一种法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术：

法呢基乙酸香叶醇酯即吉法酯，商品名惠加强，为日本大阪生晃荣养药品株式会社生产的异戊间二烯类化合物胃黏膜保护剂，主要用于急慢性胃炎、消化性溃疡、非溃疡性消化不良的治疗及预防其他因素引起的急性胃黏膜损伤。其药理作用为通过增加内源性前列腺素的生成起到黏膜保护作用。另外，法呢基乙酸香叶醇酯可提高氨基己糖含量促进溃疡修复愈合；抑制中性粒细胞和单核细胞浸润及相关炎症因子释放，从而减轻胃黏膜组织充血、水肿、糜烂等炎症反应。除了在胃粘膜方面的应用外，国内外还有相关文献报道了法呢基乙酸香叶醇酯在结肠炎、干眼症治疗的应用。

法呢基乙酸香叶醇酯最初由卷心菜分离得到，后来adami等人通过合成方法得到，结构式如1所示。市售法呢基乙酸香叶醇酯为两种几何异构体的混合物，分别是(4e/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯[(4e,8e)-5,9,13-三甲基-4,8,12-十四三烯酸-(2’e)-3’,7’-二甲基-2’,6’-辛二烯醇酯]和(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯[(4z,8e)-5,9,13-三甲基-4,8,12-十四三烯酸-(2’e)-3’,7’-二甲基-2’,6’-辛二烯醇酯]，两者的组成比例日本药典要求是70％～80％比20％～30％，市售片剂经提取后气相色谱法分析，结果显示二者所占比例分别为70％和30％。

现有吉法酯药物在治疗消化系统疾病方面仍存在较多如毒性较高、相对生物利用度低等的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中吉法酯药物存在的毒性高、消化性溃疡保护作用弱、相对生物利用度低的问题，提供一种新的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物、其制备方法、用途及剂型，从而提供一种毒性低、消化性溃疡保护作用强、相对生物利用度高的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由法呢基乙酸香叶醇酯活性成分和药学上可接受的载体组成，并且所述法呢基乙酸香叶醇酯活性成分含(4e/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯和按活性成分总重量计不超过2％的(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯；优选地，所述(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的含量为0.1～1％。

本发明所述的(4e/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯，化学名为[(4e,8e)-5,9,13-三甲基-4,8,12-十四三烯酸-(2’e)-3’,7’-二甲基-2’,6’-辛二烯醇酯]，其化学结构式如2所示：

本发明所述的(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯，化学名为[(4z,8e)-5,9,13-三甲基-4,8,12-十四三烯酸-(2’e)-3’,7’-二甲基-2’,6’-辛二烯醇酯]，其化学结构式如3所示：

可选地，上述的药物组合物，其特征在于，所述法呢基乙酸香叶醇酯活性成分与药学上可接受的载体的重量百分比为1:19～3:7，优选为1:10～1:4。

可选地，上述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、香味剂、甜味剂中的一种或一种以上。

可选地，上述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括淀粉、微晶纤维素、硬脂酸镁、铝硅酸镁、磷酸氢钙、植物油、蜂蜡、明胶聚乙二醇、甘油中的一种或一种以上。

可选地，上述的药物组合物的剂型包括粒剂、粉剂、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酊剂、悬浮液、溶液的形式口服或非口服给药剂型。

优选地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸。

本发明还提供制备上述的药物组合物的方法，其特征在于，包括将法呢基乙酸香叶醇酯活性成分与药学上可接受的载体混合的步骤，其中法呢基乙酸香叶醇酯的制备过程中采用l-天冬氨酸作为催化剂。

可选地，上述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以反式橙花叔醇和原乙酸酯为原料，l-天冬氨酸为催化剂，经claisen重排反应得到法呢基乙酸酯；

