一种胶原蛋白植入剂及其制备方法与流程

本发明涉及医疗美容领域，具体地，本发明涉及一种胶原蛋白植入剂及其制备方法。
背景技术：
：随着生活质量的提高，人们不仅追求生活得健康，更追求生活得美丽。人们寻找安全、有效、经济的方式减轻老化迹象，减少脸部皱纹，改变容貌。近年来相对安全有效的医疗美容方式是在面部软组织直接注射填充剂，修复皮肤组织缺损。注射美容技术已经成为软组织填充美容手术的主要项目之一，其不开刀、不流血的微创性及操作方便、见效快等特点被广大爱美人士所推崇。胶原类产品分为动物源和人源，动物源性胶原可能会引起排斥反应，一般均需先进行过敏皮试，常有动物胶原植入剂产品引起出血斑，肉芽瘤等并发症报道。人自身胶原产品，免疫排斥反应低，不需要进行皮试测试，但目前专利报道的产品制备周期较长，生产工艺较为复杂，设备要求较高，产品成本较高，且有效性不足。申请号为200810007484.7的中国发明专利申请公开了一种采用人发角蛋白制备软组织填充材料的方法，具体是利用人发中段作为原料，经过清洗、漂白、研磨加工、冻干、包装、钴60辐照处理，将人发制备成粉体匀浆及液体人发角蛋白颗粒。该发明原料来源受限，难以工业化，蛋白颗粒较大，注射痛感明显；且异体蛋白未进行免疫原性方面的处理，作为填充材料具有较高安全性风险。申请号为200810147082.7的中国发明专利申请公开了一种长效型胶原蛋白及其制造方法，具体是将猪皮经过刮除多余组织、去除油脂、膨润、消化、离心分离、盐析、收集下层沉淀物、冷冻干燥后即可得胶原蛋白，再将该胶原蛋白与γ-聚麸胺酸(γ-pga)混合，同时加入戊二醛溶液并搅拌均匀，进行第一交联，再重复加入该戊二醛溶液搅拌均匀，进行第二次交联后，即可得该长效型胶原蛋白，其可解决胶原蛋白的存留时间过短的问题，但是必须常常补充施打，此外还存在残留高浓度的戊二醛、具有生物毒性会危害人体健康等缺点。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种胶原蛋白植入剂及其制备方法。一方面，本发明提供了一种胶原蛋白植入剂，按照重量百分比计，包括：2-8％的胶原蛋白，0.1-0.5％的添加剂，和余量的磷酸生理缓冲液。前述的胶原蛋白植入剂，所述胶原蛋白是采用微生物发酵法获得的重组人源胶原蛋白。前述的胶原蛋白植入剂，所述胶原蛋白是经过化学交联法处理得到的改性胶原蛋白，且交联度为50-90％。前述的胶原蛋白植入剂，所述添加剂是羧甲基纤维素钠、乳酸钠、透明质酸钠、海藻酸钠中的任意一种或多种。前述的胶原蛋白植入剂，所述磷酸生理缓冲液中还含有0.25-0.35％利多卡因。另一方面，本发明提供了胶原蛋白植入剂的制备方法，包括：将胶原蛋白分散在磷酸生理缓冲液中，并加入添加剂；和随后进行均质乳化处理得到植入剂。前述的制备方法，所述胶原蛋白是采用微生物发酵法获得的重组人源胶原蛋白。前述的制备方法，在将胶原蛋白分散在磷酸生理缓冲液中之前，先对所述胶原蛋白进行如下处理：将所述胶原蛋白加入交联剂中进行交联处理，随后除去交联剂并对得到的改性胶原蛋白进行洗涤。前述的制备方法，所述交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚、戊二醛、京尼平或碳化二亚胺；所述交联剂的浓度是0.05-0.5mol/l。前述的制备方法，所述交联剂与所述胶原蛋白按照5-10:1进行反应。前述的制备方法，所述交联处理的处理温度是18-28℃，处理时间是6-20小时。前述的制备方法，所述洗涤是用纯化水或磷酸生理缓冲液清洗3-5次，每次10-15分钟。前述的制备方法，在均质乳化处理之后，进一步包括：将植入剂灌装于预灌封注射器中，随后灭菌，以供一次性使用。前述的制备方法，所述灭菌是采用钴60以15-30kgy的辐照剂量进行辐照灭菌。相对于现有技术，本发明的胶原蛋白植入剂及其制备方法具有如下有益效果：①本发明采用的胶原蛋白是以基因工程的方法微生物发酵获得的重组人源胶原蛋，其稳定性好、纯度高、无热原风险。②采用化学交联法对胶原蛋白进行改性处理，提高了产品耐降解性，增加临床使用优势。③预灌封后的产品采用钴60辐照灭菌保证产品的无菌水平(10-6)，确保使用安全性。