一种具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制备方法与流程

本发明属于中药药物提取
技术领域：
，具体的为一种具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制备方法。
背景技术：
：山茶花(camelliajaponical.)为山茶科山茶属红山茶组植物，属常绿阔叶林木本植物，又名茶花、山茶、耐冬，是中国十大名花之一。分布广泛，资源丰富，主产于我国浙江、江苏、云南、四川等，主要用于观赏及美化环境。近年来，山茶花的药用价值逐渐受到关注，研究发现其具有一定的抑菌、抗癌、止血、抗炎等活性。近年来，高血脂症已成为全球人类健康的“第一杀手”，血脂异常对我国人民健康的危害程度已上升至原来的35倍。目前，考来烯胺和他汀类药物是治疗高血脂症的常用西药，但长期服用，会带来各种各样的副作用，如胆损伤、恶心等，因此，从天然植物中寻找安全、高效的降血脂药物，已成为科学研究者们关注的焦点。儿茶素和表儿茶素是茶叶的重要成分，一般都是从茶叶中提取而来的，具有防治心血管疾病、预防癌症、抗氧化等多种功能，还具有抑制血压(可降低舒张压与收缩压)及血糖(抑制醣分解酵素)、降低血中胆固醇等功能。儿茶素和表儿茶素不溶于氯仿和石油醚。中国专利号为2008100118991公开了一种山茶花有效成分及其提取方法和用途，该专利的提取方法包括醇提—大孔树脂分段纯化或醇提—溶剂分段萃取—大孔树脂纯化或水提—醇沉—大孔树脂分段纯化，经该方法，所得的提取物主要有效成分为黄酮、茶皂苷、苯乙醇苷，其含量分别为总黄酮1％～25％，总皂苷1％～20％，苯乙醇苷1％～3％，利用该有效成分生产加工数种制剂，将其作为治疗和改善高血糖、高血脂、胃黏膜损伤等症状的药物和功能性食品。然后，该发明并未明确哪种有效成分中何种化合物具有降血糖、降血脂，治疗胃黏膜损伤的作用，而且制备得到的黄酮、茶皂苷、苯乙醇苷的含量低。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制备方法。一种具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制备方法，包括以下步骤：①称取山茶花花瓣于圆底烧瓶中，加20～60倍体积比为95％的乙醇回流提取1～3小时，得提取液，提取液用3～5层纱布过滤后减压浓缩，烘干得膏状提取物；②将上述提取物用30～60℃温水悬浮分散，然后用石油醚萃取4～6次，得到上层溶液a和下层溶液a；下层溶液a再用氯仿萃取4～6次，得到上层溶液b和下层溶液b；下层溶液b再用乙酸乙酯萃取4～6次，得到上层溶液c和下层溶液c；合并每次的上层溶液c，下层溶液c再用水饱和正丁醇萃取4～6次，得到上层溶液d和下层溶液d，合并每次的上层溶液d；③将上述上层溶液c、上层溶液d分别减压蒸发浓缩，然后在50～65℃温度下烘干至恒重，得相应的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；④将上述的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物混合均匀即为具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物。所述的步骤②中的温水温度优选的为50℃，膏状提取物水悬浮分散后才可以用溶剂进行萃取，发明人经过多次实验发现用温水比冷水悬浮分散效果更好、更快，而50℃的温水效果是最好，悬浮分散最彻底的。所述的步骤③中的烘干温度优选的为55℃，过高的烘干温度会破坏提取物中的活性成分，温度过低，又会延长烘干时间，故经过发明人创造性实验，发现烘干温度在55℃最为合适。一种具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物，通过上述的方法制得，其中乙酸乙酯提取物中儿茶素的含量为7～11％，表儿茶素52～67％，其中正丁醇提取物中儿茶素的含量为10～18％，表儿茶素31～53％。所述的乙酸乙酯提取物在选用agilent6110四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源(esi)，离子化模式为正离子化模式(esi+)，毛细管电压为3000v，干燥气用n2，雾化器流量12l/min，雾化器压力35.0psi，干燥器温度350℃，质量扫描范围100～1000m/z，碰撞诱导解离电压70v/100v为检测条件下，儿茶素的含量为7～11％，表儿茶素52～67％。所述的乙酸乙酯提取物在选用agilent6110四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源(esi)，离子化模式为正离子化模式(esi+)，毛细管电压为3000v，干燥气用n2，雾化器流量12l/min，雾化器压力35.0psi，干燥器温度350℃，质量扫描范围100～1000m/z，碰撞诱导解离电压70v/100v为检测条件下，儿茶素的含量为10～18％，表儿茶素31～53％。