用于治疗心力衰竭的药物及其筛选方法和制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种以mirna-665为药物作用靶点的用于治疗心衰的药物及其筛选方法和制备方法。

背景技术：

microrna(mirna,mir)是一类新近发现的来源于内源性发夹结构转录本的长度大约为22个核苷酸的内源性小分子非编码单链rna，通过与靶mrna的3’非翻译区(3’untranslatedregion,3’utr)特异性结合，促进靶mrna降解，或者抑制靶mrna翻译，降低编码蛋白质水平，从而实现对基因转录后的表达调控。mirna与机体的多种疾病联系紧密，包括神经退行性疾病、糖尿病、肾病以及肿瘤等。近年来的研究发现，mirna在心脏的生成、发育和功能方面均有着重要作用。

心力衰竭是我国年死亡率最高的疾病之一，是多种心脏疾病发展的终末阶段，如冠心病、心律失常和高血压等，导致社会经济负担加重。关于心力衰竭的预防、诊断和治疗工作，目前仍存在巨大的不足，治疗率、控制达标率低，心功能iii-iv级的心力衰竭患者其年死亡率达到40％。

心力衰竭的病因和发病机制复杂，涉及多种信号通路。目前世界卫生组织推荐的药物治疗方案包括：利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂(acei)、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂、血管紧张素ii受体拮抗剂(arb)、洋地黄和伊伐布雷定，但尚不能达到让人满意的效果。mirna参与许多重要病理生理过程，由于单一mirna可调控多个靶基因的表达，因此针对疾病关键mirna靶点的药物可参与多种信号通路调控，从而为心力衰竭的治疗带来新的希望。

近年来研究发现，mir-208a可导致肌肉生长抑素和甲状腺激素相关蛋白等与心肌生长和肥厚相关的负调节因子减少，导致心肌肥厚甚至心力衰竭。但是目前为止尚未见关于mir-665在心力衰竭中的治疗作用及相关的治疗药物用途的报道。

目前多采用腺病毒和慢病毒作为mirna的表达载体，但腺病毒载体表达时间短、对机体有免疫原性，慢病毒多由白血病病毒或hiv改造而来，生物安全性堪忧，均不适合将来的临床应用。

技术实现要素：

本发明人根据本领域客观存在的上述问题和不足，偶然发现了hsa-mir-665与心衰发生机制之间的关系，并进一步进行分子实验，开放出一种以hsa-mir-665为药物靶点的抗心衰药物，同时进行动物实验验证其效果，发现以hsa-mir-665为药物作用靶点，且下调表达hsa-mir-665的分子能显著改善小鼠心脏功能，治疗心力衰竭。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种用于治疗心力衰竭的药物，其特征在于，所述药物的药效成分以hsa-mir-665为药物靶点，且通过结合、降解、和/或下调表达所述hsa-mir-665起到所述治疗心力衰竭的药效。本发明通过实验发现，心力衰竭患者外周血中hsa-mir-665的表达水平增高(图1a)，且与心脏射血分数呈负相关性(图1b)，这表明hsa-mir-665可能在心力衰竭病理生理过程中起到破坏作用，并进一步进行小鼠实验，通过结合(例如，反义互补)、降解hsa-mir-665、和/或降低hsa-mir-665的表达，均可明显改善tac小鼠的心脏射血分数(图5a)，并能有效改善冠脉储备功能(图5b)，从而实现增强心脏功能，达到心衰治疗的目的。

在进一步的实施例中，所述药物的药效成分包括可降解、和/或下调表达所述hsa-mir-665的物质；所述药物的药效成分优选为可下调表达所述hsa-mir-665的物质。本领域技术人员熟知，hsa-mir-665做为动物体内的一段微小rna，可以通过分子生物学手段使其表达下调、抑制从而达到降低其水平进而起到治疗作用，也可采用其它手段，例如某些化学分子，使其降解，也可同样达到降低其水平的目的。