附图说明图1表示采用本发明实施例1的胶原蛋白植入剂样品进行推挤力测试所得到的结果，其中，纵坐标为推挤力大小，单位n；横坐标为推进时间，单位s。图2表示采用本发明实施例1的胶原蛋白植入剂样品进行动物有效性实验所得到的结果，其中，w表示周数，例如1w表示第1周，以此类推。具体实施方式为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。本发明的工艺方法除下述内容外，其余均采用本领域的常规方法或装置。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种胶原蛋白植入剂，按照重量百分比计，包括：2-8％的胶原蛋白，0.1-0.5％的添加剂，和余量的磷酸生理缓冲液。优选地，该胶原蛋白植入剂，按照重量百分比计，包括：3.5-5％的胶原蛋白，0.1-0.25％的添加剂，和余量的磷酸生理缓冲液。其中，本发明采用的胶原蛋白优选是采用微生物发酵法获得的重组人源胶原蛋白，例如，可以采用如下方法获得：构建毕赤酵母工程菌，筛选高表达毕赤酵母工程菌进行发酵生产，超滤系统浓缩及离子交换层析等进行胶原蛋白纯化，胶原蛋白溶液经0.22um膜过滤后冻干，获得胶原海绵即为可用于本发明的重组人源胶原蛋白。具体可参考申请号为201610388271.8、名称为“一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法”的发明专利申请，该专利申请通过引用的方式整体并入本申请中。这种胶原蛋白活性高、无病毒残留、无免疫原性、无内毒素，是纯生物制剂，也不会产生热原风险，并且生物相容性好、安全性高。更优选地，前述的重组人源胶原蛋白先经过化学交联法处理得到改性胶原蛋白，之后再用于本发明中。其中，经过化学交联法处理得到的改性胶原蛋白的交联度为50-90％，优选为70-80％。发明人通过研究发现，当改性胶原蛋白的交联度不低于50％时，其在体内的降解时间可达到6个月或更长，并且，通过研究，发明人总结出如下规律：交联度体内降解时间50％6～7个月60％7～8月70％9～10月80％10～12月另外，经过改性的胶原蛋白色泽更加白亮，且疏水性增强，便于后期均质乳化。其中，前述的添加剂是羧甲基纤维素钠、乳酸钠、透明质酸钠(优选分子量是160-180kda)、海藻酸钠等中的任意一种或多种。它们的主要作用是改进和调节植入剂的粘性以及实现均一性和适用性等。这些物质均可通过常规市购获得。其中，磷酸生理缓冲液即磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，简称pbs)，是常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液。它是一种水基盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，有助于保持恒定的渗透压和ph值，其主要作用是使胶原蛋白植入剂的ph值适合于植入人体或动物体。在实际生产中，本领域技术人员能够根据需要配置磷酸生理缓冲液。优选地，磷酸生理缓冲液中还含有一定量的利多卡因，例如，本发明可采用含有0.25-0.35重量％(0.3重量％)利多卡因的磷酸生理缓冲液，利多卡因具有局部麻醉的作用，具有麻醉起效快的特点，本发明添加适量的利多卡因可有效增加产品临床适用性，减少痛感，便于使用者进行操作。本发明提供的胶原蛋白植入剂适用于医疗美容领域，主要适用于软组织填充领域，主要针对面部皱纹(例如，眉间纹、抬头纹和鱼尾纹等)、瘢痕及其它需填充的软组织部位等，具有使用方便、安全性高，有效期久的优点。根据本发明的另一个方面，本发明提供了上述胶原蛋白植入剂的制备方法，包括：按上述重量百分比将胶原蛋白分散在磷酸生理缓冲液中，并加入添加剂；随后进行均质乳化处理得到产品。优选地，所述胶原蛋白是采用微生物发酵法获得的重组人源胶原蛋白。更优选地，所述重组人源胶原蛋白是经过化学交联法处理的改性胶原蛋白，且交联度为50-90％。在一种优选的具体实施方式中，本发明的胶原蛋白植入剂的制备方法，包括：(1)将微生物发酵法获得的重组人源胶原蛋白加入交联剂中进行交联处理，随后除去交联剂并对得到的改性胶原蛋白进行洗涤，冻干得到胶原蛋白粉。