(2)将法呢基乙酸酯水解、结晶、酸化得到法呢基乙酸；

(3)将法呢基乙酸与香叶醇缩合得到法呢基乙酸香叶醇酯活性成分；

(4)将法呢基乙酸香叶醇酯活性成分与药学上可接受的载体混合制得所述药物组合物。

可选地，上述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以反式橙花叔醇和原乙酸酯为原料，l-天冬氨酸为催化剂，在90～150℃下进行反应，降温至60～90℃减压蒸馏，升温至90～130℃减压蒸馏，得到法呢基乙酸酯；

(2)将法呢基乙酸酯与碱混合发生水解反应，反应液用有机溶剂(优选石油醚)萃取，调反应液ph至3～4，有机溶剂萃取，合并有机相，加碱，浓缩，加入有机溶剂(优选乙酸乙酯)，过滤，滤饼加水并调ph至3～4，有机溶剂(优选石油醚)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，干燥得法呢基乙酸；

(3)将法呢基乙酸、香叶醇、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc-hcl)、4-二甲氨基吡啶(dmap)混合反应，将反应液分别用水、饱和食盐水洗涤，干燥，过硅胶，浓缩，减压蒸馏，过硅胶，干燥，制得所述法呢基乙酸香叶醇酯活性成分；

(4)将法呢基乙酸香叶醇酯活性成分与药学上可接受的载体混合制得所述药物组合物。

可选地，上述制备方法的合成路线如图8所示：

本发明还提供上述的药物组合物在制备治疗或预防消化系统疾病药物中的用途。

本发明还提供上述的药物组合物在治疗或预防消化系统疾病中的用途。

可选地，所述消化系统疾病包括急慢性胃粘膜损伤；可选地，所述消化系统疾病包括急慢性胃炎、消化性溃疡、非溃疡性消化不良。

本发明所述的药物组合物的用药方式没有特别的限制，例如可以通过口服方式施用于需要这种治疗的患者。

本发明所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可以存在辅助性的物质，例如：粘合剂如淀粉、糊精、蔗糖、纤维素衍生物、明胶、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如乳糖、微晶纤维素、磷酸二氢钙、磷酸氢钙、硫酸钙、、硅酸钙碳酸镁、铝硅酸镁、铝碳酸镁、微粉硅胶等；崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联聚维酮、羧甲基纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠等；另外，还可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂、甜味剂、润湿剂、乳化剂、ph缓冲物质等。

本发明的有益效果：

本发明特定的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物，所述药物组合物中法呢基乙酸香叶醇酯活性成分中按活性成分重量计(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯不超过2％，具有毒性低、消化性溃疡保护作用强、相对生物利用度高的优点。

当(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的含量为0.1％～1.0％时，与(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯含量小于0.1％时相比，所述药物组合物的毒性更低、消化性溃疡的保护作用更强、相对生物利用度更高，具有预料不到的技术效果。

附图说明

图1是法呢基乙酸香叶醇酯对无水乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用照片，其中：a为正常组；b为模型组；c为(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯治疗组；d为吉法酯治疗组；e为本发明法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物治疗组；f为兰索拉唑对照组。

图2是法呢基乙酸香叶醇酯对无水乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤溃疡面积比统计柱形图，其中：model为模型组；4z为(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯治疗组；gefarnate为吉法酯治疗组，4e为本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物治疗组；lansoprazole为兰索拉唑对照治疗组，*表示与模型组相比，p<0.05。

图3是法呢基乙酸香叶醇酯对无水乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤溃疡抑制率统计柱形图，其中：4z为(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯治疗组；gefarnate为吉法酯治疗组，4e为本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物治疗组；lansoprazole为兰索拉唑对照治疗组。*表示与模型组相比，p<0.05。

图4是光镜下大鼠胃组织病理学改变图，其中：a为正常组；b为模型组；c为(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯治疗组；d为吉法酯治疗组；e为本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物治疗组；f为兰索拉唑对照治疗组。

图5是不同纯度的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物对大鼠胃溃疡抑制率的柱形图，其中：纵坐标为抑制率，横坐标为不同含量(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物。