在优选的实施例中，所述药物的药效成分包含与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665。分子生物学中最便捷简单的方式就是利用反义互补链与目的序列片段结合，使目的片段的数量减少，从而起到降低其表达水平，进一步治疗的作用。本领域技术人员熟知，分子生物学意义上的反向互补序列，可以在目标片段全长上进行反向互补，也可以部分长度地反向互补，也可以与目标片段全长反向互补后再长出一小段序列，具体地，在本发明中，目的片段hsa-mir-665的全长序列为20个碱基，其反义互补序列片段anti-hsa-mir-665可以是与hsa-mir-665的20个碱基全长互补的片段，也可以是与hsa-mir-665的20个碱基序列中某一段部分互补，长度在10-19个碱基之间的反义片段，也可以是除了与hsa-mir-665的20个碱基全长互补之外多出1-5个碱基的反义片段。因此，在本文中，所述反义互补具体指：所述anti-hsa-mir-665与所述hsa-mir-665的全长或部分序列呈反向互补，且所述anti-hsa-mir-665是长度为10-25个碱基的序列片段。

在更为优选的实施例中，所述药物的药效成分为可表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组质粒。

在本发明最具体的一个实施例中，所述药物的药效成分为表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组腺相关病毒质粒paav-d(+)-anti-mir-665；本发明采用的重组腺相关病毒载体(raav)克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，它可以携带目的基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动目的基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题，从而成为基因治疗最有前途的载体。本发明最具体的实施例构建的paav-d(+)-anti-mir-665表达载体，转染率可高达90％以上，使治疗效果更好。

更具体地，所述与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665可通过将如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对插入至腺病毒表达载体paav-d(+)中构建出paav-d(+)-anti-mir-665质粒进行表达。两段引物退火成双链核苷酸，且与hsa-mir-665序列互补，即为anti-hsa-mir-665，当与mir-665互补结合后，使得mir-665表达下降。

在另一些实施例中，所述药物还包括药学上可接受的辅料，和/或，用于缓冲、培养、和/或扩繁所述重组腺相关病毒质粒paav-d(+)-anti-mir-665的试剂；所述hsa-mir-665的序列如seqidno.3所示。本领域技术人员可根据客观需求，将本发明的抗心衰药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。

本发明的另一方面提供了可降解、和/或下调表达所述hsa-mir-665的物质；和/或，与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665；和/或，表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组质粒；和/或，表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组腺相关病毒质粒paav-d(+)-anti-mir-665，在制备抗心衰药物方面的用途。任何规模的出于商业目的将上述各物质装入标有抗心衰用途的商品包装内的行为均落入本发明请求保护的范围。

本发明第三方面提供一种抗心衰药物的筛选方法，其特征在于，检测待选物质是否能结合、降解、和/或下调表达hsa-mir-665，并筛选出能对hsa-mir-665的表达起抑制作用的物质。

本发明第四方面提供一种抗心衰药物的制备方法，其特征在于，包括：

将可降解、和/或下调表达所述hsa-mir-665的物质；和/或，与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665；和/或，表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组质粒；和/或，表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组腺相关病毒质粒paav-d(+)-anti-mir-665作为所述抗心衰药物的活性成分。

在进一步的实施例中，所述制备方法还包括：将可表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的引物对插入表达载体，从而制备得到可稳定表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组质粒。

在具体的实施例中，所述可表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的引物对如seqidno.1和seqidno.2所示；所述表达载体为腺相关病毒表达载体paav-d(+)。

为了实现心力衰竭的基因治疗目的，本发明将hsa-mir-665和anti-hsa-mir-665分别与重组腺相关病毒载体重组构建，并经检测获得满足治疗要求的高滴度，在动物实验中证实了其可以有效改善心力衰竭小鼠的心功能。因此，本发明基于上述发现和结果，提供一种以hsa-mir-665为治疗靶点的用于临床心力衰竭治疗的药物。

本发明基于hsa-mir-665的碱基序列，分别设计并合成了表达hsa-mir-665和反义互补anti-hsa-mir-665的序列，并成功分别插入真核表达载体paav-d(+)中构成重组质粒paav-d(+)-mir-665和paav-d(+)-anti-mir-665。之后，将以下三种质粒：1)pxx8或pxx9质粒、2)phelper质粒、3)paav-d(+)-mir-665或paav-d(+)-anti-mir-665质粒，用钙磷共转染法分别转入293细胞包装制备能分别表达hsa-mir-665和反义互补anti-hsa-mir-665的两种血清型重组腺相关病毒(raav8和raav9)，经纯化后，real-timepcr法测定滴度。下一步将包装制备的同一血清型的两种重组腺相关病毒(raav-mir-665和raav-anti-mir-665)分别经尾静脉注射至主动脉结扎术(tac)导致心力衰竭的小鼠中，发现小鼠心脏中hsa-mir-665的长期表达发生明显变化，说明重组腺相关病毒能介导hsa-mir-665/anti-hsa-mir-665的长期有效表达，从而促进/抑制心脏hsa-mir-665的表达。并且发现tac小鼠的心功能受到明显调控，重组腺相关病毒介导的anti-hsa-mir-665表达能明显改善tac小鼠的心功能，并且改善冠状动脉功能。而hsa-mir-665则破坏tac小鼠的心功能，进一步支持anti-hsa-mir-665的抗心力衰竭作用。

