一种PFOE水响应形状记忆组织工程支架及其制备方法与流程

本发明属于组织工程支架领域，特别涉及一种pfoe水响应形状记忆组织工程支架及其制备方法。

背景技术：

组织工程技术是近些年来迅速发展的治疗人体疾病的全新途径，组织工程已经在皮肤和软骨再生等领域得到了实际的临床应用。其中组织工程支架是核心，为此开发具有形状记忆功能的智能型组织工程支架来拓宽组织工程支架的应用成为了一个潜在的研究方向。传统的热响应形状记忆聚合物由于需要将转变温度控制到人体温附近，因此在设计和制备上面临更多挑战。相比而言，水响应形状记忆聚合物要具有更大的应用潜力，由于人体内的体液大部分都是水，因此水响应形状记忆聚合物一旦和人体体液相接触便能够产生形状回复效应。

形状记忆组织工程支架的研究正在引起人们的关注，能够在人体温附近进行形状恢复的材料也已经被研发出来。类似的工作有piotrrychter等用l-丙交酯/乙交酯/三亚甲基碳酸酯等通过嵌段共聚合成生物可降解高分子材料，这些材料可以很容易的加工成为多孔的三维组织工程支架。它们可以加工成为多种形状，并且具有高孔隙率，且在机械性能和功能上都扮演着重要角色，在组织再生期间可以为特定细胞的生长提供载体。支架直接植入组织缺失的部位，进行组织再生，因此在结构和形态上应该和周边的组织相似。此外，还要适应组织缺损部位的尺寸和形状大小，因此形状记忆组织工程支架的研究意义就凸显出来。在此基础上，起作用的细胞向内生长进入多孔支架材料，可以使新组织有效的生长，最有意思的是这种支架植入物可以最大程度的降低外科手术带来的痛苦，使微创治疗获得潜在应用。通过注射技术将可生物吸收的凝胶基质材料填充到缺损部位的相关应用已经在进行，然而大多数时候这些基质的材料在宏观上不符合细胞生长所需结构的标准。通过使用乙交酯/丙交酯共聚物和他们的复合材料获得了更具前景的支架。

微创手术领域对于具有形状记忆功能的可生物降解和生物相容性好的高分子材料的兴趣正在激烈增长。尤其是能够随着温度自我展开或者扩大的高分子材料已经在很多植入物和医疗器件上获得应用，这种材料在再生医疗上应用的想法是十分有趣的，而且相比于水凝胶材料显得更加适合。piotrrychter等制备的多孔形状记忆支架能够在人体温附近回复，且在植入人体内的时候能够压缩到很小的尺寸，适合微创手术治。当支架植入到骨缺损的部位时，多孔支架能够在体温的刺激下从临时的微小尺寸自我扩张完全充满缺损部位，重现支架的多孔微观结构，有利于细胞在整个材料上进行最佳的吸附和增殖。

dankai等用聚己内酯(pcl)和聚二甲基硅氧烷(pdms)共聚制备出具有形状记忆效应的共聚物，通过静电纺丝加工成多孔的支架同样具有形状记忆的效果。形状回复率大于90％，可以在45℃左右回复到初始形状，通过细胞实验证明可以促进成骨细胞增殖，可用于骨再生和骨修复领域。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种pfoe水响应形状记忆组织工程支架及其制备方法，该支架具有多孔结构和高孔隙率的特性，并且在室温下处于玻璃化转变温度以上，能够很好的保持初始的形状；同时还具有良好的水响应的形状记忆功能以及生物可降解性能，具有良好的应用前景。