图6是不同纯度的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物对大鼠胃溃疡面积的影响柱形图，其中：纵坐标是胃溃疡面积比，横坐标为不同含量(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物。

图7是法呢基乙酸香叶醇酯灌胃给药后药物浓度随时间的变化曲线，其中：4e为本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物组；gefarnate为吉法酯组；4z为(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯治疗组。

图8是(4e/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的合成路线图，其中，asparticacid为l-天冬氨酸。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

(一)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物的制备

下述实施例中制得的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物中的法呢基乙酸香叶醇酯活性成分的含量通过气相色谱法检测得到；几何构型通过气相色谱法及核磁共振的耦合常数值进行确定。

实施例1

1)法呢基乙酸乙酯的合成

于2l圆底烧瓶中依次加入反式橙花叔醇500g(2.25mol)、原乙酸三乙酯546g(3.37mol)、l-天冬氨酸30g(0.22mol)，加热至120℃进行反应。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)监测反应进程，至反式橙花叔醇反应完全时停止。使反应温度降至80℃，减压蒸出反应中生成的副产物乙醇；然后升温至120℃、减压蒸出未反应的原乙酸三乙酯，得到法呢基乙酸乙酯520g，收率80％。

2)法呢基乙酸的制备

于5000ml圆底烧瓶中加入法呢基乙酸乙酯480g(1.60mol)、氢氧化钠70.4g(1.76mol)、水480ml、乙醇960ml，室温搅拌过夜，得黄色澄清透明液。停止反应，用800ml石油醚萃取反应液3次。反应液用浓盐酸调ph至3～4，然后用320ml石油醚萃取，萃取两次，合并石油醚层水洗3次，无水硫酸钠干燥，蒸干得404.8g黄色、澄清透明油状物，收率96.1％。

于3000ml圆底烧瓶中加入制得的油状物法呢基乙酸396g(1.5mol)、氢氧化钾82.5g(1.5mol)、甲醇1000ml，室温搅拌1h得黄色澄清透明液，停止搅拌，将反应液浓缩至干，加入2000ml乙酸乙酯，搅拌2h，析出白色固体，抽滤，滤饼用1000ml水溶解，并用浓盐酸调ph至3～4，然后用1000ml石油醚萃取，萃取两次，合并石油醚层，用饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，蒸干得249g淡黄色、澄清透明油状物，即法呢基乙酸，收率63％。

3)法呢基乙酸香叶醇酯活性成分的制备

于5000ml圆底烧瓶中加入上述得到的法呢基乙酸185g(0.7mol)，香叶醇107g(0.71mol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc-hcl)151g(0.83mol)，dmap12.2g(0.1mol)二氯甲烷2000ml，室温搅拌反应，tlc监测约6h时原料反应完全，停止反应，反应液分别用水、饱和食盐水洗涤一次，干燥，过硅胶，浓缩得浅黄色、澄清、透明油状液体；该油状物经减压蒸馏除去杂质，再次过硅胶除去原点处杂质，蒸干得无色、澄清、透明、油状物法呢基乙酸香叶醇酯活性成分229g，收率82％，纯度99.5％((4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯含量为0.3％)[气相色谱法：gc-14b气相色谱仪(日本岛津)，se-54柱(0.53mm×30m)，柱温：80℃(5min)30℃/min-160℃(3min)30℃/min-260℃(20min)进样口250℃，检测器260℃，氮气流速20ml/min]。

4)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物的制备

(1)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物1

处方组成为：

以制备1000片法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物片剂为例，具体制备方法是：将处方量的上述法呢基乙酸香叶醇酯活性成分溶解于无水乙醇，磷酸氢钙与铝硅酸镁混匀后按照等量递增法加入法呢基乙酸香叶醇酯乙醇溶液，充分混匀后，加淀粉搅拌均匀，以15％淀粉浆制成软材，制粒、烘干、整粒，向颗粒中加入处方量微晶纤维素、硬脂酸镁、滑石粉，压片，用8％欧巴代乙醇溶液包衣。