附图说明

图1显示了心力衰竭患者心功能水平与外周血hsa-mir-665表达水平的相关性；a：real-time法检测心力衰竭患者和正常对照人群外周血中hsa-mir-665的表达水平；b外周血hsa-mir-665表达水平与心脏射血分数的相关性。

图2是显示paav-d(+)-mir-665和paav-d(+)-anti-mir-665的质粒构成。

图3是纯化后的病毒转染细胞后荧光显微镜观察gfp(40x，绿色显示的是转染成功的细胞)，其转染效率可达90％以上。

图4是real-timepcr检测不同处理的tac小鼠心脏中hsa-mir-665的表达情况：其中，检测结果显示raav-mir-665和raav-anti-mir-665可明显调控tac小鼠心脏hsa-mir-665的表达(前者升高hsa-mir-665水平，后者降低hsa-mir-665水平)。

图5是心脏超声监测不同microrna治疗对tac小鼠心脏射血分数的影响以及不同microrna治疗对tac小鼠冠脉储备功能的影响；其中结果显示raav-anti-mir-665可明显改善tac小鼠的心脏射血分数(a)，并改善冠脉储备功能(b)；而raav-mir-665则明显降低tac小鼠的心脏射血分数(a)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

仪器设备

nd-1000

试剂与耗材

rnaseyminikit试剂盒购自qiagen；

trizolls购自invitrogen公司；

mirna检测试剂盒购自广州锐博公司；

琼脂糖凝胶dna回收试剂盒takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0购自takara公司；

endo-freeplasmidmaxikit质粒提取试剂盒购自omega公司；

easypureplasmidminiprepkit质粒提取试剂盒购自北京全式金公司；

真核表达载体paav-d(+)由合作的美国北卡大学肖啸教授构建并赠予，在中国专利zl201210069224.9“表达hsa-mir-21^＊的重组腺相关病毒的制备方法及其在高血压病治疗中的用途”一文中有记载，是已知的载体；申请人承诺自本发明申请日起20年内可向公众提供用于验证本发明的效果。

生物材料的来源

慢性心衰患者外周血及正常人群外周血来自2012-2014年武汉同济医院住院患者，均签署了知情同意书；

c57背景小鼠购自北京华阜康公司；

293t细胞来自美国atcc公司。

第1组实施例：

本发明第一组实施例提供了一种用于治疗心力衰竭的药物，在该组实施例中，都具有如下特征：所述治疗心力衰竭的药物的药效成分以hsa-mir-665为药物靶点，且通过结合、降解、和/或下调表达所述hsa-mir-665起到所述治疗心力衰竭的药效。本发明通过实验发现，心力衰竭患者外周血中hsa-mir-665的表达水平增高(图1a)，且与心脏射血分数呈负相关性(图1b)，这表明hsa-mir-665可能在心力衰竭病理生理过程中起到破坏作用，并进一步进行小鼠实验，通过结合(例如，反义互补)、降解hsa-mir-665、和/或降低hsa-mir-665的表达，均可明显改善tac小鼠的心脏射血分数(图5a)，并能有效改善冠脉储备功能(图5b)，从而实现增强心脏功能，达到心衰治疗目的的作用。

进一步地，所述药物的药效成分包括可降解、和/或下调表达所述hsa-mir-665的物质；所述药物的药效成分优选为可下调表达所述hsa-mir-665的物质。本领域技术人员熟知，hsa-mir-665做为动物体内的一段微小rna，可以通过分子生物学手段使其表达下调、抑制从而达到降低其水平进而起到治疗作用，也可采用其它手段，例如某些化学分子，使其降解，也可同样达到降低其水平的目的。