本发明提供了一种pfoe水响应形状记忆组织工程支架，所述支架为由羟基化的高分子材料pfoe通过交联得到的多孔支架；其中，pfoe的结构式为：

n的范围为16～17。

本发明还提供了一种pfoe水响应形状记忆组织工程支架的制备方法，包括：

(1)将重结晶的富马酸和1,2,7,8-二环氧辛烷在无水无氧的n2氛围下混合，再加入催化剂和溶剂，90℃-100℃下通过酸诱导环氧开环反应制得pfoe；

(2)将pfoe配制成溶液，随后通过盐析法交联得到pfoe水响应形状记忆组织工程支架。

所述步骤(1)中的富马酸和1,2,7,8-二环氧辛烷的摩尔比为1:1。

所述步骤(1)中的催化剂为四丁基溴化铵，加入量为富马酸的0.6mol％。

所述步骤(1)中的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺。

所述步骤(2)中的pfoe用四氢呋喃配制成溶液。

所述步骤(2)中的交联为热交联或光交联。

本发明通过酸诱导环氧开环反应一步合成出聚富马酸辛二环氧(poly(fumaratecctadienediepoxide)-pfoe)，一步合成方法简单，且原料富马酸和1,2,7,8-二环氧辛烷商业可得不需要合成原料单体，便于大量制备。合成产物是可降解的多羟基聚酯，大量的羟基赋予其良好的亲水性和生物相容性，而主链包含较长的碳链和微亲水的反式丁烯二酸，保持了合适的亲疏水性。此外，富马酸含有的羟基和羧基能够促进细胞的贴附和增殖，有利于组织的形成。

本发明优选的选择使用热交联的方法来制备pfoe支架，因为光交联制备的支架厚度有限。此外，热交联设备简单，操作容易，适合大量的制备支架。由于合成的pfoe分子量较低，因此使用“盐析法”来制备多孔支架。

有益效果

本发明具有多孔结构和高孔隙率的特性，并且在室温下处于玻璃化转变温度以上，能够很好的保持初始的形状；此外，该材料表面有大量裸露的羟基，具有生物活性，可进行功能化修饰；又因其良好的水响应形状记忆特性和良好的生物降解性能，其在微创领域有着潜在的应用。

附图说明

图1为pfoe单体的¹hnmr谱图；

图2为pfoe单体的红外光谱图；

图3为心肌细胞在tcps，pfoe，plga表面培养1天和3天后的倒置显微镜照片；

图4为心肌细胞在tcps，pfoe，plga上的mtt评估；

图5为pfoe支架的红外光谱图；

图6为pfoe支架的tga曲线；

图7为pfoe支架的dsc曲线；

图8为不同交联时间的支架在干态下的应力应变曲线；

图9a为交联24h的支架湿态下的循环压缩应力应变曲线；

图9b为交联36h的支架湿态下的循环压缩应力应变曲线；

图9c为交联48h的支架湿态下的循环压缩应力应变曲线；

图10为pfoe-24h支架的sem电镜照片；其中，(a)初始形态500×，(b)初始形态1000×，(c)压缩形态500×，(d)压缩形态1000×，(e)回复形态500×，(f)回复形态1000×；

图11为pfoe-24h支架形状回复过程示意图；其中，(a)pfoe多孔支架初始形态，(b)pfoe多孔支架压缩后的临时形态，(c)pfoe多孔支架在水中回复10s，(d)pfoe多孔支架在水中回复30s，(e)pfoe多孔支架在水中回复1min，(f)pfoe多孔支架在水中回复2min，(g)pfoe多孔支架在水中回复3min，(h)pfoe多孔支架在水中回复5min；

图12为pfoe支架在37℃下pbs中降解4周后的sem照片；其中，(a)200×，(b)500×，(c)1000×。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)原料纯化

富马酸重结晶：称取待纯化的富马酸60g置于烧瓶中，加入转子，烧瓶上端接入冷凝回流装置，升温至80℃。逐渐加入蒸馏水，直至富马酸全部溶解，溶液澄清。停止搅拌，倒出溶液，室温下冷却，待结晶析出后进行抽滤。重复上述步骤三次，将产物在60℃真空烘箱中干燥24h。

(2)pfoe的合成

50ml茄型瓶无水无氧处理，加入搅拌子，移至到手套箱内。在手套箱中往茄型瓶内加入1.1456g(9.870mmol)的富马酸，加入1.4114g(9.925mmol)的1,2,7,8-二环氧辛烷和20mg(0.682mmol)四丁基溴化铵，接着加入2.5ml的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)，将瓶口密封移出手套箱。将茄型瓶置于预先搭好的油浴装置上，油浴温度90℃，转子搅拌速度1000r/min，反应9h。产物在乙醚中洗涤一次，产物在乙醚中沉淀出来后除去蒸馏水后用四氢呋喃(thf)将产物溶解，用乙醚继续洗涤2次。产物在室温下挥发掉乙醚，之后冷冻干燥48h，得到淡黄色pfoe固体产物920.6mg，产率36％。

