一种体外三维组织模型的制备方法及装置与流程

本发明涉及体外组织模型制备技术领域，具体涉及一种体外三维组织模型的制备方法及装置。

背景技术：

各种原因导致的组织、器官缺损或功能障碍是危害人类健康的主要原因，组织、器官缺损的修复和功能重建是医学领域面临的挑战。组织工程的发展为组织、器官的损伤和功能缺失带来了新的治疗希望，应用工程学和生物学原理，联合或单独使用生物材料、细胞和生长因子等，在体外重建组织、器官模型，模拟组织发育、局部微环境与生物力学刺激等因素，对于病理学和药理学的研究有着巨大的帮助。

近年来，3d生物打印技术在体外组织模型构建中的应用愈加广泛，它可以个性化控制细胞分布和精确化控制细胞成型。但是目前在组织构建中应用较多的是挤出式打印，这种方式对于材料的力学性能有着很高的要求，往往难以实现高精度，并且逐点扫描的方式效率较低，在重复性结构中显得尤为突出。而基于光固化的面曝光技术由于其精度高、效率高、适用性强的特点，得到了研究人员的青睐。

中国专利文献201410280450.0涉及一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，先设计出带血管结构的软组织支架模型，将模型逐一等距分层，制造各层的光掩膜板；然后将细胞与胶原溶液混合均匀，注入光固化水凝胶和光引发剂，得到光固化复合溶液；将光固化复合溶液注射到工作台上，盖上光掩膜板，使用面曝光技术固化光固化复合溶液，然后层层固化累加，获得带血管结构的光固化水凝胶软组织支架；向支架的血管结构中种植血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在血管管道表面，在体外进行静态培养和动态培养，得到附带血管网流道的人工软组织体。

该方法能够解决软组织大块缺损修复中大块组织工程软组织支架内细胞的存活问题，以及软组织支架血管网络制造和血管化的问题，适用性强，也能够提供一定的精度。但是其缺点在于无法对复合溶液中的细胞进行操纵，使细胞可控一定并到达目标位置形成复杂结构。在体外三维组织模型的构建中，为更逼真的仿生，需要将某种细胞限制于一定区域之中，以实现在一定程度上模拟组织结构与功能，这也是实际研究中必须解决的一个难题。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种体外三维组织模型的制备方法及装置,以解决现有技术难以操纵细胞和打印速度慢等问题。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种体外三维组织模型的制备方法，包括以下步骤：

(2)用含细胞、生长因子的细胞外基质材料、光固化水凝胶和光引发剂配制得到混有细胞的光固化复合溶液；

(3)将配制好的光固化复合溶液加入成型托盘内，复合溶液的添加量由该层组织的预设厚度决定；由控制电极阵列产生变化的可控电场，借助介电泳力操纵细胞，使细胞移动，并到达目标区域；

(4)将一层组织图案数据导入数字微镜装置(dmd)芯片，通过各个微型反射镜产生该层组织图案的光掩模，使用面曝光技术固化光固化复合溶液；

(5)结束一层组织的光固化之后，重复步骤(3)、(4)，进行下一层组织的细胞操纵和光固化，层层累加，得到体外三维仿生组织模型。

进一步地：

在步骤(2)之前，还包括以下步骤：(1)利用计算机辅助设计软件设计出体外三维组织模型，将设计出的组织模型逐一分层，分层后得到各层组织，生成各层组织图案数据。

所述步骤(3)中，通过精密蠕动泵或注射器控制新进入复合溶液的溶液剂量，进而实现每层的厚度控制，优选地，每一层的厚度为20μm-100μm。

所述步骤(2)中，所述光固化复合溶液中含有多种细胞并配以相应的适合细胞生长的生长因子和细胞外基质。

其中可根据组织构建的需要，在组织的不同分层使用不同的细胞，并配以与之适应的生长因子和胶原。

所述步骤(2)中的细胞外基质材料为胶原、水凝胶、琼脂等的一种或混合物；光固化水凝胶为聚乙二醇丙烯酸酯或聚乙二醇甲基丙烯酸酯；光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙基)-2-对羟基苯甲酸甲酯或1-羟基苯基酮或2，2-二甲氧基-1,2-二苯基甲烷1-1或2羟基2甲基苯丙酮；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为10％-30％，光引发剂的质量浓度为0.1％-1％。

所述步骤(4)中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率密度为10—1000mw/cm^2，激光波长一般为350-400nm；优选地，曝光时间为20-30s。

