一种畜禽养殖中使用姬松茸多糖抗艾美耳球虫的方法与流程

本发明属于中药提取技术领域，特别是涉及畜禽养殖中姬松茸多糖抗寄生虫的应用。

背景技术：

姬松茸(agaricusblazeimurrill，abm)产自巴西，其味道鲜美，能够增强机体的免疫调节机能，具有抗病毒、抗细菌、抗寄生虫感染，抗肿瘤，是具有保健功能的食药两用真菌。

研究发现，姬松茸多糖的有效成分能够显著地增强体液免疫和细胞免疫反应，说明这种多糖的有效成分能够激发th1型免疫力，可以作为新型的免疫佐剂进行研发。姬松茸多糖通过白介素-12(il-12)诱导干扰素-γ(ifn-γ)的分泌来激活杀伤细胞(nk细胞)，从而促进先天性免疫反应。姬松茸多糖可以有效刺激t细胞和巨噬细胞释放白介素-1β(il-1β)和白介素-6(il-6)，进而提高机体针对异种抗原的特异性抗体产生。ni等研究发现，姬松茸多糖的提取物能够提高巨噬细胞的吞噬活性和kn细胞的杀伤能力，促进体液免疫反应并调节细胞免疫反应，进而调节先天性免疫应答和适应性免疫应答。

很多研究报道姬松茸多糖具有抗病毒活性，能够抑制脊髓灰质炎病毒(pv)、西方马型脑炎病毒(weev)、乙型肝炎(hbv)、丙型肝炎(hcb)、单纯性疱疹病毒(hsv-1、hsv-2)的复制。体外试验表明，姬松茸多糖能够诱导小鼠骨髓巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-8(il-8)和一氧化氮(no)，并抑制由weev引起的vero细胞病变，从而体现出抗病毒感染效应。姬松茸多糖也能够增强机体特异性口蹄疫病毒(fmdv)dna疫苗的体液免疫反应，并促进t细胞的增殖。

姬松茸提取物对细菌、真菌也有抑菌作用。姬松茸多糖能够刺激人的单核细胞捕获白色念珠菌并产生促炎性反应因子。等研究发现，姬松茸热水浸提物能够降低绿脓杆菌的菌膜形成能力，减少绿脓菌素的产生，降低菌体的运动能力，显著地减少绿脓杆菌的毒力因子。

姬松茸多糖还具有抗寄生虫感染的作用。体内和体外试验表明，姬松茸多糖的子实体能够控制捻转血矛线虫的发育和增殖。姬松茸多糖能够对抗疟原虫的感染，增强宿主的抗氧化能力，减轻虫血症的发生，增加宿主的存活率，减少体重的损失，对脑型疟产生保护性免疫反应，减少肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-1β(il-1β)和白介素-6(il-6)的分泌，减轻对脑部的损伤。姬松茸多糖的提取物作为th1型疫苗佐剂，能够增强抗内脏型利氏曼原虫dna疫苗的免疫反应。

镰形艾美耳球虫(eimeriafalciformis)和柔嫩艾美耳球虫(eimeriatenella)均隶属于顶复门(apicomplexa)、孢子虫纲(sporozoasida)、球虫亚纲(coccidiasina)、真球虫目(eucoccidiorida)、艾美耳亚目(eimeriorina)、艾美耳科(eimeriidae)、艾美耳属(eimeria)，它们分别感染小鼠和家禽的盲肠粘膜组织。其中，镰形艾美耳球虫的潜隐期为7天，症状明显期10-16天；柔嫩艾美耳球虫的潜隐期为5.5天，症状明显期8-14天。艾美耳球虫给农业生产造成巨大的损失，主要以药物预防结合疫苗预防作为防治球虫的手段。目前，由于抗球虫化学药物的使用极易导致耐药型虫株的产生，且长期使用造成药物残留的危害，而姬松茸多糖的使用安全性良好，作为候选的抗球虫药物，具有重要的研究意义和应用价值。

近年来越来越多的研究证明姬松茸多糖具有抗体内寄生虫感染的作用，但是姬松茸多糖对于其它体内寄生原虫的免疫调节作用还没有详细的研究，比如姬松茸多糖对感染镰形艾美耳球虫的小鼠体重以及免疫器官的影响，姬松茸多糖对雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫的卵囊排除量的影响等等都有待于本领域的技术人员进行不断地探索。

技术实现要素：

本发明的目的是针对姬松茸多糖应用技术的不足，而提出一种畜禽养殖中使用姬松茸多糖抗艾美耳球虫的方法。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种畜禽养殖中使用姬松茸多糖抗艾美耳球虫的方法，该方法是在家畜家禽的饲养过程中，每天以100mg/kg体重的计量将姬松茸多糖摄入到家畜家禽的体内，以抵抗艾美耳球虫的感染。

而且，所述将姬松茸多糖摄入到家畜家禽体内的具体方法包括：将姬松茸多糖搅拌在饲料中喂服、将姬松茸多糖溶于水中饮服或采用更为精确的人工灌服。

本发明的优点及其效果

1、本发明确定了镰形艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的最佳感染剂量分别为500个/只和5×10³个/只。