(3)结构表征

pfoe的¹hnmr谱图如图1，‘a’(δ＝6.66-6.87ppm)的信号峰为pfoe富马酸部分的双肩上的羟基(oh)的质子信号，‘b’(δ＝4.74-5.05ppm)，‘c’(δ＝3.90-4.11ppm)为环氧开环后和富马酸相邻的亚甲基上的质子信号峰，‘d’(δ＝3.54-3.72ppm)为环氧开环后生成的羟基相邻的次甲基(ch)上的质子信号峰，‘e’(δ＝1.47-1.69ppm)环氧开环生产的羟基(oh)的质子信号峰，‘f’(δ＝1.13-1.46ppm)为pfoe环氧部分的亚甲基(ch2)的质子信号峰。从核磁谱图上可以证实pfoe的结构和我们预先设计的结构相同。

通过pfoe的红外光谱图(图2)，可以明显的看到在3400cm^-1处出现了—oh峰，2900cm^-1处出现了—c—h伸缩振动峰；1700cm^-1处出现了—c＝o伸缩振动峰；1290cm^-1处为—co—o的伸缩振动峰，1160cm^-1处为o—c—c的伸缩振动峰，1700cm^-1，1290cm^-1，1160cm^-1处均为酯键的特征峰，可以表明分子链上有酯键的存在。通过这些明显的特征峰进一步证实了pfoe的结构。

(4)性能表征

从图3可以看出，第一天的时候pfoe和tcps，plga一样，都可以使心肌细胞在材料表面进行良好的贴附并生长，从第三天的细胞增殖照片可以看出细胞在材料表面也可以明显的增殖。

心肌细胞在pfoe表面的增殖能力通过mtt分析(图4)进行评价。在接种1，3，7天后，pfoe上心肌细胞的数量显著增加，并且相比于plga和tcps同样能够促进心肌细胞的粘附和增殖。表明pfoe与心肌细胞相容性较好，能够促进心肌细胞的粘附和增殖。

实施例2

(1)pfoe多孔支架的制备

将氯化钠放在真空烘箱中50℃抽真空6h除去水分，将干燥后的氯化钠晶体用粉碎机磨碎，用筛网筛取直径在75-150μm的盐粒备用。将2.5ml的通用注射器切去顶部注射头，切口处保持平整，制成圆柱形模具备用。将75-150μm的氯化钠盐粒填进注射器内，压实后高度约1cm左右，转移至温度为37℃，相对湿度为85％的恒温恒湿箱内放置1.5h。然后取出置于120℃的真空烘箱中真空干燥1h，出去水分，制成盐模。将pfoe用四氢呋喃配置成100mg/ml的溶液，每个盐膜中缓慢滴加0.5ml的pfoe溶液，为保证溶液能够充分浸入盐膜中，需从多个方向向盐模中滴加溶液，待溶剂挥发后，放入真空烘箱中150℃交联反应，每隔12h，24h，36h，48h取出一批盐模。交联好的盐模取出后放入蒸馏水中溶解掉氯化钠，每隔6h换一次水，用agno3检测水中是否含有cl离子，直至盐模中的氯化钠完全溶解。溶解掉氯化钠的支架冷冻干燥48h得到多孔的组织工程支架，密封保存备用。

(2)结构表征

从不同交联时间的pfoe多孔支架的红外谱图(图5)可以看出交联过后的pfoe支架相比于纯的pfoe结构上并没有太大差别，只是3400cm^-1处的-oh峰随着交联时间的增加在不断减小。说明交联过程中大量的-oh被反应掉了。

(3)热学性能表征

作为组织工程支架期望pfoe支架具有良好的热学稳定性，通过tga数据(图6)可以看出交联过后的pfoe支架在不同交联时间下热分解温度没有太大差别，都是在250℃左右，因此不同交联时间的支架都具有良好的热学稳定性。