其中，交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚、戊二醛、京尼平或碳化二亚胺；本发明中提到的交联剂既是指已配制成溶液的交联剂溶液，浓度是0.05-0.5mol/l。其中，所述交联剂与所述胶原蛋白按照5-10:1进行反应。，也就是，按照将1克胶原蛋白加入5-10毫升交联剂中的比例。其中，交联处理是在18-28℃的温度下处理6-20小时。其中，除去交联剂是以1000-10000rpm的离心速率通过高速离心的方式分离除去上清液。其中，洗涤是用纯化水或磷酸生理缓冲液清洗3-5次，每次10-15分钟。(2)按照本发明第一方面中的重量百分比，将胶原蛋白粉分散在含有0.3％利多卡因的磷酸生理缓冲液中，并加入添加剂，充分溶胀并搅拌均匀得到混合物。其中，添加剂是羧甲基纤维素钠、乳酸钠、透明质酸钠、海藻酸钠等中的任意一种或多种。这些物质均可通过常规市购获得。(3)均质乳化处理以及分装和灭菌。采用高压微射流均质机及乳化机对上述混合物进行均质乳化处理，随后灌装于预灌封注射器中，预灌封注射器针头大小采用27-30g，预灌封注射器的容积可以为1ml、2ml、5ml等。并采用钴60以15-30kgy的辐照剂量进行灭菌，以供一次性使用。预灌封后的产品采用钴60辐照灭菌保证产品的无菌水平(10-6)，确保使用安全性。按照本发明所述方法制备的样品生物相容性好，具有良好的保湿效果；同时产品均质化处理后均匀性性可靠，便于临床医师操作使用；加入的利多卡因显著降低患者痛感；最终工艺采用无菌处理，有效保证产品安全性。实施例下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下列实施例中采用的胶原蛋白是采用申请号为201610388271.8、名称为“一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法”的发明专利申请中公开的方法制备获得的重组人源胶原蛋白，由seqidno：1所示的氨基酸序列组成，确认其分子量约为38kd，纯度约为99.2％。实施例1本实施例的胶原蛋白植入剂的组成如下(％表示重量百分比)：经过交联处理的改性胶原蛋白：4.5％，其交联度为67％；透明质酸钠：0.1％；和余量的含有0.3％利多卡因的磷酸钠缓冲液。本实施例的胶原蛋白植入剂的制备方法如下：(1)将胶原蛋白以1：10(w/v)比例加入浓度为0.1mol/l的戊二醛交联剂溶液中，交联时间12h，作用温度20℃，得到的改性胶原蛋白的交联度为67％；在离心机中以5000rpm速率进行离心并除去上清液，随后用清水漂洗改性胶原蛋白，共漂洗3次，每次15min；采用冷冻干燥机冻干改性的胶原蛋白粉。(2)将4.5％胶原蛋白粉分散在含有0.3％利多卡因的磷酸钠缓冲液中，同时添加0.1％透明质酸钠，充分溶胀，搅拌均匀得到混合物；(3)采用高压微射流均质机及乳化机对上述混合物进行均质乳化处理，随后灌装于预灌封注射器中，每支的剂量为1ml，并采用钴60以15kgy的辐照剂量进行灭菌，以供一次性使用。实施例2本实施例的胶原蛋白植入剂的组成如下(％表示重量百分比)：经过交联处理的改性胶原蛋白：3.5％，其交联度为75％；羧甲基纤维素钠：0.15％；和余量的含有0.3％利多卡因的磷酸钠缓冲液。本实施例的胶原蛋白植入剂的制备方法如下：(1)将胶原蛋白以1：5(w/v)比例加入浓度为0.2mol/l的碳化二亚胺交联剂溶液中，交联时间20h，作用温度25℃，得到的改性胶原蛋白的交联度为75％；在离心机中以1000rpm速率进行离心并除去上清液，随后用清水漂洗改性胶原蛋白，共漂洗3次，每次15min；采用冷冻干燥机冻干改性的胶原蛋白粉。(2)将3.5％胶原蛋白粉分散在含有0.3％利多卡因的磷酸钠缓冲液中，同时添加0.15％羧甲基纤维素钠，充分溶胀，搅拌均匀得到混合物；(3)采用高压微射流均质机及乳化机对上述混合物进行均质乳化处理，随后灌装于预灌封注射器中，每支的剂量为2ml，并采用钴60以20kgy的辐照剂量进行灭菌，以供一次性使用。