(2)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物2

处方组成为：

以制备1000粒法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物软胶囊为例，具体制备方法是：称取处方量的上述法呢基乙酸香叶醇酯活性成分溶于等量的大豆油中，搅拌使其充分混匀，加入剩余处方量的大豆油混合均匀，通过胶体磨研磨三次，真空脱气泡2小时备用。称取处方量的明胶，以处方量80％的水充分溶胀。将甘油及剩余量的水，加热至70℃，加入明胶液，搅拌1.5小时至熔融均匀，加入二氧化钛，搅拌均匀。所制胶液放入保温箱内，温度保持在80～90℃之间压制胶片。将胶片及内容物药液通过自动旋转制囊机压制成软胶囊，定形、整形、洗擦丸、干燥、包装。

实施例2

1)法呢基乙酸甲酯的合成

于2l圆底烧瓶中依次加入反式橙花叔醇400g(1.80mol)、原乙酸三甲酯324g(2.70mol)、l-天冬氨酸24g(0.18mol)，加热至100℃进行反应。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)监测反应进程，至反式橙花叔醇反应完全时停止。使反应温度降至70℃，减压蒸出反应中生成的副产物乙醇；然后升温至100℃、减压蒸出未反应的原乙酸三乙酯，得到法呢基乙酸甲酯425g，收率85％。

2)法呢基乙酸的制备

于250ml圆底烧瓶中加入法呢基乙酸甲酯50g(0.18mol)、氢氧化钠7.9g(0.20mol)、水50ml、乙醇100ml，室温搅拌过夜，得橙色澄清透明液。停止反应，用100ml石油醚萃取反应液3次。反应液用浓盐酸调ph至3～4，然后用100ml石油醚萃取，萃取两次，合并石油醚层水洗3次，无水硫酸钠干燥，蒸干得45.2g黄色、澄清透明油状物，即法呢基乙酸，收率95.2％。

于250ml圆底烧瓶中加入制得的法呢基乙酸26g(0.10mol)、氢氧化钾5.5g(0.1mol)、甲醇80ml，室温搅拌1h得黄色澄清透明液，停止搅拌，将反应液浓缩至干，加入150ml乙酸乙酯，搅拌2h，析出白色固体，抽滤，滤饼用80ml水溶解，并用浓盐酸调ph至3～4，然后用80ml石油醚萃取，萃取两次，合并石油醚层，用饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，蒸干得15.6g淡黄色、澄清透明油状物，即法呢基乙酸，收率60％。

3)法呢基乙酸香叶醇酯活性成分的制备

于250ml圆底烧瓶中加入上述得到的法呢基乙酸12.3g(0.05mol)，香叶醇7.1g(0.047mol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc-hcl)10.1g(0.055mol)，dmap1.22g(0.01mol)二氯甲烷100ml，室温搅拌反应，tlc监测约5h时原料反应完全，停止反应，反应液分别用水、饱和食盐水洗涤一次，干燥，过硅胶，浓缩得浅黄色、澄清、透明油状液体；该油状物经减压蒸馏除去杂质，再次过硅胶除去原点处杂质，蒸干得无色、澄清、透明、油状物法呢基乙酸香叶醇酯活性成分16.6g，收率83％，纯度99.4％((4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯含量为0.5％)，气相色谱检测方法同实施例1。

4)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物的制备

处方组成为：

(a)法呢基乙酸香叶醇酯活性成分5mg/丸

(b)聚乙二醇600045mg/丸

以制备1000粒法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物滴丸为例，具体制备方法是：将处方量聚乙二醇6000置铝锅中，于油浴上加热至90℃～100℃，待全部熔融后，加入处方量的上述法呢基乙酸香叶醇酯活性成分充分搅拌均匀，转移至贮液瓶中，密闭并保温在80℃～90℃，调节滴液定量阀门，由上往下，滴入10℃～15℃的甲基硅油中，取出滴丸，吸尽滴丸表面冷却剂，干燥，即得。

