裸鼹鼠巨型分子量透明质酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及裸鼹鼠巨型分子量透明质酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

背景技术：

随着医学的发展，对乳腺癌病人的治疗方式也越来越完善，但治疗过程中还是会出现相应的副作用的。

乳腺癌手术治疗缺陷：

中期乳腺癌患者手术治疗可使原发肿瘤及区域淋巴结能得到最大程度的局部控制，能够较为彻底的切除病灶，提高患者的生存率。但是，乳腺癌发展到中期，病人体质较为虚弱，也有可能已经发生转移。盲目手术后极有可能大大减弱病人体质，为恢复带来难度，且手术后容易复发，一旦复发则更加难治。

乳腺癌化学治疗缺陷：

化疗已成为乳腺癌病程各期的积极治疗措施。乳腺癌病例于手术后给予辅助化疗能提高治愈率。但是，乳腺癌化疗对身体伤害非常大，化疗药物在杀伤癌细胞的同时也会杀死正常细胞。从而导致病人白细胞降低、骨髓抑制、恶心呕吐、体重减轻等多种并发症产生。

技术实现要素：

本发明提供裸鼹鼠巨型分子量透明质酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

本发明裸鼹鼠巨型分子量透明质酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

过表达裸鼹鼠的has2基因的4t1和bt549细胞能够分泌巨型分子量透明质酸(分子量达到6mda)。体外实验表明，巨型分子量透明质酸可以显著促进4t1和bt549细胞的凋亡并抑制增殖：4t1过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的edu阳性细胞比率比对照组低30-40％；bt549过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的edu阳性细胞比率比对照组低20％左右，过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的pcnamrna表达水平显著下调。同时发现在这两种乳腺癌细胞中，过表达裸鼹鼠has2基因以及添加巨型分子量ha可以显著促进两种乳腺癌细胞的凋亡，4t1中死细胞占总细胞的百分比提高了5％，bt549中死细胞占总细胞的百分比提高了10～17％，caspase3/7活性提高了0.2～0.3。巨型分子量透明质酸通过p53调控凋亡相关蛋白p21和bax的表达发挥作用。这些结果对于理解巨型分子量透明质酸在乳腺癌发展中的作用以及设计基于巨型分子量透明质酸治疗方法的应用具有重要意义。本发明制备的巨型分子量透明质酸属人体组织中固有成分，对病人并不会造成伤害，且使用巨型分子量透明质酸制备的水凝胶可实现局部的缓释治疗，只针对乳腺癌病灶部位发挥作用，不伤害其他正常组织，无副作用，操作简单。

附图说明

图1为实施例1中4t1的edu检测，其中4t1-vector为对照组，4t1-has2为4t1过表达has2组，4t1-has2+haase为4t1过表达has2+透明质酸酶组，4t1-vector+hmw-ha为4t1+巨型分子量透明质酸组；

图2为实施例1中bt549的edu检测，其中bt549-vector为对照组，bt549-has2为bt549过表达has2组，bt549-has2+haase为bt549过表达has2+透明质酸酶组，bt549-vector+hmw-ha为bt549+巨型分子量透明质酸组；

图3为实施例1的4t1和bt549中edu阳性细胞比率柱状图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组；

图4为实施例1的4t1和bt549中mrna表达水平检测图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组；

图5为实施例1中4t1的dead/live检测图；其中bt549-vector为对照组，bt549-has2为bt549过表达has2组，bt549-has2+haase为bt549过表达has2+透明质酸酶组，bt549-vector+hmw-ha为bt549+巨型分子量透明质酸组；

图6为实施例1中bt549的dead/live检测图；其中bt549-vector为对照组，bt549-has2为bt549过表达has2组，bt549-has2+haase为bt549过表达has2+透明质酸酶组，bt549-vector+hmw-ha为bt549+巨型分子量透明质酸组；

图7为实施例1中4t1和bt549的dead/live检测分析柱状图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组；

图8为实施例1中4t1和bt549的caspase3/7检测图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组；

图9为实施例1的4t1细胞中总ros水平检测图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组；

图10为实施例1的bt549细胞中总ros水平检测图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组；