本发明的第二目的在于提供一种包含具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物药物组合物。一种山茶花花瓣提取物药物组合物，由如下重量份的组分组成：山茶花花瓣提取物5～10份，苦瓜粉3～6份，桑葚提取物2～5份，决明子粉1～1.6份，山楂提取物2～4.5份，芹菜提取物1.5～2.5份，何首乌提取物1～3份，大豆渣3～5份，甜叶菊2～3份。一种山茶花花瓣提取物药物组合物，由如下重量份的组分组成：山茶花花瓣提取物6～8份，苦瓜粉4～5.5份，桑葚提取物3～4.5份，决明子粉1.1～1.5份，山楂提取物2.5～4份，芹菜提取物1.8～2.2份，何首乌提取物1.5～2.5份，大豆渣3.5～4.5份，甜叶菊2.2～2.8份。一种山茶花花瓣提取物药物组合物，由如下重量份的组分组成：山茶花花瓣提取物6.5～7.5份，苦瓜粉4.5～5份，桑葚提取物3.5～4份，决明子粉1.2～1.4份，山楂提取物2.5～3.5份，芹菜提取物1.9～2.1份，何首乌提取物1.6～2.3份，大豆渣3.7～4.3份，甜叶菊2.4～2.6份一种山茶花花瓣提取物药物组合物，由如下重量份的组分组成：山茶花花瓣提取物7份，苦瓜粉4.8份，桑葚提取物3.7份，决明子粉1.3份，山楂提取物3，芹菜提取物2份，何首乌提取物2份，大豆渣4份，甜叶菊2.5份。山茶花花瓣提取物中含量丰富的儿茶素和表儿茶素，因此具有很好的抑制血压(可降低舒张压与收缩压)及血糖(抑制醣分解酵素)、降低血中胆固醇等功能。苦瓜中含有较多的苦瓜皂甙，可刺激胰岛素释放，有非常明显的降血糖作用，苦瓜中维生素b1、维生素c和多种矿物质的含量都比较丰富，能调节血脂、提高机体免疫力的作用，又有“植物胰岛素”的美称。桑椹中的脂肪酸具有分解脂肪、降低血脂，防止血管硬化等作用。决明子具有清热平肝、降脂降压、润肠通便、明目益睛之功效，也具有抑制血清胆固醇升高和动脉硬化斑块形成的作用山楂含山楂酸、酒石酸、柠檬酸等物质，有扩张血管、降低血压、降低胆固醇、增加胃液消化酶等作用。何首乌能促进肠道蠕动，减少胆固醇吸收，加快胆固醇排泄，从而起到降低血脂、抗动脉硬化的作用。豆渣中的膳食纤维具有明显的降低血浆胆固醇、调节胃肠功能及胰岛素水平等功能。甜叶菊是一种低热量、高甜度的天然甜味剂，同时还具有具有调节血压、软化血管、降低血脂、降血糖、尿糖、抑菌止血、镇痛、减肥养颜、养阴生津、帮助消化，促进胰腺、脾胃功能和清热解毒的功能。因此本发明的山茶花花瓣提取物药物组合物具有很好的降血脂的功能。与现有技术相比，本发明具有如下的优点：(1)本发明制备方法简单易行，提取充分。(2)本发明采用多级萃取的方式进行，去除其他的杂质，制备方法得到的儿茶素和表儿茶素纯度高、含量高。(3)本发明的提供的山茶花花瓣提取物药物组合物，组分天然无毒不添加其他人工合成组分，因此保持了绿色天然的特性。(4)本发明的提供的山茶花花瓣提取物药物组合物口感好，组合物中添加了甜叶菊可以抵消苦瓜带来的苦味，使得山茶花花瓣提取物药物组合物具有甜叶菊的甘甜。附图说明图1为山茶花花瓣乙酸乙酯提取物质谱图；图2为山茶花花瓣正丁醇提取物质谱图；图3为山茶花花瓣乙酸乙酯提取物hplc图；图4为山茶花正丁醇提取物hplc图；图5儿茶素、表儿茶素标品在乙酸乙酯萃取洗脱条件下的hplc图；图6儿茶素、表儿茶素标品在正丁醇萃取洗脱条件下的hplc图；具体实施方式下面通过实施例，结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明：实施例1：一种具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制备方法①称取山茶花花瓣于圆底烧瓶中，加20～60倍体积比为95％的乙醇回流提取1～3小时，得提取液，提取液用3～5层纱布过滤后减压浓缩，烘干得膏状提取物；②将上述提取物用30～60℃温水悬浮分散，然后用石油醚萃取4～6次，得到上层溶液a和下层溶液a，合并每次的上层溶液a；下层溶液a再用氯仿萃取4～6次，得到上层溶液b和下层溶液b，合并每次的上层溶液b；下层溶液b再用乙酸乙酯萃取4～6次，得到上层溶液c和下层溶液c，合并每次的上层溶液c；下层溶液c再用水饱和正丁醇萃取4～6次，得到上层溶液d和下层溶液d，合并每次的上层溶液d；③将上述上层溶液a、上层溶液b、上层溶液c、上层溶液d和下层溶液d分别减压蒸发浓缩，然后在50～65℃温度下烘干至恒重，得相应的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和蒸馏水提取物；④将上述的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物混合均匀即为用于治疗降血脂的山茶花花瓣提取物。