肿瘤靶向的新型钌多吡啶配合物载siRNA的制备与评价的制作方法

本发明涉及4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds二氯化钌(ru-co-rgds)的制备及ru-co-rgds/vegf-sirna基因递送系统的构建，并且对其进行了体内外抗肿瘤活性和基因沉默效率的评价。本专利主要是通过rgds修饰，增强钌吡啶配合物ru-cooh的靶向性，使在靶部位的浓度增加，从而减小副作用，提高了治疗指数。

背景技术：

基因治疗以改变人的遗传物质为基础，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正基因缺陷或沉默相关基因表达，从而起到抗肿瘤的目的。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)能促进血管内皮细胞增殖、迁移和肿瘤的新血管生成淋巴管的形成，增加血管通透，促进肿瘤生长、转移。在基因治疗领域中，具有的基因沉默靶向性的rna干扰(rnainterfence,rnai)治疗重大疾病方面显示出非常大的应用潜力。

rna干扰是指通过双链rna(dsrna)在逆转录后引起该序列的同源mrna产生特异性降解，从而达到基因沉默的作用。rnai具有高特异性、高效性、高稳定性。vegf存在于卵巢癌、宫颈癌等实体瘤，血液系统肿瘤等大多数重要的人类肿瘤中，且vegf受体过高表达。因此，在根本上从基因水平抑制vegf表达，实现抗新生血管的生成，从而达到抑制肿瘤的生长和迁移的目的。vegf-sirna转染被认为是一种潜在的抗肿瘤策略。

钌多吡啶金属配合物应用广泛。与核酸通过嵌入，沟槽结合和静电模式等模式结合，可作为核酸结构探针、核酸分子光开关、化学核酸酶、基因载体，因低毒性、易吸收及代谢快等并被认为成为新的最有前景的抗癌药物之一。钌多吡啶配合物作为非病毒类载体与阳离子聚合物等相比，具有更好的水溶性、更丰富的结构多样性和更合理的正电荷密度，而且更易制备，因此其作为基因领域中安全的高效的非病毒型基因载体。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arg-gly-asp-x,rgdx)rgd肽可作为整合素和其配体相互作用的识别位点,介导细胞与细胞外基质蛋白及细胞间的粘附作用，同时具有信号传导功能。rgds与整合素的特异结合,可以将治疗效应分子靶向性地导入肿瘤部位,有效地减少了对正常细胞的损害。此外，含rgdx的多肽或化合物被应用于新型材料的修饰与合成。其中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(arg-gly-asp-ser,rgds)中的丝氨酸的修饰，增加了化合物的亲水性，所以在抗肿瘤药物的修饰中rgds靶向肽具有广泛应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的基因递送系统，由抗肿瘤基因治疗药物vegf-sirna和基因载体ru-co-rgds制备而成。

本发明所述的基因递送系统，其特征在于，ru-co-rgds和vegf-sirna的重量比为1.66：1。

本发明所述的基因递送系统，为纳米结构。

本发明的另一个目的在于提供基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：基因载体ru-co-rgds与抗肿瘤基因治疗药物vegf-sirna在常温下以质量比为1.66:1混合，即得ru-co-rgds/vegf-sirna。

其中，ru-co-rgds的制备方法如下：4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-甲酸与hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl液相接肽法，用三氟乙酸/三氟甲磺酸脱去保护基，形成4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds，最后与钌吡啶配合物回流反应即得ru-co-rgds。

其中，ru-co-rgds的制备方法如下：通过液相接肽法，将4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-甲酸与hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl在thf/dmf中通过ddc/hobt反应，得到4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-r(tos)-g-d(obzl)-s-obzl；然后用三氟乙酸/三氟甲磺酸脱去保护基，形成4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds；将顺-2,2'联吡啶二氯化钌与4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds在n2环境下避光回流反应，回流反应结束后，旋干溶液，加入纯净水溶解后，加入饱和六氟磷酸盐溶液，出现红橙色沉淀，离心，取上清液，旋干，甲醇乙醚体系重结晶，得到ru-co-rgds。

