本发明涉及一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，属于细胞生物技术领域。
背景技术：
口腔粘膜作为人体生物性屏障的第一道防线，在日常生活中发挥着至关重要的作用，但口腔粘膜的位置及其周围环境导致多种因素可引起口腔粘膜组织缺失，如口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及修复前的牙槽外科往往有大面积口腔粘膜缺损，临床上常以皮片移植或皮瓣转移修复，但皮片移植常因挛缩导致口腔狭窄、影响功能，局部皮瓣转移则常致局部臃肿，形态不佳，患者难以接受。而且，自体组织移植是以牺牲正常组织为代价的“以创伤修复损伤”的治疗模式，既增加了新的创伤，又增加了手术并发症的机率，且自体组织来源有限，限制了其临床应用。近年来，随着生物材料的兴起，临床上口腔粘膜缺损修复取得较为满意的治疗效果，但对于较大面积的口腔粘膜缺损，仍然具有较大的局限性，很难达到预期的治疗效果。寻找简便、安全、有效的口腔粘膜修复材料已成为治疗口腔粘膜疾患，提高患者生存质量的关键。组织工程学是一门新兴的学科，它应用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发能修复损伤组织和改善其功能的生物替代物，通过少量组织细胞体外培养扩增后构建具有生命力的活体组织，达到修复组织缺损的目的。
小肠粘膜下层（smallintestinalsubmucosa，sis）是天然细胞外基质类生物衍生材料，它是由一层致密的结缔组织构成，主要含有ⅰ、ⅲ型胶原蛋白，无免疫原性，具有抗微生物活性，有良好的生物力学性能和生物相容性。sis携带多种生长因子如fgf-2、ctgf、tgf-b等，可促进多种细胞在材料上黏附、生长和分化，并能促进组织再生，是一种良好组织工程的生物支架材料。
运用组织工程技术，将口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞种植在支架材料上，构建有活性的口腔粘膜修复材料，为临床上口腔粘膜缺损修复重建提供新的途径。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题是使因口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及修复前的牙槽外科等所造成的大面积口腔粘膜缺损得到有效地修复及重建。本发明提供了一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，材料来源充分，能够使口腔粘膜上皮细胞在口腔补片中大量增殖，为临床上口腔粘膜大面积缺损的修复重建提供新的途径。为解决上诉技术问题，本发明提供一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，包括以下步骤：
1.口腔补片的制备：采用小肠粘膜下层制备口腔补片。步骤为取材于猪小肠粘膜下层，经去细胞、去dna、病毒灭活、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得。
2.口腔粘膜上皮细胞的原代培养：无菌条件下于手术病人口腔内获取口腔粘膜组织。用含双抗的生理盐水反复冲洗，再用pbs液冲洗，用眼科剪除去粘膜下组织，剪成约5mm×5mm的小块，放入培养皿内，加入含0.25％dispaseⅱ的dksfm培养基并没过组织块，4℃消化16～18h，将表层上皮与上皮下层用眼科镊分开。上皮层加入消化酶37℃消化15min（5min吹打振动1次），加fbs液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液。经200目不锈钢网过滤，离心，弃上清，pbs液清洗3次，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种于细胞培养皿内，加入培养液3～5ml，置37℃、5%co2饱和湿度细胞培养箱中培养，第3天开始首次换液，以后每2d换液1次。
3.口腔粘膜上皮细胞的传代培养：倒置相差显微镜下观察，当口腔粘膜上皮细胞铺满培养皿底2/3以上时，弃掉旧培养液，4℃pbs清洗3次，加入消化酶37℃消化，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后，加入培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打，形成细胞悬液，离心，弃上清，加入培养液重悬细胞，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种新培养皿内继续培养。
4.口腔粘膜上皮细胞与口腔补片复合培养：取步骤1.中获得的口腔补片，放入细胞培养皿中，用dksfm培养基浸泡1～3天后，加入6～20%的牛血清，放入37℃细胞培养箱中孵育12～16h；取步骤3.中传代培养的口腔粘膜上皮细胞，用含0.02％edta的消化酶消化，离心、去上清，pbs反复漂洗3次后加入培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释后种至放有口腔补片的细胞培养皿中，放入37℃，5%co2细胞培养箱中培养，每1～3天换液一次。待细胞增殖到5～10×105/cm2时，可移植到口腔粘膜受损区，并缝合固定。