一种体外三维组织模型的制备装置，其特征在于，包括：支架(101)、运动平台(102)、下部微电极阵列(103)、上部电极板(104)、光路装置(106)、支撑立柱(108)、旋转装置(107)、成形托盘(109)、控制单元(110)、x向运动机构(201)、y向运动机构(202)和升降装置(105)；所述升降装置(105)安装于所述支架(101)上并耦合到所述运动平台(102)上；所述x向运动机构(201)、所述y向运动机构(202)安装于所述运动平台(102)上，所述运动平台(102)安装于所述支架(101)上，所述运动平台(102)上还安装有所述下部微电极阵列(103)，所述控制单元(110)连接所述光路装置(106)和所述下部微电极阵列(103)，控制各个微电极与高电平的通断，同时所述上部电极板(104)连接低电平，以形成可控的变化电场；所述成形托盘(109)安装于所述下部微电极阵列(103)上方；所述支撑立柱(108)与所述支架(101)固定连接；所述旋转装置(107)安装于所述支撑立柱(108)上，可绕所述支撑立柱(108)进行转动，所述上部电极板(104)和所述光路装置(106)安装在所述旋转装置(107)。

进一步地：

所述可控的变化电场的高低电平间电势差为10-20v。

所述旋转装置(107)设有2个卡位装置，分别对应所述光路装置(106)和所述上部电极板(104)位于所述运动平台(102)正上方的位置。

所述光路装置(106)含有激光光源(303)、dmd芯片(301)及透镜装置(302)，激光由所述激光光源(303)产生，经所述dmd芯片(301)与所述透镜装置(302)，从所述光路装置(106)中输出，照射到所述成形托盘(109)上的复合溶液；所述dmd芯片(301)由所述控制单元(110)控制，使激光形成光掩模的图案。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明的体外三维组织模型的制备方法中，所采用的细胞操纵方法和光掩模产生方法适用性强，可以根据需要进行灵活的调整，可用于制备各类组织模型。

2、本发明提出的制备方法与制备装置对于材料的力学性能要求不高，可使用的材料范围广泛。

3、利用介电泳原理操纵细胞，能够实现使细胞移动至目标区域，而且，不同种类细胞的极化性质存在差异，在变化电场中受到的介电泳力也不同，利用这一点可将不同细胞操纵至不同区域，并且可以实现每层组织的细胞分布区域不同，能够形成更复杂的三维组织结构。

4、采用光固化成形方法，可实现常温成形，细胞的成活率高。利用dmd芯片产生光掩模图形，代替了以往工艺中使用的掩模版，不必再为每一层组织结构制作一张掩模版，节约了材料与时间，并且提高了效率，方便快捷。

5、本发明提出的制备装置结构简单，方便操作。其中运动平台可实现三个自由度的运动，便于进行组织结构的定位。旋转装置使上部电极板与光路装置的切换十分便捷，操纵细胞与光固化步骤之间的衔接连贯顺畅，有助于组织结构的精确性和快速成形。

附图说明

图1是本发明的一种体外三维组织模型的制备装置实施例的三维结构简图。

图2是运动平台与托盘的位置关系图。

图3是光路装置内部示意简图。

图4是本发明的一种体外三维组织模型的制备方法中单层组织成形的流程示意图。

图5是本发明的一种体外三维组织模型的制备装置工作流程示意图。

图6是利用变化电场操纵细胞到达目标位置的示意图。

图7是构建单层肝小叶组织模型的示意图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

参阅图1至图3，在一种实施例中，一种体外三维组织模型的制备装置，包括支架(101)、控制单元(110)、运动平台(102)、下部微电极阵列(103)、上部电极板(104)、光路装置(106)、支撑立柱(108)以及旋转装置(107)，其特征在于：该装置还包括x向运动机构(201)、y向运动机构(202)和升降装置(105)；所述升降装置(105)安装于支架(101)立柱内；x向运动机构(201)、y向运动机构(202)安装于运动平台(102)上，运动平台(102)安装于支架(101)上，运动平台(102)上还安装有微电极阵列(103)；托盘(109)安装于微电极阵列(103)上方；支撑立柱(108)底部与支架(101)底部固定连接；旋转装置(107)安装于支撑立柱(108)上，上部电极板(104)和光路装置(106)固连于旋转装置(107)。

光路装置(106)与上部电极板(104)安装在旋转装置(107)上，旋转装置(107)安装于支撑立柱(108)上，可绕立柱进行转动；所述旋转装置(107)设有2个卡位装置，分别对应光路装置(106)和上部电极板(104)位于运动平台(102)正上方的位置,在工艺过程中可实现上部电极板(104)与光路装置(106)的切换。

微电极阵列(103)安装在运动平台(102)上，微电极阵列(103)由若干微小电极排列而成，由控制单元(110)控制各个微小电极与高电平的通断，同时上部电极板(104)连接低电平，以形成可控制的变化电场，高低电平间电势差为10-20v。