本发明所述的基因递送系统ru-co-rgds/vegf-sirna的制备方法如下：将vegf-sirna与小牛胸腺dna按照2：1(v:v)的比例混合，反复吹打，室温下静置10min，同时将ru-co-rgds与鱼精蛋白混合，反复吹打，室温下静置10min，然后将ru-co-rgds/鱼精蛋白复合物加入到vegf-sirna/dna复合物中，反复快速吹打，室温静置30min，即得ru-co-rgds/vegf-sirna。

优选的，本发明所述的基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：hcl·ar

g(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的合成：

取400mgboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl中加入适量无水hcl-乙酸乙酯溶液溶解，室温搅拌4h，可见大量白色固体析出，用tlc板监测反应。反应结束后，室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，反复数次，并用少量乙醚减抽滤，以除去氯化氢，即得hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl，

4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的合成：

将4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-甲酸87mg溶解于无水thf中，无水dmf助溶，冰浴条件下加入hobt55mg和dcc100mg完全溶解，活化30min，加入制备好的hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl312mg，并用dmm调节ph＝8.0-9.0，室温下搅拌反应14h，用tlc板监测反应，得到粉红色固体粉末，

4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds的合成：

将86mg4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl冰浴条件下加入1.35ml三氟乙酸，0.45ml三氟甲磺酸(v:v＝3:1)，反应30min，所得化合物为用乙醇反复磨洗，得到标题产物，

ru-co-rgds的合成

取顺-2,2'联吡啶二氯化钌35mg和4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds79mg于50ml两口烧瓶中，加入50％乙醇10ml，避光，充入n2的条件下回流反应10h。回流反应结束后，旋干溶液。加入5ml纯净水溶解，加入饱和六氟磷酸盐溶液，出现红橙色沉淀。1000rpm，离心3min。经过鉴定，上清液中产物含量多。取上清液，旋干。甲醇乙醚体系重结晶，最后得到终产物150mg，

ru-co-rgds/vegf-sirna的制备

将vegf-sirna与小牛胸腺dna按照2：1(v:v)的比例混合，反复吹打，室温下静置10min。同时将ru-co-rgds与鱼精蛋白混合，反复吹打，室温下静置10min。后将ru-co-rgds/鱼精蛋白复合物加入到sirna/dna复合物中，反复快速吹打，室温静置30min，即得ru-co-rgds/vegf-sirna。

本发明所述的基因递送系统在制备抑制肿瘤中的应用。

本发明涉及以宫颈癌hela细胞株为模型，用mtt法评价基因载体ru-co-rgds对vegf-sirna的细胞毒性和ru-co-rgds/vegf-sirna的体外抗肿瘤活性，结果显示ru-co-rgds对hela细胞表现出低毒性，并且ru-co-rgds/vegf-sirna具有良好的体外抗肿瘤活性，其ic50为122.6nm。

本发明涉及以宫颈癌hela细胞株为模型，通过elisa测定蛋白水平的基因沉默效率，通过rt-pcr测定mrna水平的基因沉默效率。在mrna水平，ru-co-rgds/vegf-sirna能够下调vegf相应mrna的表达，浓度为100nm的抑制率为59±5.2％；在蛋白水平，ru-co-rgds/vegf-sirna能够下调vegf蛋白的表达，浓度为100nm的抑制率为64.1±2.5％。

本发明涉及以荷s180腹水瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤活性评价，ru-co-rgds/vegf-sirna复合物中vegf-sirna的给药剂量为0.3mg/kg，其抑瘤率为52.54％。

对说明书中出现的以下词语作进一步的解释：

ru：钌多吡啶配合物

rgds：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸

ru-co-rgds：4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds二氯化钌

dcc：碳二亚氨

hobt：1-羟基苯并三唑

vegf：血管内皮生长因子

sirna：小干扰rna

thf：四氢呋喃

od值：光密度值

depc：焦碳酸二乙酯

dmf：n，n-二甲基甲酰胺

tfa：三氟乙酸

tfmsa：三氟甲磺酸

ru(bpy)2cl2：顺-2,2'联吡啶二氯化钌

4′-methyl-2,2′-bipyridyl-4-carboxylicacid：4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-甲