优选地，所述药物的药效成分包含与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665。分子生物学中最便捷简单的方式就是利用反义互补链与目的序列片段结合，使目的片段的数量减少，从而起到降低其表达水平，进一步治疗的作用。所述hsa-mir-665的序列如seqidno.3所示。

具体地，在本发明中的所述“反义互补”指：所述anti-hsa-mir-665与所述hsa-mir-665的全长或部分序列呈反向互补，且所述anti-hsa-mir-665是长度为10-25个碱基的序列片段。

本领域技术人员熟知，分子生物学意义上的反向互补序列，可以在目标片段的全长上进行反向互补，也可以部分长度地反向互补，也可以与目标片段全长反向互补后再长出一小段序列，具体地，在本发明中，目的片段hsa-mir-665的全长序列为20个碱基，其反义互补序列片段anti-hsa-mir-665可以是与hsa-mir-665的20个碱基全长互补的片段，也可以是与hsa-mir-665的20个碱基序列中某一段部分互补，长度在10-19个碱基之间的反义片段，也可以是除了与hsa-mir-665的20个碱基全长互补之外多出1-5个碱基的反义片段。

在本发明一些可替换的实施例中，一些与hsa-mir-665序列呈全长或部分序列的反义互补的具有10-25个碱基长度的序列片段，和/或可表达“与hsa-mir-665序列呈全长或部分序列的反义互补的具有10-25个碱基长度的序列片段”的重组质粒具有与下面实验例3相类似或等同的抗心衰效果，鉴于篇幅有限，本文中不再一一赘述。

更优选地，所述药物的药效成分为可表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组质粒。

在本发明最具体的一个实施例中，所述药物的药效成分为表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组腺相关病毒质粒paav-d(+)-anti-mir-665；本发明采用的重组腺相关病毒载体(raav)克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，它可以携带目的基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动目的基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题，从而成为基因治疗最有前途的载体。本发明最具体的实施例构建的paav-d(+)-anti-mir-665表达载体，转染率可高达90％以上，使治疗效果更好。

更具体地，所述与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665可通过将如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对插入至腺病毒表达载体paav-d(+)中构建出paav-d(+)-anti-mir-665质粒进行表达。两段引物退火成双链核苷酸，且与hsa-mir-665序列互补，即为anti-hsa-mir-665，当与mir-665互补结合后，使得mir-665表达下降。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料，和/或，用于缓冲、培养、和/或扩繁所述重组腺相关病毒质粒paav-d(+)-anti-mir-665的试剂；所述hsa-mir-665的序列如seqidno.3所示。本领域技术人员可根据客观需求，将本发明的抗心衰药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。

第2组实施例：

本发明第2组实施例提供了：可降解、和/或下调表达所述hsa-mir-665的物质；和/或，与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665；和/或，表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组质粒；和/或，表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组腺相关病毒质粒paav-d(+)-anti-mir-665，在制备抗心衰药物方面的用途。任何规模的出于商业目的将上述各物质装入标有抗心衰用途的商品包装内的行为均落入本发明请求保护的范围。

第3组实施例：

本发明第3组实施例提供一种抗心衰药物的筛选方法，其特征在于，检测待选物质是否能结合、降解、和/或下调表达hsa-mir-665，并筛选出能对hsa-mir-665的表达起抑制作用的物质。

本组实施例的具体实验操作步骤可参看实验例2和/或实验例3。

第4组实施例：

本发明第3组实施例提供一种抗心衰药物的制备方法，其特征在于，包括：

将可降解、和/或下调表达所述hsa-mir-665的物质；和/或，与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665；和/或，表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组质粒；和/或，表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组腺相关病毒质粒paav-d(+)-anti-mir-665作为所述抗心衰药物的活性成分。

进一步地，将可表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的引物对插入表达载体，从而制备得到可稳定表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的重组质粒。

更进一步的具体方案中，所述可表达与hsa-mir-665反义互补的序列片段anti-hsa-mir-665的引物对如seqidno.1和seqidno.2所示；所述表达载体为腺相关病毒表达载体paav-d(+)。

本组实施例的具体实验操作步骤如下述的实验例2所示。

实验例1、慢性心力衰竭患者外周血mirnas检测

1.收集200例慢性心力衰竭患者和200例正常对照人群外周血。取材后，室温3,500rpm离心6min，取上层血浆，保存于-80℃冰箱。每0.25ml外周血血浆中加入1mltrizolls(invitrogen公司)，提取rna，rnaseyminikit(qiagen)处理样品。使用nd-1000检测rna质量。