实施例2～4：各种山茶花花瓣提取物对胆酸盐结合能力的测定胆固醇降解为胆汁酸排出体外是体内胆固醇降解的主要途径，而人体95％以上的胆汁酸在排入肠道后，而被重吸收再次进行肠肝循环，剩余5％左右的胆汁酸便随粪便排外。如果胆汁酸被结合，则无法经肠肝循环再次返回肝脏，肝脏就会大量降解胆固醇，从而可以达到降血脂的目的。正常人胆汁中胆汁酸可分为游离型(脱氧胆酸和胆酸)和结合型(胆酸和脱氧胆酸等与牛磺酸、甘氨酸的结合产物)两种，但约90％左右的胆汁酸均为结合型胆汁酸，即以胆酸盐形式在体内存在。因此，本次测定选择具有代表性的牛磺胆酸钠(stc)、甘氨胆酸钠(sgc)和胆酸钠(sc)作为吸附结合对象。同时，选取降血脂药物的主要成分考来烯胺对胆酸盐结合能力做对比。测定方法：分别称取乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、蒸馏水提取物、氯仿提取物、石油醚提取物及考来烯胺各100mg于5只10ml具塞试管中，然后加入0.01mol/lhcl溶液1ml，37℃恒温振荡消化1h后，以0.1mol/lnaoh溶液调节ph值为6.3，随后加入10mg/ml的胰酶5ml，胰酶用ph值6.3的0.1mol/lh3po4缓冲液配制，37℃恒温振荡消化1h，然后加入4ml牛磺胆酸钠(stc)或甘氨胆酸钠(sgc)或胆酸钠(sc)标准溶液，37℃恒温振荡1h，之后4000rpm离心20min，取上清液。以胆酸盐的减少量评价山茶花花瓣各提取物结合胆酸盐能力，即各提取物的降血脂能力，实验结果见表1。表1山茶花花瓣各提取物对胆酸盐的结合能力注：同列肩标字母不同，表示有显著性差异(p≤0.05)将降血脂药物的主要成分考来烯胺对胆酸盐的吸附率设定为100％，山茶花五种萃取提取物结合胆酸盐的能力如表1所示。结果显示，山茶花花瓣五种提取物对三种胆酸盐均具有一定的结合能力。结合牛磺胆酸钠和胆酸钠能力大小依次为：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞蒸馏水提取物＞石油醚提取物＞氯仿提取物；结合甘氨胆酸钠能力大小依次为：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物＞蒸馏水提取物＞氯仿提取物。其中，乙酸乙酯和正丁醇提取物结合三种胆酸盐的能力均远高于蒸馏水、石油醚和氯仿提取物，表明山茶花花瓣乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物物中含有较强结合胆酸盐的功能活性成分。这与儿茶素和表儿茶素不溶于石油醚和氯仿的性质也是吻合的，因此采用实施例1的方法制备得到山茶花花瓣萃取提取物中儿茶素和表儿茶素的含量高，这是因为本发明采用的是多级萃取的方式进行的，使得山茶花花瓣提取物中其他物质溶解在了石油醚和氯仿中了，导致乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物中儿茶素和表儿茶素的含量和纯度提高。实施例5～7：儿茶素和表儿茶素单体对胆酸盐结合能力的测定检测方法同实施例2～4，实验结果见表2。表2为儿茶素和表儿茶素对胆酸盐的结合能力注：同列肩标字母不同，表示有显著性差异(p≤0.05)以降血脂药物的主要成分考来烯胺对胆酸盐的吸附率为100％，可知，表儿茶素和儿茶素单体对三种胆酸盐均具有很强的结合作用，是同剂量考来烯胺的1～2倍，因此儿茶素、表儿茶素具有很好的降血脂作用。实施例5～7结合实施例2～4，对比表1和表2可以清楚的反映出，山茶花花瓣乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物具有很好的结合胆酸盐能力是因为乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物中儿茶素和表儿茶素的含量高。因此乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物混合均匀后的山茶花花瓣提取物具有良好的降血脂功能。实施例8～9：山茶花花瓣乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物中儿茶素和表儿茶素含量的测定。山茶花花瓣乙酸乙酯提取物中儿茶素和表儿茶素含量检测方法：通过液质联用(lc-ms)技术进行检测，选用色谱柱为hypersilbds-c18，柱温25℃，流速0.5ml/min，进样量20μl，检测波长为280nm；流动相为a甲醇，流动相b为1％乙酸水溶液，洗脱梯度为：0～5min流动相a25～60％，5～10min流动相a60～65％，10～22min流动相a65％；选用agilent6110四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源(esi)，离子化模式为正离子化模式(esi+)，毛细管电压为3000v，干燥气用n2，雾化器流量12l/min，雾化器压力35.0psi，干燥器温度350℃，质量扫描范围100～1000m/z，碰撞诱导解离电压70v/100v。