本发明涉及一种壳寡糖的应用。
背景技术：
几丁质(chitin)广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，是自然界中最为丰富的天然高分子，含量仅次于纤维素。几丁质具有多种功能特性，但是其极差的水溶特性和生物降解能力极大的限制了其广泛应用。相对于几丁质不溶于水、稀酸、稀碱、乙醇或其他有机溶剂的特性，壳聚糖可溶于水并在稀酸溶液中呈现出较高的粘度，这种溶解特性也限制了壳聚糖在生物领域的应用。作为几丁质和壳聚糖的降解产物，壳寡糖的溶解性好，且在生理条件下粘度较低，这是由于壳寡糖的糖链更短和游离氨基基团。壳寡糖的糖苷残基重复单元中含有一个氨基基团和两个羟基基团，是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖。壳寡糖的这些特性引起了越来越多研究者的关注。已经有很多文献报道了壳寡糖的生物活性，抗氧化、消炎、拮抗微生物、降低胆固醇和增强免疫活性、抗肿瘤的活性等。壳寡糖在很多领域的应用也有相应的报道，如食品、药物、农业和环境领域。此外，壳寡糖良好的生物相容性、无毒、对活体器官的不致敏特性，也使其作为纳米/微米体系发展成为一种潜在的药物载体和组织工程支架。
原发性肝癌是最为常见的恶性肿瘤之一，2015年全球范围内共有78.8万例肝癌病人死亡。原发性肝癌是一种高发病率、高死亡率的全球性难治性恶性肿瘤，分别居于男女常见恶性肿瘤的第5、7位，说明原发性肝癌已严重威胁人类健康且成为我国主要的肿瘤死因之一。有文献报道，壳寡糖具有抗肿瘤的生物活性，其机制为直接抑制肿瘤细胞的生长，并且有报道细胞坏死和凋亡，减少肿瘤血管生成从而实现抑制肿瘤细胞转移，也有可能是通过增强机体免疫力，间接实现拮抗肿瘤发生发展的作用。
技术实现要素：
本发明是为了解决目前原发性肝癌高发病率、高死亡率的技术问题，而提供一种壳寡糖的应用。
本发明为一种壳寡糖的应用，用于抑制人源肝癌hepg2细胞和人源肝癌mhcc97h细胞的活性；
所述的壳寡糖中聚合度2～6的壳寡糖含量为80％～90％，且壳二糖含量为25％～30％，壳三糖含量为15％～20％，壳四糖含量为25％～30％，壳五糖含量为3％～8％，壳六糖含量为2％～6％。
本发明的优点：
壳寡糖是自然界中唯一的氨基低聚糖，其单体为氨基葡萄糖，本发明所述的壳寡糖的优点是分子量低，纯度高，壳二糖～壳六糖含量高，抗肿瘤效果好，溶解性好，易吸收，同时还具有无毒副作用等优点；
壳寡糖是自然界中唯一带正电荷的氨基葡萄糖，肿瘤细胞表面带有比正常细胞更多的负电荷，所以壳寡糖可以通过静电吸附靶向肿瘤细胞，壳二糖～壳四糖通过与血液中的甘露糖竞争肿瘤细胞表面的甘露糖受体，影响细胞ca2+离子信号通路，改变肿瘤细胞膜通透性，致使细胞胞浆外溢，同时细胞膜通透性增加了壳五糖和壳六糖进入肿瘤细胞的速度和浓度，并靶向肿瘤细胞线粒体，影响线粒体能量产生，断开能量传递链，加速肿瘤细胞死亡。
本发明中所述的壳寡糖中壳二糖～壳四糖含量高，可高效地结合肿瘤细胞表面的甘露糖受体，进一步增加肿瘤细胞膜的通透性，壳五糖和壳六糖进入肿瘤细胞后，靶向线粒体，降低线粒体电势。
本发明所述的壳寡糖应用于抑制裸鼠肝原位移植人源肝癌hepg2细胞的瘤重抑制率为44.5％，光量子数抑制率为80.9％；抑制裸鼠肝原位移植人源肝癌mhcc97h细胞的瘤重抑制率为68.7％。
原位移植模型不仅能保持原有瘤组织的结构，而且还能充分展示肿瘤的生物学行为，更接近肿瘤在病人体内的发展情况，广泛应用于肿瘤机制研究及抗肿瘤药物的筛选。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式为一种壳寡糖的应用，具体为应用于抑制人源肝癌hepg2细胞和人源肝癌mhcc97h细胞的活性；