酸

tlc：薄层色谱分析

dmso：二甲基亚砜

dmem：改良杜氏伊格尔培养基

fbs：胎牛血清

fam：羟基荧光素

mtt：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐

elisa：酶联免疫吸附测定

rt-pcr：逆转录-聚合酶链式反应

mtt:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐

dmso：二甲基亚砜

ns：生理盐水

附图说明：

附图1为rgds的制备路线。

附图2为ru-co-rgds的制备路线。

(i)4′-methyl-2,2′-bipyridyl-4-carboxylicacid,dcc,hobt,nmm,thf；

(ii)tfa/tfmsa；

(iii)ru(bpy)2cl2,n2,50％ethanol,refluxedinthedark

附图3为boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的质谱((867.35[m+1]⁺))。

附图4为boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的核磁¹hnmr(300mhz,dmso-d6)。

附图5为boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的hplc。

附图6为ru-co-rgds的质谱([m/2]²⁺＝521.6482)。

附图7为ru-co-rgds的红外。

附图8为ru-co-rgds的紫外。

附图9为ru-co-rgds的荧光。

附图10为ru-co-rgds在hela细胞的转染效果图。

a:空白细胞对照组

b:游离的fam-vegf-sirna组

c:ru-co-rgds/fam-vegf-sirna基因递送体系组

d:lipo/fam-vegf-sirna阳性对照组

附图11为ru-co-rgds对hela细胞的细胞毒性。

附图12为ru-co-rgds/vegf-sirna的体外抗肿瘤活性。

附图13为各组vegf蛋白的含量。

附图14为各组vegf-mrna的含量。

附图15为ns、ru-co-rgds/vegf-sirna、ru-co-rgds、vegf-sirna和dox组瘤重。

附图16为ru-co-rgds/vegf-sirna、ru-co-rgds、vegf-sirna和dox组抑瘤率。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作出进一步的说明，但不作为对于本发明的限制。

实施例1.ru-co-rgds/vegf-sirna的制备

h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的制备路线如图1。ru-co-rgds的制备路线如图2。

hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的合成

合成boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl。esi-ms(m/e)：(867.35[m+1]⁺)。取400mg中加入适量无水hcl-乙酸乙酯溶液溶解，室温搅拌4h，可见大量白色固体析出，用tlc板监测反应。反应结束后，室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，反复数次，并用少量乙醚减抽滤，以除去氯化氢。即得hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl。esi-ms(m/e)：767.30[m+1]⁺。

4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的合成

将4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-甲酸87mg溶解于无水thf中，无水dmf助溶。冰浴条件下加入hobt55mg和dcc100mg完全溶解，活化30min。加入制备好的hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl312mg，并用dmm调节ph＝8.0-9.0。室温下搅拌反应14h，用tlc板监测反应。得到粉红色固体粉末328mg(产物89％)。esi-ms(m/e)：964.36[m+1]⁺。

4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds的合成

将86mg4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl冰浴条件下加入1.35ml三氟乙酸，0.45ml三氟甲磺酸(v:v＝3:1)，反应30min。所得化合物为用乙醇反复磨洗，得到标题产物80mg。esi-ms(m/e)：629.62[m+1]⁺

ru-co-rgds的合成

取顺-2,2'联吡啶二氯化钌35mg和4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-rgds79mg于50ml两口烧瓶中，加入50％乙醇10ml，避光，充入n2的条件下回流反应10h。回流反应结束后，旋干溶液。加入5ml纯净水溶解，加入饱和六氟磷酸盐溶液，出现红橙色沉淀。1000rpm，离心3min。经过鉴定，上清液中产物含量多。取上清液，旋干。甲醇乙醚体系重结晶，最后得到终产物150mg。q-tof(m/e)：521.6482[m/2]²⁺。

