一种诱导凋亡试剂在人乳腺癌细胞中的应用的制作方法

本发明涉及细胞分裂素ortho-topolinriboside(otr)作为一种去甲基化试剂对人乳腺癌细胞株的抗肿瘤作用，属于生物化学与分子生物学技术领域。

背景技术：

乳腺癌是乳房腺上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控。由于癌细胞的生物行为发生了改变，呈现出无序、无限制的恶性增生。它的组织学表现形式是大量的幼稚化的癌细胞无限增殖和无序状地拥挤成团，挤压并侵蚀破坏周围的正常组织，破坏乳房的正常组织结构。乳腺细胞发生突变后便丧失了正常细胞的特性，组织结构紊乱，细胞连接松散，癌细胞很容易脱落游离，随血液或淋巴液等播散全身，形成早期的远端转移，给乳腺癌的临床治愈增加了很大困难。全身重要脏器的转移如肺转移、脑转移、骨转移等都将直接威胁人的生命，因此乳腺癌是严重危及人体生命的恶性肿瘤。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，仅次于子宫颈癌，但近年来有逐年上升趋势。乳腺癌的治疗方法包括手术、化学药物、放射以及晚近的生物治疗等。近年来，乳腺癌的化疗进展围绕新制剂和联合用药的发展，主要目的在于增加缓解率、减轻症状、延缓疾病进程、延长无病生存期并最终改善患者的生命质量。

乳腺癌是除非上皮来源肿瘤中女性最常见的恶性肿瘤。在美国平均每3名女性中就有一名患乳腺癌，是女性肿瘤致死中的第二大原因，给政府经济造成了很大的损失。目前，乳腺癌主要是以手术治疗为主，而化疗，放疗等也作为相当重要的辅助治疗应用于临床。这种手术加化疗的治疗方法一直可以取得很好的疗效，甚至于可以保住乳房。近年来，乳腺癌的化疗已逐步成为其治疗的首选方式，包括术后辅助化疗和术前的新辅助化疗。但由于化疗药物的滥用和肿瘤本身的异质性或是其他原因，越来越多的肿瘤耐药性报道给乳腺癌的化疗带来了很大的挑战。目前流行病学调查表明，乳腺癌防治形势不容乐观，世界范围内，乳腺癌发病率已占女性恶性肿瘤发病率的第一位，并且乳腺癌的发病率每年仍在不断增长；在我国，乳腺癌发病率每年以近3％的速度增长，已经成为乳腺癌发病率上升速度最快的国家之一。它的发病率和致死率在女性恶性肿瘤中逐年上升，并呈年轻化趋势。随着治疗手段和医疗技术的提高，乳腺癌的综合治疗已经取得了巨大的进展，但目前还没有找到有效的根治方法，乳腺癌患者的5年生存率较40年前相比，只从20％提高到目前的26％，其侵袭性和转移率仍然很高。随着我国人口城市化的加速，乳腺癌发生率及病死率有逐年上升的趋势。近年来综合治疗提高了乳腺癌的治疗效果，但仍有相当一部分患者复发或对常规治疗耐药。乳腺癌不仅给女性的造成身心上的痛苦，同时也给患者家庭、社会带来了经济上的较大损失。因此，如何能安全、经济、有效的提高乳腺癌的治疗效果，已成为医学界以及乳腺癌患者群体非常关心的一个问题。随着对恶性肿瘤发病的基因和分子机制研究的不断深入，以肿瘤细胞中特有的结构、功能区域、分子基团、生物酶以及信号转导通路为治疗位点，通过调节或阻断这些分子功能达到治疗疾病目的的靶向治疗药物已经问世。传统的治疗以联合化疗为主，而患者的完全缓解率和长期无病生存率均较低，然而常用的化疗药物如阿霉素和环磷酰胺具有一系列毒副作用。因此，寻找有效提高治疗效率，毒副作用小的天然药物来治疗乳腺癌是十分必要的。

近年来越来越多的研究方向定为针对乳腺癌患者的个体化治疗，其中细胞凋亡的研究成为个体化治疗的热点之一。细胞增殖的幅度和细胞凋亡的幅度之间是否动态平衡决定着肿瘤组织对放化疗及激素疗法的反应效果，而这些肿瘤的治疗疗法都与诱导细胞凋亡有密切的关系。

n6-2-苄胺羟基-9-呋喃核糖基嘌呤(ortho-topolinriboside，otr)是一种存在于黎明时杨树叶子内合成的天然核苷类芳香族细胞分裂素。2010年根据美国国立癌症研究中心(nic)测试结果发现，otr对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系(nic60)具有非常显著的体外增殖抑制活性，其中对乳腺癌细胞株的药物敏感性较强(ic50≦10μm)。并且通过药物体内筛选模型-中空纤维法发现otr在体内对一些肿瘤模型小鼠无明显的急性毒性反应。上述结果充分表明otr作为一种核苷类细胞分裂素具有很强的抗肿瘤临床应用潜力和临床药用研发价值。目前关于otr是否通过诱导凋亡作用并发挥抗肿瘤功效的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术，本发明提供了otr在人乳腺癌细胞株中抗肿瘤的应用。