下述(二)、(三)、(五)中的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物是由实施例1制备得到的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物1，其中法呢基乙酸香叶醇酯活性成分的纯度为99.5％。

下述(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯：参考文献(周训蓉，等.吉法酯中几何异构体的研究,化学试剂,2012,34(3):266-268)方法制备，纯度99.8％。

下述吉法酯：参考文献(周训蓉，等.吉法酯中几何异构体的研究,化学试剂,2012,34(3):266-268)方法从市售药片提取(灌胃给药需要通过提取原料并去除片剂的辅料，以便计算给药量)。

下述兰索拉唑为市售原料药。

(二)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物的毒性试验

通过文献《药理实验方法学》(魏伟主编)推荐方法分别对本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物、吉法酯，通过口服、腹腔注射、静脉注射的方式检测急性毒性，试验结果表明，大鼠口服给药本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物ld50为12555mg/kg、(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的ld50为3826mg/kg、吉法酯的ld50为8455mg/kg；大鼠腹腔注射给药本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物ld50为7426mg/kg、(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的ld50为2522mg/kg、吉法酯的ld50为4688mg/kg；大鼠静脉注射给药本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物ld50为3894mg/kg、(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的ld50为1498mg/kg、吉法酯的ld50为2855mg/kg。实验结果提示本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物的毒性低于(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯及二者7:3比例混合物吉法酯。

(三)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物的消化性溃疡保护作用试验

市售吉法酯(主要成分为(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯与(4e/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯按3:7比例混合)作为胃黏膜保护剂，可促进溃疡修复愈合，增强胃黏膜屏障，扩张胃黏膜微循环，改善血流分布。通过文献(hajrezaiem,salehenn,karimianh,etal.biochaninagastroprotectiveeffectsinethanol-inducedgastricmucosalulcerationinrats.plosone,2015,10(3):e0121529.)推荐的方法，采用无水乙醇诱导大鼠，建立急性胃溃疡模型，口服灌胃本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物、(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯、吉法酯、兰索拉唑，通过软件计算溃疡指数和溃疡抑制率，采用he染色观察胃组织形态学，可反映药物对无水乙醇致大鼠胃粘膜的保护作用。

1实验方法

1.1实验分组与剂量设计

sd大鼠分为正常对照组，模型组，阳性对照组(兰索拉唑20mg/kg)，给药组((4e/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯200mg/kg，(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯200mg/kg，吉法酯200mg/kg)，共5组，每组动物8只。

1.2无水乙醇致大鼠急性胃溃疡

取sd大鼠40只，体重180～220g。每天灌胃给药1次，连续7天。造模前24h，大鼠需禁食不禁水，于末次给药后1h后，每只大鼠灌胃无水乙醇1ml造成急性胃粘膜损伤。灌胃无水乙醇1h后10％水合氯醛麻醉，使用真空静脉釆血管由腹主动脉采血5ml，静置2h后4000r/min离心10min，分离血清，置于-80℃冰箱中保存待测。

1.3胃黏膜溃疡面积及溃疡抑制率的测算

大鼠取血后处死，迅速取出鼠胃，沿胃大弯剪开，用预冷的生理盐水洗净胃内残留物，展开并将胃组织固定于两块玻璃板之间供拍照。用imagej图形分析软件测算溃疡面积，并计算抑制率。抑制率(％)＝(对照组溃疡面积-给药组溃疡面积)/对照组溃疡指数x100％。

1.4大鼠胃组织病理组织学观察

he(haematoxylinandeosin)染色是在不同染液的作用下，将切片中的不同物质染成不同颜色而显示出来，再通过光学显微镜观察组织中的各种结构，它是最为常规的染色，可以有助于对胃溃疡程度做出诊断。胃组织中病理组织学操作包括取材固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片与贴片、脱蜡染色、he染色、脱水透明和封固几个步骤。