实施例3本实施例的胶原蛋白植入剂的组成如下(％表示重量百分比)：经过交联处理的改性胶原蛋白：5％，其交联度为78％；乳酸钠：0.1％；透明质酸钠：0.15％；和余量的含有0.3％利多卡因的磷酸钠缓冲液。本实施例的胶原蛋白植入剂的制备方法如下：(1)将胶原蛋白以1：15(w/v)比例加入浓度为0.5mol/l的京尼平交联剂溶液中，交联时间8h，作用温度4℃，得到的改性胶原蛋白的交联度为78％；在离心机中以10000rpm速率进行离心并除去上清液，随后用清水漂洗改性胶原蛋白，共漂洗3次，每次15min；采用冷冻干燥机冻干改性的胶原蛋白粉。(2)将5％胶原蛋白粉分散在含有0.3％利多卡因的磷酸钠缓冲液中，同时添加0.1％乳酸钠和0.15％透明质酸钠，充分溶胀，搅拌均匀得到混合物；(3)采用高压微射流均质机及乳化机对上述混合物进行均质乳化处理，随后灌装于预灌封注射器中，每支的剂量为5ml，并采用钴60以25kgy的辐照剂量进行灭菌，以供一次性使用。实施例4-7实施例4-7的胶原蛋白植入剂的组成如表1所示，制备方法类似与实施例1，不同之处只是根据交联度来调整具体的交联时间和温度。表1效果检测实施例上述各实施例制备的胶原蛋白植入剂可用于面部法令纹、鱼尾纹、抬头纹或瘢痕及其它可行的软组织部位填充等，具有使用方便、安全性高，有效期长等优势。同时发明人还对本发明的植入剂进行了多项检测验证安全性和有效性，具体如下：1)无菌检测对实施例1-7的胶原蛋白植入剂进行无菌检测，具体为无菌拆开外包装，分别接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中，按照《中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录ⅻa规定的方法测定，结果均显示无菌。2)细菌毒性检测取实施例1的胶原蛋白植入剂的样品按照gb/t16886.5-2003中规定的评价方法进行评价，具体为：将传代48-72h生长旺盛的l929细胞胰酶消化收集，用高糖dmem培养基配置成1×104/ml的细胞悬液，接种至96孔板中，每孔200μl。样品按照1:9比例浸提(w/w)，浸提介质为含10％新生牛血清的高糖dmem培养液，浸提温度为37℃，浸提时间为24h。将试验组、空白组及阳性对照组分别加入细胞悬液中，置于37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱培养，每天显微镜下观察细胞形态。在培养第5d时，使用酶联免疫检测仪在490nm波长下测各孔吸光度值(od值)，用空白调零孔od值调零，取平均值并记录。根据各组的吸光度均值计算细胞的相对增值率，结果如表2所示。细胞毒性反应分级标准表2样品编号12345细胞增值率91％92％91％88％89％根据细胞毒性反应分级标准可知，细胞毒性均为1级，说明材料安全性高，无明显细胞毒性。发明人还对实施例2-7的样品进行了上述细菌毒性检测，也得到的类似的结果。3)推挤力取实施例1的胶原蛋白植入剂的样品，以恒定的速度推动注射器推进杆，注射器针头为30g，推动速度30mm/min，检测结果为推挤力均小于15n(如图1所示)，符合外科手术适手性要求。发明人还对实施例2-7的样品进行了推挤力，也得到的类似的结果。4)动物有效性大鼠皮内植入实验检测样品安全性和有效性，具体方法为：大鼠背部两侧进行样品注射，其中实验组采用本发明实施例1的胶原蛋白植入剂样品，另一侧对照组为双美胶原蛋白植入剂(购买自台湾双美(sunmax)生物科技股份有限公司，型号为双美1号)，每个注射点为0.1ml，分别于1w、16w、32w进行取材，翻开大鼠背部真皮内侧观察材料降解情况，结果如图2所示。由图2结果可看出，对照组降解明显快于实验组，16w时对照组部分降解，实验组无明显降解，32w时实验组样品肉眼依然清晰可见，对照组材料已经完全降解完全。实验结果证明，本发明的胶原蛋白植入剂有效期更长且生物相容性好。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本方面的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12