山茶花花瓣正丁醇提取物中儿茶素和表儿茶素含量检测方法：通过液质联用(lc-ms)技术进行检测，选用色谱柱为hypersilbds-c18，柱温25℃，流速0.5ml/min，进样量20μl，检测波长为280nm；流动相为a甲醇，流动相b为1％乙酸水溶液，洗脱梯度为：0～5min流动相a25～50％，5～8min流动相a50～55％，8～13min流动相a55～85％，13～26min流动相a85％；选用agilent6110四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源(esi)，离子化模式为正离子化模式(esi+)，毛细管电压为3000v，干燥气用n2，雾化器流量12l/min，雾化器压力35.0psi，干燥器温度350℃，质量扫描范围100～1000m/z，碰撞诱导解离电压70v/100v。实施例8和实施例9的质谱图分别如图1和图2所示，从图1和图2可以看出，山茶花乙酸乙酯提取物和山茶花正丁醇提取物中均有多种物质存在，均有正离子峰([m-h]+或[m-na]+)的质荷比(m/z)均为291的分子离子峰存在，即图1和图2所对应的是相对分子质量均为290或268的分子，而多酚中儿茶素和表儿茶素相对分子质量为290，与图1和图2的质谱图中的信息刚好吻合。实施例8和实施例9的hplc图分别为图3和图4所示，儿茶素、表儿茶素标品在乙酸乙酯萃取洗脱条件下和在正丁醇萃取洗脱条件下的hplc图分别为图5和图6。对比图3和图5，发现图5儿茶素标品的出峰时间为9.775min，表儿茶素标品的出峰时间为10.785min，因此图3中出峰时间为9.773min的为儿茶素，出峰时间为10.773min的为表儿茶素，采用面积归一化法测得儿茶素和表儿茶素的含量分别占总样品量的7.65％和52.14％。对比图4和图6，发现图6中儿茶素标品的出峰时间为10.486min，表儿茶素标品的出峰时间为11.881min，因此图4中出峰时间为10.412min的为儿茶素，出峰时间为11.815min的为表儿茶素，采用面积归一化法测得儿茶素和表儿茶素的含量分别占总样品量的11.72％和31.37％。对比例1：选用中国专利号为2008100118991公开了的方法制备得到的山茶花有效提取物。对比例2：选用中国专利申请号为2015102673547公开的方法制备得到的金花茶花提取物。对比例3：采用实施例8～9相同的检测方法检测对比例1～2的提取物中儿茶素和表儿茶素的含量。表3为实施例8～9和对比例1～2的提取物中儿茶素和表儿茶素的含量实施例8实施例9对比例1对比例2儿茶素含量7.65％11.72％1.26％3.5％表儿茶素含量52.14％31.37％0％10.5％由表3数据可以看出，对比例1中只含有表儿茶素，对比例2中虽然含有儿茶素和表儿茶素，但本发明的山茶花花瓣提取物儿茶素和表儿茶素的含量明显高于对比例1和对比例2的茶花提取物，说明本发明的山茶花花瓣提取物中具有降血脂功能的儿茶素和表儿茶素全面且含量高。实施例10：含有山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物药物组合物。由如下重量份的组分组成：山茶花花瓣提取物5份，苦瓜粉3份，桑葚提取物2份，决明子粉1份，山楂提取物2份，芹菜提取物1.5份，何首乌提取物1份，大豆渣3份，甜叶菊2份。实施例11：含有山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物药物组合物。由如下重量份的组分组成：山茶花花瓣提取物7份，苦瓜粉5份，桑葚提取物4份，决明子粉1.3份，山楂提取物3，芹菜提取物2份，何首乌提取物2份，大豆渣4份，甜叶菊2.5份。实施例12：含有山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物药物组合物。由如下重量份的组分组成：山茶花花瓣提取物8份，苦瓜粉5.5份，桑葚提取物4.5份，决明子粉1.4份，山楂提取物3.5份，芹菜提取物2.2份，何首乌提取物2.5份，大豆渣4.5份，甜叶菊2.8份。实施例13：含有山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物药物组合物。由如下重量份的组分组成：山茶花花瓣提取物10份，苦瓜粉6份，桑葚提取物5份，决明子粉1.6份，山楂提取物4.5份，芹菜提取物2.5份，何首乌提取物3份，大豆渣5份，甜叶菊3份。本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属
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的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。当前第1页12