如图3所示，光路装置(106)含有激光光源(303)、dmd芯片(301)及透镜装置(302)，激光由光源(303)产生，经dmd芯片(301)与透镜装置(302)，从光路装置(106)中输出，照射到托盘(109)上的复合溶液；所述dmd芯片(301)由控制单元(110)控制，使激光形成光掩模的图案。

参阅图4至图7，在另一种实施例中，一种体外三维组织模型的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用计算机辅助设计软件设计出体外三维组织模型，将设计出的组织模型逐一分层，分层后得到各层组织，生成各层组织图案数据。每一层的厚度可根据需要在100μm-1mm范围内选择，各层的不同厚度可通过灌入复合溶液的不同剂量来实现。

(2)将细胞、生长因子与胶原溶液三者混合均匀，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝胶，再加入光引发剂，得到混有细胞的光固化复合溶液。其中细胞可根据组织构建的需要，在组织的不同分层使用不同的细胞，并配以与之适应的生长因子和胶原。光固化水凝胶为聚乙二醇丙烯酸酯或聚乙二醇甲基丙烯酸酯；光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙基)-2-对羟基苯甲酸甲酯或1-羟基苯基酮或2，2-二甲氧基-1,2-二苯基甲烷1-1或2羟基2甲基苯丙酮；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为10％-30％，光引发剂的质量浓度为0.1％-1％。

(3)使用注射器或蠕动泵等外部装置，将配制好的光固化复合溶液注射到工作台上的无菌托盘(109)内，加入复合溶液的量由该层组织的厚度决定。将上部电极板(104)旋转至运动平台(102)正上方，调整x向运动机构(201)、y向运动机构(202)以及升降装置(105)，使托盘(109)处于合适的位置。控制单元(110)使微电极阵列(103)产生变化的不均匀电场(602)，借助介电泳力操纵细胞(601)，使细胞(601)到达目标区域，如图6所示。

(4)将光路装置(106)旋转至运动平台(102)正上方，将该层组织图案数据导入数字微镜装置(dmd)芯片(301)，通过各个微型反射镜的不同旋转角度，将入射光反射进入或者离开透镜，产生该层组织图案的光掩模，打开激光光源(303)，使用面曝光技术固化光固化复合溶液。其中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率密度为10—1000mw/cm^2，激光波长为350-400nm。曝光时间为20-30s。

(5)结束一层组织的光固化之后，重复步骤(3)、(4)，进行其他层组织的细胞操纵和光固化，层层累加，得到体外三维组织模型。

实施例1

体外三维肝小叶组织模型的制备，具体步骤如下：

(1)根据肝小叶组织结构特点，利用计算机辅助设计软件设计出体外三维肝小叶组织模型，将设计出的组织模型逐一分层，分层后得到各层组织，生成各层组织图案数据。每一层的厚度为100μm。

(2)将细胞、生长因子与胶原溶液三者混合均匀，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝胶，再加入光引发剂，得到混有细胞的光固化复合溶液。其中细胞为人体肝细胞(702)、内皮细胞和间质细胞(701)，胶原溶液中的胶原为ⅰ型胶原，混合液中细胞的混合密度为1×〖10〗^7个/ml，混合液中胶原的浓度为5mg/ml；光固化水凝胶为聚乙二醇甲基丙烯酸酯；光引发剂为2，2-二甲氧基-1,2-二苯基甲烷1-1；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为30％，光引发剂的质量浓度为1％。

(3)使用精密蠕动泵等外部装置，将配制好的光固化复合溶液加入到工作台上的成形托盘(109)内，加入复合溶液的量由100μm厚度和成形托盘尺寸计算得出。将上部电极板(103)旋转至运动平台(102)正上方，调整x向运动机构(201)、y向运动机构(202)以及升降装置(105)，使托盘(109)处于合适的位置。控制单元(110)使微电极阵列(103)产生变化的不均匀电场，借助介电泳力操纵细胞，使肝细胞、内皮细胞和间质细胞按照需求到达目标区域。

(4)将光路装置(106)旋转至运动平台(102)正上方，将该层组织图案数据导入数字微镜装置(dmd)芯片(301)，产生该层组织图案的光掩模，打开激光光源(303)，使用面曝光技术固化该层光固化复合溶液。其中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率为300mw，激光波长为355nm。

(5)结束一层组织的光固化之后，得到单层肝小叶组织模型，如图7所示。重复步骤(3)、(4)，进行其他层组织的细胞操纵和光固化，层层累加，得到体外三维肝小叶组织模型。

以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。