所述消化酶溶液为0.25%的胰蛋白酶溶液。
步骤2.中所述的双抗的生理盐水为含青霉素100ug/ml与链霉素100ug/ml的生理盐水。
步骤2.中所述的fbs为10%的fbs。
所述离心过程使用的转速及时间为800rpm，5min。
所述的培养液为含有10%fbs的dksfm培养液。
步骤4.中所述的细胞悬液的接种密度为2～5×106/皿。
步骤4.中所述口腔补片尺寸大小为5cm×4cm。
步骤4.中所述传代培养的口腔粘膜上皮细胞为2代培养的细胞。
本发明所达到的有益效果在于：
1.本发明选择sis作为口腔补片材料，主要有ⅰ、ⅲ型胶原蛋白具有良好的生物力学性能，抗微生物活性，良好的细胞相容性及无抗原性，能促进口腔粘膜上皮细胞的粘附、生长和分化，因此口腔粘膜上皮细胞能大量增殖形成紧密的细胞层。
2.本发明采用口腔粘膜上皮细胞复合口腔补片，可提高大面缺损的口腔粘膜修复效率。
因此，本发明所提供的一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，材料容易获取，能够使口腔粘膜上皮细胞在口腔补片中大量增殖，提高大面积缺损的口腔粘膜修复效率，为临床上运用组织工程技术修复口腔粘膜缺损提供新的途径。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明对的技术方案，而不能以此用来限制本发明的保护范围。
实施例一
1.口腔补片的制备：采用小肠粘膜下层制备口腔补片。步骤为取材于猪小肠粘膜下层，经去细胞、去dna、病毒灭活、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得。
2.口腔粘膜上皮细胞的原代培养：无菌条件下于手术病人口腔内获取口腔粘膜组织。用含青霉素100ug/ml与链霉素100ug/ml的双抗生理盐水反复冲洗，再用pbs液冲洗，用眼科剪除去粘膜下组织，剪成约5mm×5mm的小块，放入培养皿内，加入含0.25％dispaseⅱ的dksfm培养基并没过组织块，4℃消化16h，将表层上皮与上皮下层用眼科镊分开。上皮层加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化15min（5min吹打振动1次），加10%的fbs液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液。经200目不锈钢网过滤，800rpm，离心5min，弃上清，pbs液清洗3次，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种于细胞培养皿内，加入含有10%fbs的dksfm培养液3ml，置37℃、5%co2饱和湿度细胞培养箱中培养，第3天开始首次换液，以后每2d换液1次。
3.口腔粘膜上皮细胞的传代培养：倒置相差显微镜下观察，当口腔粘膜上皮细胞铺满培养皿底2/3以上时，弃掉旧培养液，4℃pbs清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后，加入含有10%fbs的dksfm培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打，形成细胞悬液，800rpm，离心5min，弃上清，加入含有10%fbs的dksfm培养液重悬细胞，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种新培养皿内继续培养。
4.口腔粘膜上皮细胞与口腔补片复合培养：取步骤1.中获得的尺寸大小为5cm×4cm的口腔补片，放入细胞培养皿中，用dksfm培养基浸泡1天后，加入6%的牛血清，放入37℃细胞培养箱中孵育12h；取步骤3.中2代培养的口腔粘膜上皮细胞，用含0.02％edta的0.25%的胰蛋白酶消化，800rpm，离心5min，去上清，pbs反复漂洗3次后加入含有10%fbs的dksfm培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释后按每皿2×106个的接种密度种至放有口腔补片的细胞培养皿中，放入37℃，5%co2细胞培养箱中培养，每1天换液1次。待细胞增殖到5×105/cm2时，可移植到口腔粘膜受损区，并缝合固定。
实施例二
1.口腔补片的制备：采用小肠粘膜下层制备口腔补片。步骤为取材于猪小肠粘膜下层，经去细胞、去dna、病毒灭活、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得。