2.采用广州锐博公司mirna检测试剂盒对hsa-mir-665的表达进行real-timepcr检测：

mirnas逆转录：

逆转录引物(rtprimermix)配置：

mirnartprimer1μl

u6rtprimer1μl

rnasefreeh2o78μl

逆转录反应体系：

rnatemplate2μg

rtprimermix4μl

rnasefreeh2oupto19μl

以上体系混匀后，瞬时离心，70℃孵育10min后，冰育2min，再加入以下试剂：

2×tsreactionbuffer25μl

tsenzyme2.5μl

rnasefreeh2o3.5μl

逆转录反应程序：

42℃60min，70℃10min；停止后4℃备用，产物保存于-20℃。

mirnasreal-timepcr：

反应体系：2×sybrgreenmix9μl

rtproduct2μl

mirnaforwardprimer2μl

mirnareverseprimer2μl

rnase-freeh2o5μl

反应程序：

95℃30sec--(95℃10sec--60℃20sec--70℃1sec)×40cycles--meltingcurve

结果显示：心力衰竭患者外周血中hsa-mir-665的表达水平增高(图1a)，且与心脏射血分数呈负相关性(图1b)。表明hsa-mir-665可能在心力衰竭病理生理过程中起到破坏作用。

实验例2、重组腺相关病毒的构建

1.插入片段合成

依据hsa-mir-665的碱基序列(图2)，分别设计并合成表达hsa-mir-665及反向互补anti-hsa-mir-665的两条反向互补链，并用te溶解。序列如下：

hsa-mir-665核酸序列：accaggaggcugaggccccu(取自mirbase，accession登录号:mimat0004952)(如seqidno.3)

hsa-mir-665上游引物：

5’gatccaggggcctcagcctcctggtttcaagagaaccaggaggctgaggcccctccgc3’(如seqidno.4)hsa-mir-665下游引物：

3’gtccccggagtcggaggaccaaagttctcttggtcctccgactccggggaggcgccgg5’(如seqidno.5)anti-hsa-mir-665上游引物：

5’gatccaccaggaggctgaggcccctttcaagagaaggggcctcagcctcctggtccgc3’(如seqidno.1)anti-hsa-mir-665下游引物：

3’gtggtcctccgactccggggaaagttctcttccccggagtcggaggaccaggcgccgg5’(如seqidno.2)

2.按照说明书中体系及温度进行反应：

nuclease-freewater36μl

annealingbufferfordnaoligos(5x)10μl

dnaoligoa(50μm)2μl

dnaoligob(50μm)2μl

90℃3min，37℃1hr，4℃保存。

3.载体酶切

采用bamhi和noti对真核表达载体paav-d(+)在37℃下双酶切2hr，体系如下：

10×kbuffer1μl

bsa1μl

bamhi1μl

noti1μl

paav-d(+)2μl

ddh2o14μl

4.琼脂糖凝胶电泳胶回收

用1％的琼脂糖电泳凝胶电泳双酶切产物，然后使用takara公司琼脂糖凝胶dna回收试剂盒takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0回收双酶切产物，具体操作步骤如下：

1.制作1×tae缓冲液琼脂糖凝胶，然后对目的dna进行琼脂糖凝胶电泳；

2.在紫外灯下切出含有目的dna的琼脂糖凝胶；

3.称量胶块重量，计算胶块体积，切碎胶块；

4.向胶块中加入3倍体积的胶块融化液dr-ibuffer，75℃加热融化胶块；

5.向胶块融化液中加入dr-ibuffer量的1/2体积量的dr-iibuffer，均匀混合。当分离小于400bp的dna片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇；

6.将试剂盒中的spincolumn安置于collectiontube上；

7.将上述操作5的溶液转移至spincolumn中，12,000rpm离心1min，弃滤液；

8.将500μl的rinsea加入spincolumn中，12,000rpm离心30sec，弃滤液；

9.将700μl的rinseb加入spincolumn中，12,000rpm离心30sec，弃滤液；

10.重复操作步骤9；

11.将spincolumn安置于collectiontube上，12,000rpm离心1min；

12.将spincolumn安置于新的1.5ml的离心管上，在spincolumn膜的中央处加入25μl的60℃预热的elutionbuffer，室温静置1min；