实验结果

对boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl进行鉴定，质谱(esi-ms，见图3)，氢谱(见图4)，液相(见图5)。对产物ru-co-rgds进行鉴定，旋光结果：[α]²⁶d^＝6.817±0.9388(c＝0.1g/100ml,h2o)；熔点163.3±1.2℃；质谱(q-tof见图6)，红外(见图7)，紫外(见图8)，荧光(见图9)检测：激发波长450nm，最高峰出现在634.5nm。

ru-co-rgds/vegf-sirna的制备

将vegf-sirna与小牛胸腺dna按照2：1(v:v)的比例混合，反复吹打，室温下静置10min。同时将ru-co-rgds与鱼精蛋白混合，反复吹打，室温下静置10min。后将ru-co-rgds/鱼精蛋白复合物加入到sirna/dna复合物中，反复快速吹打，室温静置30min，即得ru-co-rgds/vegf-sirna。

实施例2.ru-co-rgds/vegf-sirna的体外抗肿瘤活性评价

激光共聚焦显微镜考察sirna的转染效果

宫颈癌细胞hela是贴壁生长的细胞，以适量浓度接种于培养瓶中，加入含10％胎牛血清，100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的deme完全培养液，置于37℃恒温、5％co2饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期hela细胞，先用pbs洗涤三遍，加1ml胰酶,消化3min后，离心(2000rpm、3min)，用含10％胎牛血清的deme培养基调整细胞浓度至1×10⁵个/ml，每个激光共聚焦培养小皿中加入2ml，共四组，37℃恒温、5％co2培养过夜。小心弃掉上清液，pbs洗一次，加入2ml含有100nmru-co-rgds/fam-vegf-sirna、fam-vegf-sirna、lipo2000/fam-vegf-sirna的无血清dmem培养基，另一个空白组培养皿加入2ml无血清dmem培养基，转染4h。吸除上清液，1mlpbs洗3次，每个培养皿加1mlhoechst染液(pbs稀释，工作浓度为4μg/ml)，染色15min。之后吸除上清液，用1mlpbs洗3次，最后加入1mlpbs。置于激光共聚焦显微镜下观察。

实验结果

本实验中，ru-co-rgds表面吸附的sirna是fam标记的vegf-sirna，从图10中我们可以看出ru-co-rgds/fam-vegf-sirna组的细胞核(被hoechst33342染成蓝色)周围有绿色荧光(fam)，而blank组和vegf-sirna组细胞核周围没有绿色的荧光，阳性对照组lipo2000/fam-vegf-sirna有绿色荧光。可以得出结论：vegf-sirna被ru-co-rgds成功递送进hela细胞内，并且分布在细胞核周围。

ru-co-rgds的细胞毒作用

将hela细胞以适量浓度接种于培养瓶中，加入含10％胎牛血清,100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的dmem完全培养液，置于37℃恒温、5％co2饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期hela细胞，先用pbs洗涤三遍，加1ml胰酶，消化3min后，离心(2000rpm、3min)，用含10％胎牛血清的dmem培养基调整细胞浓度至4×10⁴个/ml。取96孔培养板，pbs液封，设空白培养基组，其余每孔加入100μl细胞悬液，在37℃，5％co2的培养箱中培养过夜。小心弃去培养液，加入含ru-co-rgds的dmem培养基100μl，浓度依次为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、150μg/ml。每个浓度设置六个复孔。置于培养箱内培养48h。每孔加入25μl新鲜配制的浓度为5mg/ml的mtt，37℃，5％co2培养箱继续培养4h。离心后小心弃去上清液，并加入150μldmso，用微型振荡器震荡700r，10min。混匀后，在酶标仪上以检测波长为490nm测定吸光度(od)值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝[(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)]×100％。上述实验重复三次。