2.口腔粘膜上皮细胞的原代培养：无菌条件下于手术病人口腔内获取口腔粘膜组织。用含青霉素100ug/ml与链霉素100ug/ml的双抗生理盐水反复冲洗，再用pbs液冲洗，用眼科剪除去粘膜下组织，剪成约5mm×5mm的小块，放入培养皿内，加入含0.25％dispaseⅱ的dksfm培养基并没过组织块，4℃消化17h，将表层上皮与上皮下层用眼科镊分开。上皮层加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化15min（5min吹打振动1次），加10%的fbs液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液。经200目不锈钢网过滤，800rpm，离心5min，弃上清，pbs液清洗3次，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种于细胞培养皿内，加入含有10%fbs的dksfm培养液4ml，置37℃、5%co2饱和湿度细胞培养箱中培养，第3天开始首次换液，以后每2d换液1次。
3.口腔粘膜上皮细胞的传代培养：倒置相差显微镜下观察，当口腔粘膜上皮细胞铺满培养皿底2/3以上时，弃掉旧培养液，4℃pbs清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后，加入含有10%fbs的dksfm培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打，形成细胞悬液，800rpm，离心5min，弃上清，加入含有10%fbs的dksfm培养液重悬细胞，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种新培养皿内继续培养。
4.口腔粘膜上皮细胞与口腔补片复合培养：取步骤1.中获得的尺寸大小为5cm×4cm的口腔补片，放入细胞培养皿中，用dksfm培养基浸泡2天后，加入10%的牛血清，放入37℃细胞培养箱中孵育14h；取步骤3.中2代培养的口腔粘膜上皮细胞，用含0.02％edta的0.25%的胰蛋白酶消化，800rpm，离心5min、去上清，pbs反复漂洗3次后加入含有10%fbs的dksfm培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释后按每皿4×106个的接种密度种至放有口腔补片的细胞培养皿中，放入37℃，5%co2细胞培养箱中培养，每2天换液1次。待细胞增殖到8×105/cm2时，可移植到口腔粘膜受损区，并缝合固定。
实施例三
1.口腔补片的制备：采用小肠粘膜下层制备口腔补片。步骤为取材于猪小肠粘膜下层，经去细胞、去dna、病毒灭活、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得。
2.口腔粘膜上皮细胞的原代培养：无菌条件下于手术病人口腔内获取口腔粘膜组织。用含青霉素100ug/ml与链霉素100ug/ml的双抗生理盐水反复冲洗，再用pbs液冲洗，用眼科剪除去粘膜下组织，剪成约5mm×5mm的小块，放入培养皿内，加入含0.25％dispaseⅱ的dksfm培养基并没过组织块，4℃消化18h，将表层上皮与上皮下层用眼科镊分开。上皮层加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化15min（5min吹打振动1次），加10%的fbs液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液。经200目不锈钢网过滤，800rpm，离心5min，弃上清，pbs液清洗3次，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种于细胞培养皿内，加入含有10%fbs的dksfm培养液5ml，置37℃、5%co2饱和湿度细胞培养箱中培养，第3天开始首次换液，以后每2d换液1次。
3.口腔粘膜上皮细胞的传代培养：倒置相差显微镜下观察，当口腔粘膜上皮细胞铺满培养皿底2/3以上时，弃掉旧培养液，4℃pbs清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后，加入含有10%fbs的dksfm培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打，形成细胞悬液，800rpm，离心5min，弃上清，加入含有10%fbs的dksfm培养液重悬细胞，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种新培养皿内继续培养。
4.口腔粘膜上皮细胞与口腔补片复合培养：取步骤1.中获得的尺寸大小为5cm×4cm的口腔补片，放入细胞培养皿中，用dksfm培养基浸泡3天后，加入20%的牛血清，放入37℃细胞培养箱中孵育16h；取步骤3.中2代培养的口腔粘膜上皮细胞，用含0.02％edta的0.25%的胰蛋白酶消化，800rpm，离心5min、去上清，pbs反复漂洗3次后加入含有10%fbs的dksfm培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释后按每皿5×106个的接种密度种至放有口腔补片的细胞培养皿中，放入37℃，5%co2细胞培养箱中培养，每3天换液1次。待细胞增殖到10×105/cm2时，可移植到口腔粘膜受损区，并缝合固定。