13.12,000rpm离心1min洗脱dna。

5.载体连接

1.用t4连接酶连接回收的paav-d(+)载体和合成的dna片段，按照下述反应体系16℃孵育过夜：

2.全量(25μl)加入至100μldh5α感受态细胞中，冰中放置30min；

3.42℃加热45sec后，再在冰中放置1min；

4.加入500μl无抗生素lb培养基，37℃100rpm振荡培养60min；

5.在amp⁺的lb平板培养基上培养，挑选白色单克隆菌落鉴定。

6.质粒小提

挑取单克隆菌落，加入到3mlamp⁺的lb液体培养基中，37℃280rpm振荡培养过夜。使用北京全式金公司easypureplasmidminiprepkit提取质粒，具体操作步骤如下：

1.取1.5ml过夜培养的细菌10,000g离心1min，尽量吸尽上清；

2.加入250μl无色溶液rb(含rnasea)，震荡悬浮细菌沉淀；

3.加入250μl蓝色溶液lb，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液；

4.加入350μl黄色溶液nb，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min；

5.15,000g离心5min，小心吸取上清加入吸附柱中；

6.15,000g离心1min，弃流出液；

7.加入650μl溶液wb，15,000g离心1min，弃流出液；

8.15,000g离心2min，彻底去除残留的wb；

9.将吸附柱置于新ep管中，在柱中央加入20μl70℃预热的eb，室温静置1min；

10.10,000g离心1min，洗脱dna，洗脱出的dna于-20℃保存。

7.质粒鉴定

采用双酶切和测序对所构建的质粒进行鉴定，得到真核表达质粒paav-d(+)-mir-665和paav-d(+)-anti-mir-665，其结构如图3所示。

8.质粒大提

准备1l的无菌锥形瓶，加入300ml无菌lb培养基，加氨苄青霉素溶液至终浓度为100μg/ml。分别加入50μl所需质粒(pxx8、pxx9、phelper、paav-d(+)、paav-d(+)-mir-665和paav-d(+)-anti-mir-665)，280rpm，37℃过夜培养。按照omega公司endo-freeplasmidmaxikit说明书操作，提取质粒，具体步骤如下：

1.室温下5000g离心10min收集细菌；

2.弃培养基，加入10mlsolutioni/rnasea混合液，漩涡震荡完全重悬；

3.重悬混合液中加入10mlsolutionii，轻轻颠倒混匀10-15次后，室温放置2min；

4.加入5ml冰浴的buffern3，并温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；

5.将hibind柱套在收集管中，加入5mlbuffergps，室温静置3-10min，5,000g离心5min，弃滤液，将柱子重新放回收集管中；

6.将细菌裂解液倒入针筒过滤器中，静置2min，插入并推动活塞，收集过滤的裂解液；

7.过滤裂解液中加入1/10体积的etr，颠倒7-10次后，冰浴10min；

8.42℃水浴5min后，室温5,000g离心5min，转移上清液至新离心管，加入0.5倍体积无水乙醇，混匀后室温静置2min；

9.转移混合液至已激活hibind柱中，室温5,000g离心5min，弃去滤液；

10.将结合柱重新装回收集管，加入10mlhbbuffer，室温5,000g离心5min，弃去滤液；

11.将结合柱重新装回收集管，加入15mldnawashbuffer，室温5,000g离心5min，弃去滤液；

12.重复上一步骤；

13.弃去滤液，结合柱重新装回收集管，6,000g离心15min；

14.取出结合柱，65℃干燥10min；

15.结合柱装入新离心管，加入70℃预热的1-3mlendotoxinfreeelutionbuffer，室温静置2min后，6,000g离心5min以洗脱dna。

9.raav介导的病毒包装

293t细胞生长至90％，钙磷转染前1-2hr，每个培养皿换新鲜培养基(含血清)12-15ml，在50ml离心管内先加入氯化钙(cacl2)，再加入质粒，形成ca-dna混合液，充分混匀，向ca-dna混合液中缓慢滴加2xhebsbuffer，形成ca-dna-p混合液，一边加2xhebs一边振荡离心管，充分混匀形成钙磷颗粒。8-12hr后，换18-20ml无血清培养基，72hr后，吸弃培养基，用pbs洗3遍，每个培养皿中加入tris+nacl(ph8.5)1ml，用刮匙刮取细胞，收集于干净离心管，-80℃冻存。