1.5数据录入与处理分析

结果以均数±标准误(mean±s.e.m.)表示，并采用spss17.0统计软件进行分析，各组间差异比较用单因素方差分析(one-wayanova)(不假定方差齐性dunnett'st3)。p<0.05则表示差异具统计学意义。

2实验结果

2.1法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物对无水乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用

无水乙醇致大鼠胃黏膜损伤观察结果显示(图1)，正常组胃黏膜光整完好，呈暗红色，黏液较多，无充血，水肿、溃疡及瘢痕组织增生等异常变化。模型组与(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯治疗组大鼠胃黏膜有广泛损伤，水肿、充血、糜烂，呈暗红色，并见大量散在出血及出血条带。其余各组出血点及出血条带有不同程度的减少，其中吉法酯与本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物治疗组相比较，前者糜烂情况较严重，出血带较多；本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物治疗组与兰索拉唑对照组胃黏膜呈暗红色，为点片状出血，大部分胃黏膜未见炎性反应及损伤。

实验结果表明本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物对无水乙醇所致的急性胃黏膜损伤的保护作用优于(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯和吉法酯，并与阳性对照药兰索拉唑相当。

2.2法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物对大鼠胃溃疡面积和溃疡抑制率的影响

实验大鼠的溃疡面积/自身胃面积结果如图2所示，其中模型组中胃溃疡面积损伤最大说明无水乙醇致大鼠胃溃疡模型成功。实验结果表明，本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物与对照组兰索拉唑均能够明显抑制无水乙醇对胃黏膜组织造成的溃疡损伤，降低溃疡面积，改善病理形态及炎症性反应。吉法酯组抑制溃疡损伤效果不够明显，而(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯对抗无水乙醇致胃黏膜损伤基本无效果。

实验大鼠溃疡抑制率见图3。实验结果表明，本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物溃疡抑制率可达78.20％，而(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯溃疡抑制率则为35.56％，吉法酯溃疡抑制率为37.60％，本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物溃疡抑制率明显，与对照组兰索拉唑(溃疡抑制率为81.10％)相差不大。

2.3光镜下大鼠胃组织病理学改变

病理组织学分析如图4显示，大鼠正常胃黏膜结构完整，黏膜表面胃小凹清晰可见，黏膜内腺体排列紧密规则，上皮未见脱落，腺体未见损伤，固有层未见出血及炎细胞浸润(0度损伤)；模型组与(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯治疗组胃黏膜损伤较深，面积较大，胃小凹结构破坏，出现水肿及炎性浸润，大量上皮细胞变性，脱落、糜烂，腺体结构紊乱，有的缺失，固有层见中度出血(iv度损伤)；吉法酯处理组胃黏膜保持比较完整，腺体损伤程度较小(iii度损伤)；本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物处理组对上述病理损伤有较明显改善作用，胃黏膜胃粘膜轻度损伤，上皮未见脱落，腺体未见损伤，固有层少见出血及炎细胞浸润(i度损伤-ii度损伤)；阳性组胃黏膜轻度损伤，上皮未见脱落，腺体未见损伤，固有层未见出血及炎细胞浸润(i度损伤-ii度损伤)。

(四)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物的消化性溃疡保护作用研究

通过文献(hajrezaiem,salehenn,karimianh,etal.biochaninagastroprotectiveeffectsinethanol-inducedgastricmucosalulcerationinrats.plosone,2015,10(3):e0121529.)推荐的方法，采用无水乙醇诱导大鼠，建立急性胃溃疡模型，口服灌胃法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物，通过软件计算溃疡指数和溃疡抑制率。

1.1供试药品制备

由实施例1和参考文献(周训蓉，等.吉法酯中几何异构体的研究,化学试剂,2012,34(3):266-268)方法所制备的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物、(4e/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯及(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯，经混合制备(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯含量为0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物供试品。

1.2实验及检测方法同(三)中所述。

1.3实验结果

1.3.1不同纯度的(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯对大鼠胃溃疡抑制率的影响结果见图5。