本发明的技术方案：

一种诱导凋亡试剂在人乳腺癌细胞中的应用，步骤如下：

(1)细胞培养：将人乳腺癌细胞株mcf-7悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌rpmi1640培养液中，置于浓度为5％co2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次；

(2)药物配制：otr用0.1％dmso溶解，继续用无菌rpmi1640培养基将溶解好的otr稀释至浓度为0.1μm～50μm，过滤除菌，室温保存；

(3)处理细胞：将处于对数生长期的5×10³～1×10⁴个细胞接种于每孔含有100μlrpmi1640培养液的96孔板中，设置5组实验，每组4个复孔，第1组：空白对照组；第2组：0.1％dmso组；第3组：1μmotr组；第4组：10μmotr组；第5组：50μmotr组，分别向各组中加入对应的药物，置于浓度为5％co2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育1～4天，细胞计数；

(4)检测细胞增殖抑制率：将处于对数生长期的5×10³～1×10⁴个细胞接种于每孔含有100μlrpmi1640培养液的96孔板中，依据步骤(3)处理细胞的方法再一次处理细胞，置于浓度为5％co2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育1～4天，各4个复孔；采用mtt进行检测，每孔细胞悬液中加20μlmtt溶液，置于37℃，co2培养箱中孵育3h，测定490nm处各组细胞的吸光度，记录数据；

(5)细胞亚倍体峰检测凋亡：将生长状态活跃的mcf-7细胞用otr处理36h后，用流式管分装成五个样品，按照annexinv-fitc凋亡检测试剂盒说明书配制染色缓冲液，每个样品加入500μl染色缓冲液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗一次；300目筛网过滤后用bdfacscalibur流式细胞仪上机检测，计算细胞凋亡率。

本发明的有益效果：本发明的数据建立在otr对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系具有非常显著的体外增殖抑制活性，其中对乳腺癌细胞株的药物敏感性较强的基础之上。

附图说明

图1为细胞分裂素otr对人乳腺癌细胞增殖的抑制作用。

图2为不同浓度otr处理mcf-7细胞的细胞数目变化。2(a)对照组。2(b)10μmotr处理48h后mcf-7细胞数量变化。

图3为otr对人乳腺癌细胞凋亡的作用。3(a)对照组。3(b)10μmotr处理48h后mcf-7细胞的细胞周期。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

本发明使用的细胞、试剂盒以及试剂：人乳腺癌mcf-7细胞株，胎牛血清、谷氨酰胺(gln)、双抗(青霉素/链霉素)，rpmi1640培养基，mtt试剂盒，annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒，otr。

实施例1

otr对人乳腺癌细胞的体外增殖抑制活性：将复苏的人乳腺癌细胞mcf-7培养于含有10％fbs灭活胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％青霉素/1％链霉素(双抗)的无菌rpmi1640培养液中，置于细胞培养瓶中，在37℃、5％co2及饱和湿度下的培养箱中培养，细胞长至70％～80％左右传代1次。继续培养得到生长状态活跃的人乳腺癌细胞，收集细胞。将处于对数生长期的5×10³个细胞接种于每孔含有100μlrpmi1640培养液的96孔板中，按照实验需求，处理组分别加入0.1％dmso、0.3μm、1.5μm、15μm、30μm浓度的otr，放入培养箱中孵育1～4天，各4个复孔。采用mtt试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加20μlmtt溶液，置于37℃，co2培养箱中孵育3h。测定490nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的方差分析方法来分析各组数据，结果如图2所示。图1可见，施用不同浓度的otr对人乳腺癌细胞mcf-7的增殖速率显著低于con和dmso组，表明otr可以抑制人乳腺癌细胞mcf-7的增殖速率。

实施例2

otr诱导mcf-7细胞凋亡：将生长状态活跃的mcf-7细胞用10μm的otr处理48h后，按照annexinv-fitc凋亡检测试剂盒说明书配制染色缓冲液，每个样品加入500μl染色缓冲液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗一次。300目筛网过滤后用bdfacscalibur流式细胞仪上机检测，计算细胞凋亡率。结果如图3所示，图3可见，出现早期以及晚期凋亡细胞群。早期凋亡与对照组(1.87％)相比，otr处理组(9.43％)mcf-7细胞显著性增加(图3)，且晚期凋亡对照组(11.14％)也少于otr处理组(22.12％)，说明在相同实验条件下，otr能诱导mcf-7细胞发生凋亡。