实验结果

从图11中我们可以看出随着浓度的增加，与空白组相比较，细胞存活率没有明显性差异(p>0.05)。因此修饰后的载体ru-co-rgds对hela细胞是没有毒性的。

ru-co-rgds/vegf-sirna的体外抗肿瘤活性

取对数生长期的hela细胞，胰酶消化后，用含10％胎牛血清的dmem培养基调整细胞浓度至4×10⁴个/ml。每孔种100μl细胞悬液于96孔培养板内，37℃，5％co2培养过夜。小心弃去培养液，加入100μl含40nm，80nm，100nm和120nmru-co-rgds、vegf-sirna、ru-co-rgds/nc、ru-co-rgds/vegf-sirna、lipo2000/nc和lipo2000/vegf-sirna的无血清dmem培养基。每组每个浓度设置六个复孔。转染4h，小心弃掉上清液，加入完全dmem培养基弃继续培养44h。每孔加入25μl新鲜配制的浓度为5mg/ml的mtt，37℃，5％co2培养箱继续培养4h。离心后小心弃去上清液，并加入150μldmso，用微型振荡器震荡700r，10min。混匀后，在酶标仪上以检测波长为490nm测定吸光度(od)值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝[(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)]×100％。上述实验重复三次。

实验结果

从图12中可以得出以下结论：

(1)不同浓度的ru-co-rgds、ru-co-rgds/nc、和阴性对照组vegf-sirna分别与blank(即浓度为0的细胞)比较，无显著性差异(p>0.05)，说明裸的vegf-sirna和单独的载体ru-co-rgds对细胞增殖均无抑制作用。

(2)不同浓度的ru-co-rgds/vegf-sirna与blank(即浓度为0的细胞)比较，当浓度为40nm时，有差异(p<0.05)，当浓度为60nm时，有显著性差异p<0.01)；相同浓度的ru-co-rgds/vegf-sirna与ru-co-rgds/nc、阴性对照组vegf-sirna相比较，当浓度为40nm时，有差异(p<0.05)，当浓度为60nm时，有显著性差异(p<0.01)；相同浓度的ru-co-rgds/vegf-sirna与阳性对照组lipo2000/vegf-sirna比较，无显著性差异(p>0.05)，即ru-co-rgds/vegf-sirna表现出较好的体外抗肿瘤活性。

(3)ru-co-rgds/vegf-sirna对hela细胞的抑制作用呈现一定的浓度依赖性，即随着浓度的增加，其抑制作用表现出增强趋势。

从图9中我们可以看出随着ru-co-rgds/vegf-sirna的浓度增加，细胞存活率逐渐下降，即其抗肿瘤活性逐渐增强，呈现浓度依赖性。其ic50为122.6nm。

实施例3ru-co-rgds/vegf-sirna的蛋白水平沉默效率评价

细胞培养

取对数生长期hela细胞，胰酶消化后，用含10％胎牛血清的dmem培养基调整细胞浓度至1×10⁵个/ml，每孔加2ml于六孔板中，设三个复孔，培养过夜当细胞密度长至80％左右时，弃掉上清，加入2ml含有100nmvegf-sirna，ru-co-rgds/nc、ru-co-rgds/vegf-sirna、lipo2000/vegf-sirna和lipo2000/nc的无血清dmem培养基，空白组加入2ml无血清dmem培养基，转染4h后换成新鲜的含10％fbs的dmem培养基，继续培养44h。

提取蛋白

冰上操作：细胞培养48h后，离心(1000rpm，10min)取上清即可。

bcaproteinassaykit定量裂解液中蛋白浓度

将上一步提取的蛋白裂解液稀释十倍，每组设置三个复孔，根据bca工作液试剂盒操作步骤,测定每组蛋白浓度，做下记录，求每组样品总蛋白浓度平均值。

humanvegfelisa试剂盒测定样品蛋白中vegf的含量

蛋白上样量为120μg，根据蛋白浓度，加入相应体积的蛋白裂解液并用depc水定容到50μl，根据试剂盒步骤操作最后在450nm下测定od值。上述实验重复三次。

实验结果

蛋白定量结果

绘制标准曲线

不同浓度的标准蛋白的od值

标准方程为y＝0.001x+0.1345。r²＝0.9939

各组蛋白样品中总蛋白量

elisa

各组蛋白样品中vegf蛋白的相对含量

从图13中我们可以看出，裸的vegf-sirna组与空白组相比，没有明显性差异(p>0.05)，即裸的vegf-sirna不能下调hela细胞vegf蛋白的表达；ru-co-rgds/nc和lipo2000/nc与空白组相比较，没有明显性差异(p>0.05)，表明载体材料对vegf蛋白的表达没有影响；而ru-co-rgds/vegf-sirna分别与vegf-sirna/nc、blank组相比均有明显性差异(p<0.01)，与lipo2000/vegf-sirna阳性对照组相比，没有明显性差异(p>0.05)，说明ru-co-rgds将vegf-sirna递送进入细胞并成功下调vegf蛋白的表达。