1.3.2不同纯度的(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯对大鼠胃溃疡面积的影响结果见图6。

由图5和图6可知：当(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的浓度小于等于2％且大于等于0.1％时，本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物，溃疡抑制率明显，能够明显抑制无水乙醇对胃黏膜组织造成的溃疡损伤，降低溃疡面积，改善病理形态及炎症性反应，具有较一致的预料不到的技术效果；但是当(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的浓度大于2％或者小于0.1％时，法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物对胃溃疡抑制率明显降低，对抑制无水乙醇对胃粘膜组织造成的损伤方面效果较差。

(五)法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物药动学特征考察

本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物、吉法酯、(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯对无水乙醇致大鼠胃粘膜的保护作用存在明显差异。本发明建立超高液-高分辨质谱联用方法研究三者通过灌胃给药后进入大鼠体内后的差异，考察三者的药动学特征。

仪器：watersacquityhuplc，watersxevog2-xsqtof

色谱条件：色谱柱(watersbehc18(2.1mm×50mm,1.7μmm)柱，柱温40℃)；流动相(0.1％甲酸水-甲醇-乙腈(1:54:45)等度洗脱，流速0.3ml·min^-1)；进样量2μl；进样时间6min。

质谱条件：电喷雾电离源(esi)；正模式采集(negativemode)；毛细管电压2kv，离子源120℃，脱溶剂气温度400℃，脱溶剂气流量800l·h^-1，锥孔气流量50l·h^-1；质谱数据采集及处理软件masslynxv4.1工作站，扫描方式ms模式。

线性：取标准样品配制成20、40、80、200、400、1000、2000ng·ml的系列标准液。取空白血浆100μl，置于2mlep管中，依次加入上述标准液100μl，加入400μl甲醇再加入800μl乙酸乙酯，涡旋混合15min，10000r·min^-1离心10min，吸取上层有机层，氮气吹干，残渣加入100μl甲醇溶解，13000r·min^-1离心10min进样测定。以质量浓度(c)为横坐标、样品峰面积(y)为纵坐标用加权最小二乘法进行线性回归，权重系数为1/c，绘制标准曲线，得(4e/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯标准曲线方程为y＝256.5086c-11.0039(r²＝0.9989)，gefarnate标准曲线方程为y＝224.c-10.0189(r²＝0.9978)，(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯标准曲线方程为y＝188.4582c-6.8258(r²＝0.9981)结果表明，检测质量浓度的线性范围均为20～2000ng·ml，定量限均为20ng·ml。

样品测定：取大鼠18只雌雄各半，体质量200-230g，分为三组每组6只，实验前禁食12h，正常饮水。大鼠称质量后按常用剂量换算灌胃给予灌胃溶液，剂量均为200mg/kg，于灌胃给药后0.25、0.5、1、2.5、3.5、4.5、6、7.5、9、10.5、12、14、24、30h断尾取血0.3ml，置于肝素化1.5ml离心管中，4500r/min离心10min，取血浆样品100μl置于2mlep管中，加入400μl甲醇再加入800μl乙酸乙酯，涡旋混合15min，10000r·min^-1离心10min，吸取上层有机层，氮气吹干，残渣加入100μl甲醇溶解，13000r·min^-1离心10min进样测定。

实验结果：本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物、吉法酯、(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯分别灌胃给药后药-时曲线如图7所示。由药动学参数可知，大鼠灌胃给药后本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物、吉法酯、(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯达峰时间约为6小时，但是本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物、吉法酯、(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯的auc0-t分别为19126.58(ng·h/ml)、14656.05(ng·h/ml)、8785.62(ng·h/ml)。说明本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物的相对生物利用度大于(4z/8e)-法呢基乙酸香叶醇酯以及吉法酯。

综上可知，本发明的法呢基乙酸香叶醇酯药物组合物具有毒性低、消化性溃疡保护作用强、相对生物利用度高的优点。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这种简单变型均属于本发明的保护范围。