2、本发明找出了每天以100mg/kg的剂量灌服姬松茸多糖对小鼠所代表的家畜类对抗艾美耳球虫感染的良好作用。

3、本发明确定了以100mg/kg的姬松茸多糖剂量拌料饲喂，对雏鸡所代表的家禽类对抗艾美耳球虫感染的良好作用。

4、本发明确定了以100mg/kg的姬松茸多糖剂量喂养，对畜禽养殖中动物免疫器官的生长发育有良好作用。

附图说明

图1是感染不同剂量镰形艾美耳球虫的小鼠每日存活率示意图：4组试验动物，1-10天，每组10只，同一时间点内各组比较。

图2是各组小鼠体重的测定结果图：4组试验动物，0-17天，每组10只，同一时间点内各组比较。

图3是各组小鼠粪便中ogp的测定结果图：4组试验动物，每组10只，同一时间点内各组比较。

图4是各组小鼠器官指数的测定结果图：4组试验动物，每组10只，同一时间点内各组比较差异，其中，*，p<0.050。

图5是感染不同剂量柔嫩艾美耳球虫的小鼠每日存活率示意图：4组试验动物，1-10天，每组10只，同一时间点内各组比较。

图6是各组雏鸡粪便中ogp的测定结果图：4组试验动物，每组10只，同一时间点内各组比较。

图7是各组雏鸡免疫器官指数的测定结果图：4组试验动物，每组10只，同一时间点内各组比较差异，其中，*，p<0.050；**，p<0.010。

具体实施方式

以下结合附图对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

第一步，为了找出姬松茸多糖的应用方法，本发明首先要确定镰形艾美耳球虫的最佳感染剂量，具体方法步骤是：

(1)40只30日龄的雌性昆明小鼠适应性喂养3天，随机分为4组，每组10只，第1组、第2组、第3组的小鼠分别按照500个/只、5000个/只、50000个/只镰形艾美耳球虫的剂量经口感染，第4组灌服等量的生理盐水。

(2)感染后观察10天，记录每日各组小鼠的精神状态、活动情况、皮毛光泽、食欲排泄、死亡等临床症状。

第1组和第4组的小鼠在试验中无死亡情况，两组小鼠的精神、活动、皮毛、食欲、排泄等临床症状均无异常；如图1所示，第2组的小鼠在感染后第7天开始出现死亡情况，到试验第10天，共死亡4只小鼠；第3组的小鼠在感染后第5天开始出现死亡情况，到试验第10天小鼠全部死亡，说明小鼠感染剂量为500个/只的镰形艾美耳球虫不会导致小鼠死亡，而镰形艾美耳球虫的致死剂量为50000个/只。因此，试验组小鼠以500个/只的剂量感染镰形艾美耳球虫。

第二步，确定姬松茸多糖对小鼠生长发育与对抗镰形艾美耳球虫感染的作用，具体的确定过程如下：

(1)小鼠适应性喂养2天后，随机分为4组，每组10只。第1组灌服姬松茸多糖溶液100mg/kg，第2组灌服姬松茸多糖溶液40mg/kg，连续7天，同时第3、4组灌服等量的生理盐水，记录各组小鼠的体重变化。如图2所示，从试验第1天起，各组小鼠的体重呈缓慢上升趋势，第1组小鼠体重平均值高于第2、3、4组，说明100mg/kg姬松茸多糖对小鼠的增重效果优于40mg/kg姬松茸多糖和不喝姬松茸多糖的小鼠。

(2)在试验第8天，第1、2、3组分别灌服镰形艾美耳球虫孢子化卵囊500个/只，0.2ml/只，第4组灌服等量的生理盐水，每日观察各组小鼠对镰形艾美耳球虫感染后的临床症状，记录各组小鼠的体重变化。如图2所示，镰形艾美耳球虫感染后，即试验第8-14天，各组小鼠的体重均有缓慢上升，在试验第15天，第1、2、3组体重均有显著下降，其中第1组体重下降程度低于第2组和第3组，说明100mg/kg姬松茸多糖组对于小鼠抗镰形艾美耳球虫感染的效果优于40mg/kg姬松茸多糖组和不喝姬松茸多糖组。

(3)在试验第14天清除各组小鼠的垫料，收集第15-17天的粪便，各组粪便分别搅拌均匀，再分别称取2g粪便至塑料小烧杯中，加入60ml饱和盐水，搅拌均匀，充入改良麦克马氏板记数室，静止3min后在显微镜下计数，计算每克粪便中卵囊数(opg＝计数所得读数×200)。如图3所示，各组opg中，第1组为300，第2组为6×10⁴，第3组为6×10⁵，第4组为0，说明100mg/kg姬松茸多糖组对于小鼠抗镰形艾美耳球虫感染的效果优于40mg/kg姬松茸多糖组和不喝姬松茸多糖组。