图11为实施例1的4t1细胞中线粒体cytc水平检测；

图12为实施例1的bt549细胞中线粒体cytc水平检测；

图13为实施例1的4t-1细胞中p53、p21和bax的westernblot免疫印迹分析图；其中4t1-vector为对照组，4t1-has2为4t1过表达has2组，4t1-has2+haase为4t1过表达has2+透明质酸酶组，4t1-vector+hmw-ha为4t1+巨型分子量透明质酸组；

图14为实施例1的bt549细胞中p53、p21和bax的行westernblot免疫印迹分析图；其中bt549-vector为对照组，bt549-has2为bt549过表达has2组，bt549-has2+haase为bt549过表达has2+透明质酸酶组，bt549-vector+hmw-ha为bt549+巨型分子量透明质酸组；

图15为实施例1的4t1和bt549中p53表达检测图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组；

图16为实施例1的4t1和bt549中p21表达检测图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组；

图17为实施例1的4t1和bt549中bax表达检测图；其中a为对照组，b为过表达has2组，c为过表达has2+透明质酸酶组，d为加入巨型分子量透明质酸组。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式裸鼹鼠巨型分子量透明质酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

过表达裸鼹鼠的has2基因的4t1和bt549细胞能够分泌巨型分子量透明质酸(分子量达到6mda)。体外实验表明，巨型分子量透明质酸可以显著促进4t1和bt549细胞的凋亡并抑制增殖：4t1过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的edu阳性细胞比率比对照组低30-40％；bt549过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的edu阳性细胞比率比对照组低20％左右，过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的pcnamrna表达水平显著下调。同时发现在这两种乳腺癌细胞中，过表达裸鼹鼠has2基因以及添加巨型分子量ha可以显著促进两种乳腺癌细胞的凋亡，4t1中死细胞占总细胞的百分比提高了5％，bt549中死细胞占总细胞的百分比提高了10～17％，caspase3/7活性提高了0.2～0.3。巨型分子量透明质酸通过p53调控凋亡相关蛋白p21和bax的表达发挥作用。这些结果对于理解巨型分子量透明质酸在乳腺癌发展中的作用以及设计基于巨型分子量透明质酸治疗方法的应用具有重要意义。本具体实施方式制备的巨型分子量透明质酸属人体组织中固有成分，对病人并不会造成伤害，且使用巨型分子量透明质酸制备的水凝胶可实现局部的缓释治疗，只针对乳腺癌病灶部位发挥作用，不伤害其他正常组织，无副作用，操作简单。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：裸鼹鼠巨型分子量透明质酸用于促进bt549细胞的凋亡并抑制bt549细胞的增殖。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：裸鼹鼠巨型分子量透明质酸用于促进4t1细胞的凋亡并抑制4t1细胞的增殖。其他与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：裸鼹鼠巨型分子量透明质酸通过p53调控凋亡相关蛋白p21和bax的表达进而促进4t1细胞和bt549细胞的凋亡。其他与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述的裸鼹鼠巨型分子量透明质酸的分子量为6mda。其他与具体实施方式一至四之一相同。

为验证本发明的有益效果，进行以下试验：

试验1：

本试验裸鼹鼠巨型分子量透明质酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

验证试验如下：

(1)裸鼹鼠has2慢病毒载体的构建及表达

首先，我们合成了裸鼹鼠has2基因的cdna序列，将其构建到phr-sin-csgw慢病毒载体上，成功构建后对载体进行的测序比对，结果显示此慢病毒载体构建成功。将构建成功的慢病毒载体感染人的乳腺癌细胞系bt549，筛选表达裸鼹鼠has2基因的bt549单克隆的细胞。检测了乳腺癌细胞系中裸鼹鼠has2基因的过表达情况，结果显示，在bt549细胞中，has2基因过表达56倍。对培养3天的过表达has2的bt549单克隆的细胞，收集细胞培养基，利用脉冲电泳法鉴定bt549细胞分泌的ha的分子量，鉴定结果显示bt549细胞分泌的ha的分子量的大小达到了6mda。分子量鉴定成功后，对收集的细胞培养上清中的ha进行分离纯化，使用的方法是乙醇沉淀法。对纯化后的ha进行了扫描电镜观察，纯化后的ha为结构均一。同时，对提取的巨型分子量ha和购买的2190kd的ha进行ftir检测，发现两者的特征吸收峰相一致。