所述的壳寡糖中聚合度2～6的壳寡糖含量为80％～90％，且壳二糖含量为25％～30％，壳三糖含量为15％～20％，壳四糖含量为25％～30％，壳五糖含量为3％～8％，壳六糖含量为2％～6％。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：所述的壳寡糖的制备方法为：
将壳聚糖溶解于质量浓度为0.1％～5.0％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖5～25倍重的质量浓度为10％～40％过氧化氢，升温搅拌至40℃～90℃恒温，反应0.5h～10h，再经质量浓度为60％～100％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到壳寡糖；壳聚糖与质量浓度为0.1％～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:(10～30)ml。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30％过氧化氢。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：所述的干燥为冷冻干燥。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：升温搅拌至70℃恒温，反应8h，再经质量浓度为95％的乙醇沉淀。其他与具体实施方式一相同。
通过以下试验验证本发明效果：
试验一：本试验为一种壳寡糖的制备方法，具体为：
将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的质量浓度为30％过氧化氢，升温搅拌至70℃恒温，反应8h，再经质量浓度为95％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过冷冻干燥，得到壳寡糖；壳聚糖与质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:20ml。
所述的壳寡糖中聚合度2～6的壳寡糖含量为85％，且壳二糖含量为28％，壳三糖含量为18％，壳四糖含量为27％，壳五糖含量为7％，壳六糖含量为5％；
试验二：本试验为应用壳寡糖抑制人源肝癌hepg2细胞的活性。
1、试验动物
试验动物来源：成年nu/nu裸鼠，18.0～22.0g，雌性，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：scxk-(京)2012-001。受试动物饲养于无菌的独立送风笼中，每笼5只。垫料为60co辐射消毒的玉米芯垫料，粒径4～6mm。饲以专门为小鼠配制的消毒饲料，自由饮用纯净水。动物实验室内温度保持在25℃，相对湿度保持在40～70％。
2、试验方法
2.1细胞培养
hepg2-luc细胞培养于含体积分数为10％的胎牛血清的dmem细胞培养液中，分别加入青霉素和链霉素各100u/ml，置于37℃含体积分数为5％的co2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1200r/min离心5min后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
2.2肝原位肿瘤模型建立
将hepg-2-luc细胞消化后，用生理盐水重悬，调整至细胞个数为4×107/ml，与matrix胶1:1混匀；对要手术接种的裸鼠以0.5％的戊巴比妥10ml/kg麻醉后，将裸鼠固定在手术台上，消毒腹部皮肤，在右上腹部剪开约1cm的切口，暴露肝脏，手术洞巾覆盖，用微量注射器吸取100μl混合均匀的细胞植入肝脏内，创口出血部位用消毒纱布进行止血处理。然后将手术后的肝脏放回小鼠腹腔内，用4/0号手术缝合针依次缝合腹肌和皮肤。
3、实验分组及处理方案
待术后1周后用ivisspectrumct检测模型肿瘤生长情况，选取已生长原位肿瘤，且肿瘤大小相似的动物按动物体重随机分组，分为空白对照组、壳寡糖组及阳性药组，每组动物8只，分组及处理方案如下：