(4)在试验第17天后剖检，观察各组小鼠的器官病变，计算肝脏、肾脏和脾脏的器官指数(各脏器重量与体重之比)。在试验第17天后剖检，各组小鼠实质器官的形状、大小与色泽均正常，未见病变情况。如图4所示，各组小鼠的肝脏指数和肾脏指数差异不显著，脾脏指数第1组与第3组相比，差异显著，说明100mg/kg姬松茸多糖能够促进小鼠脾脏的生长发育，增强小鼠抗镰形艾美耳球虫感染的抵抗力。

第三步，为了找出姬松茸多糖的应用方法，需要确定柔嫩艾美耳球虫的最佳感染剂量，具体方法步骤是：

(1)40只4日龄的aa肉鸡适应性喂养3天，随机分为4组，每组10只，第1组、第2组、第3组的雏鸡分别按照5×10³个/只、5×10⁴个/只、5×10⁵个/只柔嫩艾美耳球虫的剂量经口感染，第4组灌服等量的生理盐水。

(2)感染后观察10天，记录每日各组雏鸡的精神状态、活动情况、皮毛光泽、食欲排泄、死亡等临床症状。

第1组和第4组的雏鸡在试验中无死亡情况，两组雏鸡的精神、活动、羽毛、食欲、排泄等临床症状均无异常；如图5所示，第2组的雏鸡在感染后第9天开始出现死亡情况，到试验第10天，共死亡2只雏鸡；第3组的雏鸡在感染后第6天开始出现死亡情况，到试验第10天雏鸡全部死亡，说明雏鸡感染剂量为5×10³个/只的柔嫩艾美耳球虫不会导致雏鸡死亡，而柔嫩艾美耳球虫的致死剂量为5×10⁵个/只。因此，试验组雏鸡以5×10³个/只的剂量感染柔嫩艾美耳球虫。

第四步，确定姬松茸多糖对雏鸡生长发育与对抗柔嫩艾美耳球虫感染的作用，具体的确定过程如下：

(1)40只4日龄的aa肉鸡适应性喂养3天，随机分为4组，每组10只。第1组将姬松茸多糖拌料，剂量为100mg/kg体重，第2组将姬松茸多糖拌料，剂量为40mg/kg体重，连续饲喂7天，同时第3、4组正常饲喂。在试验第8天，第1、2、3组分别灌服柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×10³个/只，0.2ml/只，第4组灌服等量的生理盐水，每日观察各组雏鸡对柔嫩艾美耳球虫感染后的临床症状。在试验第13天清除各组雏鸡的粪便，收集第14-17天的粪便，各组粪便分别搅拌均匀，再分别称取2g粪便至塑料小烧杯中，加入60ml饱和盐水，搅拌均匀，充入改良麦克马氏板记数室，静止3min后在显微镜下计数，计算每克粪便中卵囊数(opg＝计数所得读数×200)。如图6所示，各组opg中，第1组为800，第2组为4.8×10⁴，第3组为2.56×10⁵，第4组为0，说明100mg/kg姬松茸多糖拌料饲喂对于雏鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染的效果优于40mg/kg姬松茸多糖和不用姬松茸多糖。

(4)在试验第17天后剖检，观察各组雏鸡的器官病变，计算胸腺、脾脏和法氏囊的器官指数(各脏器重量与体重之比)。在试验第17天后剖检，各组雏鸡实质器官的形状、大小与色泽均正常，未见病变情况。如图7所示，在胸腺指数中，3组与4组相比差异极显著(p<0.01)，说明柔嫩艾美耳球虫感染影响胸腺的发育，进而降低机体的免疫力；1组与2组相比差异显著(p<0.05)，1组与3组相比差异显著(p<0.05)，2组与4组相比差异极显著(p<0.01)，2组与3组相比差异不显著(p>0.05)，1组与4组相比差异不显著(p>0.05)，说明100mg/kg姬松茸多糖比40mg/kg姬松茸多糖拌料饲喂能够促进胸腺的生长发育，进而有效抵抗柔嫩艾美耳球虫的感染。

如图7所示，在脾脏指数中，3组与4组相比差异显著(p<0.05)，说明柔嫩艾美耳球虫感染影响脾脏的发育，进而降低机体的免疫力；1组与3组相比差异显著(p<0.05)，2组与3组相比差异极显著(p<0.01)，2组与4组相比差异不显著(p>0.05)，1组与4组相比差异不显著(p>0.05)，1组与2组相比差异不显著(p>0.05)，说明姬松茸多糖能够促进脾脏的发育，进而有效抵抗柔嫩艾美耳球虫的感染，且100mg/kg与40mg/kg的姬松茸多糖拌料饲喂对于脾脏的发育差异不显著。

如图7所示，在法氏囊指数中，3组与4组相比差异极显著(p<0.01)，说明柔嫩艾美耳球虫感染影响法氏囊的发育，进而降低机体的免疫力；1组与3组相比差异显著(p<0.05)，2组与3组相比差异显著(p<0.05)，2组与4组相比差异显著(p<0.05)，1组与4组相比差异不显著(p>0.05)，说明100mg/kg姬松茸多糖比40mg/kg姬松茸多糖拌料饲喂能够更为显著地促进法氏囊的发育，进而有效抵抗柔嫩艾美耳球虫的感染。