显超过0.02μm浓度的雷公藤甲素。其原理为雷公藤甲素抑制了pma所导致的g0/g1期细胞比例升高和s期细胞比例下降，促使细胞周期停滞于未活化状态，雷公藤甲素通过调节细胞周期起到抑制细胞增殖、活化的作用。根据细胞凋亡分析，雷公藤甲素终浓度为0.02μm时抑制效应显著而毒性较低，是适宜的应用浓度。与雷公藤甲素单独使用相比，雷公藤甲素和甲泼尼龙的联合使用较单独使用具有更强的抑制效应而细胞凋亡下降，具有良好的协同效应，这种协同效应在低浓度组(雷公藤甲素0.01-0.005μm)更明显。因此，本发明雷公藤甲素及其衍生物可替代或与甲泼尼龙联合使用，用于治疗和/或预防肺损伤疾病。

实施例1：

雷公藤甲素口服片的制备：雷公藤甲素口服片剂以β-环糊精为辅料，可以减轻雷公藤甲素对胃肠道的刺激作用，具体制备方法为：首先将雷公藤甲素粉末溶于乙醇中成为100μm(36000μg/l)溶液，β-环糊精和雷公藤甲素按质量比10:1-1000:1混合，充分搅拌混匀后用超声波(超声频率40000hz)处理10-30分钟，以制备雷公藤甲素β-环糊精包合物，干燥处理后制成片剂包裹糖衣做成成药。每片成药含雷公藤甲素40μg，按0.5-10μg/kg/日的量分三次服用。

实施例2：

经呼吸道(经口腔进气管)吸入途径的吸入剂：雷公藤甲素难溶于水，为了提高水溶性，尽量将雷公藤甲素分子分散，首先将雷公藤甲素粉末溶于dmso中成为100μm(36mg/l)溶液，按重量/体积比加入壳聚糖制成浓度0.6％(w/v)溶液，该溶液经0.8μm微孔滤膜过滤后，喷雾干燥机制备微粒，参数设置如下：喷嘴直径0.5mm，进口温度110℃、气流速度0.7m³·min^-1、雾化压力200kpa。使用雾化或粉末喷剂时，每日吸入0.01-2ug/kg体重/日雷公藤甲素当量的药物，每日三次。

实施例3：

口服液：首先将雷公藤甲素粉末溶于乙醇中成为100μm(36000μg/l)溶液，加热混匀至完全溶解，缓慢加入5倍体积的水，水温保持80℃，加入适量的甜蜜素和防腐剂，混匀后，冷却静置24小时后抽滤去除乙醇至浓度小于0.5％(v/v)，在这个过程中逐步添加80℃温水补充损失的体积，分装成10ml带刻度玻璃瓶中，每瓶含雷公藤甲素60ug，0.22um滤膜过滤灭菌，无菌封口。按0.5-10μg/kg/日的量分三次服用。

实施例4：

注射液：首先将雷公藤甲素粉末溶于乙醇中成为100μm(36000μg/l)溶液，加热混匀至完全溶解，缓慢加入17倍体积的水，水温保持80℃，冷却静置24小时后抽滤去除乙醇至浓度小于0.5％(v/v)，在这个过程中逐步添加80℃温水补充损失的体积，分装成2ml玻璃瓶中，每瓶含雷公藤甲素20ug，0.22um滤膜过滤灭菌，无菌封口。按0.1-3μg/kg/日的量分三次使用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。