实施例4.ru-co-rgds/vegf-sirna的mrna水平沉默效率评价

细胞培养

取对数生长期hela细胞，细胞密度达到80％左右时，用pbs洗涤三遍，加入1ml胰酶消化3min，离心(2000rpm，3min)，用含10％胎牛血清的dmem培养基调整细胞浓度至1×10⁵个/ml，每孔加2ml于六孔板中，培养过夜，设三个复孔，弃掉上清，加入2ml含有100nmvegf-sirna，ru-co-rgds/nc，ru-co-rgds/vegf-sirna，lipo2000/nc，lipo2000/vegf-sirna的无血清dmem培养基，转染4h，换成新鲜含血清的dmem培养基，继续培养44h。

rna的提取

(1)首先弃掉六孔板的上清液，然后用1mlpbs洗涤三次，每孔加入1mltrizol裂解液(每10cm²加入1mltrizol)。吹打均匀并室温裂解10min，将裂解液转移至无rnaseep管，静置5min。

(2)相分离。在每1mltrizol加入0.2ml氯仿，然后剧烈振荡，室温放置3分钟，离心(4℃，12000rpm，15min)。液体分成三层，下层的红色为苯酚-氯仿相，上层是无色的水相。rna存在于水相中，水相约占总体积的50％。

(3)沉淀rna。小心地将上层水相液体转移到另一干净的无rnaseep管中，然后每管加入0.5ml异丙醇，混匀，室温静置10min，然后离心(4℃，12000rpm，10min)。离心后在管的底部可看到絮状半透明胶样的rna沉淀。

(4)洗涤rna。小心去除上清，加入1ml配制好的75％乙醇(depc水配制)，洗涤rna沉淀，振荡器混匀，离心(4℃，12000rpm，10min)，小心弃去上清。

(5)rna的复溶。将rna沉淀放置10min，待rna沉淀干燥。但是注意不能将rna沉淀完全干燥，因为这会极大地降低它的溶解度。用depc水重悬rna沉淀，并且用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55℃水浴10-15min。-20℃保存；

(6)测rna浓度：用depc水校正nanodrop-1000后，取2μl混匀后的rna溶液样品，滴加到测量臂上，选择rna，点击measure测量。同法依次测量所有rna溶液样品。

逆转录

(1)样品准备：逆转录rna上样量为2μg,根据上一步测得的rna浓度，计算出我们所需rna体积。

(2)取microamp^tmoptical96-wellreactionplate，每个反应孔加10μl2×rtbuffer，1μl20×rtenzymemix，加入相应体积的rna溶液，用depc水补足20μl。用opticaladhesivefilm将板子封口。离心(4℃，1000rmp，3min)，排出聚集在反应孔底部的气泡。

(3)放入pcrsystem9700中,设置反应条件：94℃-5min，94℃-30s，55℃-30s，72℃-25s，72℃7min,4℃∞，共30个循环。

(4)测浓度：反应结束后，首先用depc水校正nanodrop-1000，取2μl混匀后的cdna溶液样品，滴加到测量臂上，盖上测量臂，选择dna-50，点击measure测量。同法依次测量所有cdna溶液样品，并记录下测量的结果。按照上样量进行稀释，稀释后用同样的方法进行测定。

rt-pcr

cdna的上样量为20ng，据此计算所需加入的各cdna样品的体积。每个反应孔加入10μlgeneexpressionmastermix、1μl探针标记的引物(vegf或gapdh)、相应体积的cdna样品，以depc水补齐20μl，摇匀。离心(4℃，1000rmp，3min)，使液体聚集于底部并排出气泡；放入appliedbiosystems7500real-timepcrsystem中,设置条件。hold:50℃2min，95℃10min，cycle(40cycles)，95℃15s，60℃1min。