(2)巨型分子量透明质酸抑制4t1和bt549细胞的增殖

首先，对过表达裸鼹鼠has2基因的4t1和bt549细胞在24h，48h，72h的hmw-ha分泌量进行检测，结果表明，和培养时间的增长，两种细胞中hmw-ha的分泌量逐渐增加。同时，在72h培养基中，加入3u的haase可以完全降解产生的hmw-ha。因此，后续的实验均使用培养了72h的过表达裸鼹鼠has2基因的4t1和bt549细胞进行研究。并对细胞培养了72h的培养基，以及直接加入hmw-ha的培养基进行了脉冲电泳检测，结果表明，直接加入到培养基中的hmw-ha以及细胞分泌的hmw-ha分子量均可达到6md。

为了验证过表达裸鼹鼠has2基因产生的hmw-ha对4t1和bt549细胞增殖有影响，观察了细胞的生长情况，并做了edu检测，结果如图1和图2显示，其中4t1-vector为对照组，4t1-has2为4t1过表达has2组，4t1-has2+haase为4t1过表达has2+透明质酸酶组，4t1-vector+hmw-ha为4t1+巨型分子量透明质酸组；bt549-vector为对照组，bt549-has2为bt549过表达has2组，bt549-has2+haase为bt549过表达has2+透明质酸酶组，bt549-vector+hmw-ha为bt549+巨型分子量透明质酸组；从图1和2可知，过表达has2组可以显著抑制edu的表达；在过表达has2细胞中加入透明质酸酶，分解已经分泌的巨型分子量ha，edu表达的抑制效应消失，而在4t1和bt549细胞中直接添加巨型分子量ha也可以显著抑制edu的表达。从图3可知，4t1过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的edu阳性细胞比率比对照组低30-40％；bt549过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的edu阳性细胞比率比对照组低20％左右，同时，过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组的pcnamrna表达水平显著下调(图4)，进一步证实了巨型分子量ha而不是裸鼹鼠has2基因抑制4t-1和bt549细胞的增殖。cck-8检测的结果也显示，与对照组和加入透明质酸酶组相比，过表达裸鼹鼠has2基因组以及添加巨型分子量ha组细胞生长缓慢，并且可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖。

(3)巨型分子量的ha促进4t-1和bt549细胞的凋亡

为了验证过表达裸鼹鼠has2基因对4t-1和bt549细胞凋亡有影响，进行了细胞dead/live检测，结果如图5、6和图7所示，与对照组和加入透明质酸酶组相比，过表达裸鼹鼠has2基因以及添加巨型分子量ha可以显著促进两种乳腺癌细胞的凋亡，4t1中死细胞占总细胞的百分比提高了5％，bt549中死细胞占总细胞的百分比提高了10～17％。此外还进行了caspase3/7检测，结果如图8所示，由图8可知，与对照组和加入透明质酸酶组相比，过表达裸鼹鼠has2基因以及添加巨型分子量ha可以显著促进caspase3/7表达，4t1中caspase3/7活性提高了0.2～0.3，bt549中caspase3/7活性提高了0.2～0.3。同时，对细胞中总ros水平检测结果如图9和10所示，由图9和10可知过表达裸鼹鼠has2基因以及添加巨型分子量ha可以显著促进两种乳腺癌细胞的ros产量。最后，对细胞中线粒体cytc水平检测结果如图11和12显示，对照组和加入透明质酸酶组细胞中cytc表达成点星状，而过表达裸鼹鼠has2基因以及添加巨型分子量ha组在细胞中cytc表达非常模糊，cytc大量释放。同时，对4t-1和bt549细胞中的p53、p21和bax进行westernblot免疫印迹分析，结果如图13和图14所示，通过对图13和图14进行灰度分析，得到了4t-1和bt549细胞中的p53、p21和bax表达检测图，结果如图15、16和17所示，由图可知，过表达裸鼹鼠has2基因的两种细胞以及添加巨型分子量ha可以激活p53-p21通路，促进p53、p21和bax表达显著上调，裸鼹鼠巨型分子量透明质酸通过p53调控凋亡相关蛋白p21和bax的表达，显著促进bt549细胞的凋亡。