空白对照组：生理盐水；阳性药组：索拉菲尼，剂量为20mg/kg；壳寡糖组:配置浓度为4mg/ml的壳寡糖生理盐水溶液，注射溶液中壳寡糖的剂量为40mg/kg，用的是试验一制备的壳寡糖。
壳寡糖腹腔注射，每间隔48h给药一次；阳性药组灌胃给药，每24h给药一次，试验结束后，颈部脱臼处死动物，解剖取肝脏，并剥离肉眼可见肿瘤称重。
4、数据处理
肿瘤瘤重生长抑制率＝(空白对照组瘤重－给药组瘤重)/空白对照组瘤重×100％。
试验结果：壳寡糖隔天给药，共计16次，阳性药索拉菲尼连续给药，共计31次。壳寡糖组在给药期间没有出现明显的体重大幅下降现象，而索拉菲尼组有一只动物由于肿瘤负荷过重而死亡。与空白对照组比较，40mg/kg壳寡糖剂量组的瘤重抑制率为44.5％，光量子数抑制率为80.9％；阳性对照组的瘤重抑制率为39.7％，光量子数抑制率为85.9％。具体结果见表1。
表1壳寡糖对人肝癌细胞hepg2-luc裸鼠原位移植瘤模型生长抑制试验
试验三：本试验为应用壳寡糖抑制人源肝癌mhcc97h细胞的活性。
1、试验动物
试验动物来源：成年nu/nu裸鼠，18.0～22.0g，雌性，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：scxk-(京)2012-001。受试动物饲养于无菌的独立送风笼中，每笼5只。垫料为60co辐射消毒的玉米芯垫料，粒径4～6mm。饲以专门为小鼠配制的消毒饲料，自由饮用纯净水。动物实验室内温度保持在25℃，相对湿度保持在40％～70％。
2、试验方法
2.1细胞培养
mhcc97h-luc细胞培养于含体积分数为10％的胎牛血清的dmem细胞培养液中，分别加入青霉素和链霉素各100u/ml，置于37℃含体积分数为5％的co2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1200r/min离心5min后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
2.2肝原位肿瘤模型建立
传代保种鼠皮下肿瘤生长至直径约1～2cm时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成1.0×1.0mm大小的瘤块备用。将要手术接种的裸鼠用麻药麻醉后，将鼠固定在手术台上，消毒腹部皮肤，在左上腹部剪开1cm切口，暴露肝脏，手术洞巾覆盖。将准备好的瘤块放入专用接种套管针内，用套管针将瘤植入肝脏内，创口出血部位用消毒纱布进行止血处理。然后将手术后的肝脏放回小鼠腹腔内，用手术缝合针依次缝合腹肌和皮肤。
3、试验分组及处理方案
荷瘤鼠手术两周至三周后通过b超随机检测肝原位肿瘤模型是否成功建立，将荷瘤鼠进行随机分组，分为空白对照组、壳寡糖组及阳性组，每组动物8只，分组及处理方案如下：
空白对照组：生理盐水；阳性药氟尿嘧啶：30mg/kg；壳寡糖组：配置浓度为4mg/ml的壳寡糖生理盐水溶液，注射溶液中壳寡糖的剂量为40mg/kg，用的是试验一制备的壳寡糖。壳寡糖腹腔注射，每间隔48h给药一次；阳性药尾静脉注射给药，每周给药两次。试验结束后，颈部脱臼处死动物。解剖取肝脏，并剥离肉眼可见肿瘤称重。
4、数据处理
肿瘤瘤重生长抑制率＝(空白对照组瘤重－给药组瘤重)/空白对照组瘤重×100％。
5、试验结果：壳寡糖隔天给药，共计12次，阳性药氟尿嘧啶每周给药2次，共计6次。与空白对照组比较，40mg/kg壳寡糖剂量组的瘤重抑制率为68.7％；阳性对照组的瘤重抑制率为66.4％。具体结果见表3。
表3壳寡糖对人肝癌细胞mhcc97h裸鼠原位移植瘤模型生长抑制试验
试验四：本试验为测试壳寡糖对正常昆明小鼠血象的影响，选取空白对照组：生理盐水；壳寡糖组：40mg/kg，用的是试验一制备的壳寡糖。结果见表4，可以说明试验一制备的壳寡糖毒性低。
表4
共给药4次(1周)，腹腔注射，隔天给药。