数据处理中，根据ct值以gapdh为内参，运用2^-△△ct法相对定量各实验组mrna的量。上述实验重复三次。

实验结果

提取的各组rna浓度

提取的各组rna浓度

逆转录后各组的cdna的浓度

逆转录后各组的cdna的浓度

rt-pcr

rt-pcr后各组2^-△△ct值如下表所示：

genesilencingefficiencyonvegf-sirnalevel

从图14可以看出：

(1)裸的vegf-sirna组与空白组相比，没有显著性差异(p>0.05)，说明裸的vegf组对vegf-mrna的转录没有影响；

(2)ru-co-rgds/nc组和lipo2000/nc组与空白组相比，没有显著性差异(p>0.05)，说明载体材料对vegf-mrna的转录没有影响；

(3)ru-co-rgds/vegf-sirna组分别与空白组和ru-co-rgds/nc相比较，均有明显性差异(p<0.01)，而与lipo2000/vegf-sirna组相比，没有明显性差异(p>0.05)，可以得出ru-co-rgds/vegf-sirna能够下调vegf-mrna的转录水平，并且效率和阳性对照组相当。

实施例6.ru-co-rgds/vegf-sirna的体内抗肿瘤活性研究

实验分组

实验共分为5组，分别是生理盐水组(ns)，ru-co-rgds/vegf-sirna组，裸vegf-sirna组，ru-co-rgds组，盐酸阿霉素组(dox)。每组12只小鼠，四组共60只。

给药剂量

(1)ru-co-rgds/vegf-sirna组：vegf-sirna剂量为0.3mg/kg，ru-co-rgds的剂量为0.498mg/kg，即按质量比为1.66:1配制药品并给药

(2)vegf-sirna组：剂量为0.3mg/kg

(3)ru-co-rgds组：剂量为0.498mg/kg

(3)dox组：剂量为2μmol/kg

(4)ns：等体积的生理盐水，即每只0.2ml

给药方式：尾静脉注射

实验动物：icr小鼠，雄性，体重20±2g(x±sd)，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供。

实验方案

建立荷s180腹水瘤小鼠模型：取1×10⁷个/ml的s180细胞悬液于健康小鼠腋皮下接种，0.2ml/只，小鼠接种瘤液后养7天至瘤体积(长×宽²/2)为150mm³左右，将全部小鼠随机分组，分为5组，并编号。测量体重，然后开始给药，ru-co-rgds/vegf-sirna、vegf-sirna、ru-co-rgd组按给药剂量每天尾静脉注射给药一次，每次0.2ml/只，连续给药5天；阴性对照以等体积的生理盐水尾静脉注射给药，每天给药一次，0.2ml/只，连续给5天；阳性对照dox组以尾静脉注射给药，按给药剂量每天给药一次，0.2ml/只，连续给药5天，每天按编号测量小鼠体重。

实体瘤抑瘤率及脏器指数的测定

每组连续给药5天后，于第6天脱颈椎处死小鼠，处死前称取体重，然后将小鼠解剖，取出瘤、脑、心、肝、脾、肾，并称重，按如下公式计算抑瘤率。

抑瘤率％＝[(生理盐水组平均瘤重－给药组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重]×100％。数据统计均采用t检验和方差分析，以(mean±sdg)表示。

从图15中我们可以看出，裸的vegf-sirna组与空白组相比，没有显著性差异(p>0.05)，说明裸的vegf-sirna对肿瘤的生长无抑制作用；ru-co-rgds/vegf-sirna与空白组相比较，有显著性差异(p<0.05)，与dox组相比,没有显著性差异(p>0.05)，说明ru-co-rgds/vegf-sirna明显抑制肿瘤的生长，抑瘤率接近于阳性药dox；从图16中可以看出，ru-co-rgds/vegf-sirna组，裸vegf-sirna组，ru-co-rgds组，盐酸阿霉素组(dox)的抑瘤率。