10.病毒纯化

将冻存于-80℃的细胞取出，在37℃解冻溶解，反复冻融4次，8,000g离心15min，将上清放至干净离心管，弃细胞沉淀。

用-20℃预冷的无水乙醇与raav以3：1的体积比充分混匀，-20℃冰箱放置2hr后，4℃，13,000rpm离心15min，弃上清；乙醇挥发后，加入相应体积tris+nacl(ph8.5)溶解沉淀。用millipore小滤器(0.22μm)过滤。

11.病毒滴度测定

样品处理：raav病毒液40μl

蛋白酶k(20mg/ml)5μl

55℃，反应1hr；

酚：氯仿：异戊醇45μl

4℃，12,000g离心5min回收水相；

氯仿45μl

4℃，12,000g离心5min回收水相。

real-timepcr：

primer1(10μm)0.4μl

primer2(10μm)0.4μl

sybrgreenimix10μl

ddh2o8.2μl

template1μl

95℃30sec---(95℃5sec---60℃5sec---72℃20sec)×40个循环---meltingcurve

12.病毒转染效率

纯化后的病毒转染至293t细胞48小时后，荧光显微镜观察被转染细胞比例，其转染效率可达90％以上(图4)。

实验例3、以raav9型表达hsa-mir-665/hsa-anti-mir-665的重组腺相关病毒为例检测其对心力衰竭的治疗作用

1.tac小鼠心脏mir-665表达的检测：

我们采用8周龄的c57小鼠，通过尾静脉分别注射raav-mir-665和raav-anti-mir-665，病毒滴度1×10¹¹pfu/每只，2周后行tac手术：胸主动脉结扎术(transverseaorticconstriction，tac)，至实验终点(4周后)时采用real-timepcr法检测tac小鼠心脏中mir-665的表达情况，结果显示：raav-mir-665处理可明显增加心脏mir-665的表达，而raav-anti-mir-665处理可明显降低心脏mir-665的表达(图5)。

2.tac小鼠心功能检测：

实验终点时采用心脏超声检测tac小鼠心功能，方法如下：

使用仪器为配有30mhz高频探头的超声仪。在使用异氟烷麻醉小鼠后，将小鼠仰卧放置于检测平台，沿小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集左室二维图像，同时在二维图像引导下分别获取5个以上连续心动周期m型超声影像，根据采集的影像使用软件分析结果，得到心脏超声检测心脏血流动力学指标，经相关软件分析后计算出下列指标：包括心率(heartrate,hr)、左室舒张期内径(leftventricularinternaldimension，diastole，lvidd)、左室收缩期内径(leftventricularinternaldimension，systole，lvids)、左室后壁舒张期厚度(leftventricularposteriorwall，diastole，lvpwd)、左室后壁收缩期厚度(leftventricularposteriorwall，systole，lvpws)、室间隔舒张期厚度(interventricularseptalthickness，diastole，ivsd)、室间隔收缩期厚度(interventricularseptalthickness，systole，ivss)、射血分数(ejectionfraction，ef)以及缩短分数(fractionalshortening，fs)等。

结果显示：raav-anti-mir-665处理可明显改善tac小鼠的心脏功能(图5a)，并且能显著改善tac小鼠的冠脉储备(图5b)。而raav-mir-665处理可明显损伤tac小鼠的心脏功能(图5a)。

sequencelisting

<110>汪道文

陈琛

李华萍

<120>用于治疗心力衰竭的药物及其筛选方法与制备方法

<130>p1740050/wht/hb

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>58

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>artificialsequence

<400>1

gatccaccaggaggctgaggcccctttcaagagaaggggcctcagcctcctggtccgc58

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<211>58

<212>dna

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<223>artificialsequence

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gtggtcctccgactccggggaaagttctcttccccggagtcggaggaccaggcgccgg58

<210>3

<211>20

<212>rna

<213>artificialsequence

<220>

<223>小鼠musmusculus

<400>3

accaggaggcugaggccccu20

<210>4

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<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>artificialsequence

<400>4

gatccaggggcctcagcctcctggtttcaagagaaccaggaggctgaggcccctccgc58

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<220>

<223>artificialsequence

<400>5

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