从dsc曲线(图7)可以看出，不同交联时间的pfoe支架的玻璃化转变温度(tg)都大于70℃，因此室温下pfoe支架都处于玻璃态，另外在测试温度范围内(-50℃-150℃)内没有观察到明显的结晶峰和熔融峰，说明支架在室温下没有发生明显的结晶现象。且随着交联时间的增加pfoe支架的玻璃化转变温度tg也在增加，因为分子间存在化学交联时，链段活动能力下降，tg升高，交联点密度愈高，tg增加越多。但是交联程度越大材料就会表现的越脆，因此在制备支架时，交联程度也是一个影响材料性能的重要因素。

(4)力学性能表征

pfoe支架的力学性能通过对直径8.5mm，高度9mm的多孔的压缩获得。图8是对不同交联时间的pfoe支架在干态下压缩的曲线，以1mm/min的速度压缩至应变40％，从曲线中可以看出，12h的支架最大压缩应力接近0.23kpa，压缩模量为0.85kpa；24h的支架最大压缩应力3.76kpa，压缩模量为12.26kpa；36h的支架最大压缩应力为5.06kpa，压缩模量为21.96kpa；48h的支架最大压缩应力为8.54kpa，压缩模量为38.50kpa。从图中可以看出交联24h的支架力学性能非常差，因为交联程度太低，不足以撑起整个支架，所以力学较弱。随着交联时间的加长，交联程度的增加支架的压缩应力和压缩模量也在不断增加，交联48h后支架的压缩应力达到了8.54kpa，力学性能得到了很大的加强。

然后进行了循环压缩实验，首先将支架浸泡在水中完全湿润，接着以1mm/min的速度首先压缩至应变40％，然后再以同样的速度使其回弹至应变5％，再压缩至40％，循环5个来回。从压缩曲线(图9a-c)可以看出支架在湿态下具有良好的弹性，尤其是交联24h后的支架，多次循环的曲线几乎重合，说明支架的抗压回弹性较好，多次压缩后弹性依然很好。但是交联了12h的支架由于交联程度较低，当浸泡在水中的时候会黏到一起，且容易破损，无法保持初始的形状故无法进行循环压缩测试。

通过对支架干燥状态下的力学测试和湿态下的循环压缩测试我们发现干燥状态下的支架处于玻璃态，支架较脆，在单次压缩后无法回复。而在湿态下的支架由于受到了水的增塑作用，tg降到室温以下，处于高弹态，能够进行循环压缩。这也从证明了我们的支架具有水响应形状记忆的效果。

最后，综合支架的力学性能和亲水性，交联24h的支架具有最佳的综合性能。在干燥状态下力学性能也不弱，可以很好的保持初始的形态，且在水中的弹性也非常好。同时交联了24h的支架亲水性相比于36h和48h的支架也更加亲水，因此在水中更容易回复。所以选取了交联24h小时的支架进行了接下来的测试。

(5)孔隙率及微观结构的表征

由孔隙率计算公式可以得出pfoe支架的孔隙率为92.99％，(其中ρpfoe为0.9556g/ml，ρd为0.067g/ml)，由此可以证明制备的支架确实为多孔结构，可以说整个支架就是由各种连同的孔构成的。选取了交联了24h综合性能较好的支架进行了测试。

pfoe支架的形态由环境扫描电子显微镜在对样品喷金的情况下测试得出。从sem图片(图10)可以看出支架表面含有大量的孔洞结构，孔洞的最大尺寸与所用的盐粒(75μm-150μm)相吻合。(a)，(b)为放大500倍和1000倍的sem照片，可以清晰的看出支架内部大部分是孔洞结构，同时大孔的内壁上还含有许多小孔，这是由于溶剂挥发导致的相分离生成的孔，这都证实了pfoe支架的高孔隙率，同时支架表面大量的孔利于细胞的粘附。(a)是放大500倍的sem照片，可以看到一个单独的大的孔洞，能清楚的看到孔洞里面有一些较小的孔洞与下一个孔洞相连接，说明支架不仅多孔，而且每个孔洞之间相互连通。使细胞可以从外面向里面的孔洞里增殖。

图10中(c)和(d)分别为pfoe多孔支架压缩到临时形状后的微观结构图，从图中可以明显看出相比于初始形态的pfoe支架，压缩后的支架尽管在多孔结构上没有太多变化，但是(d)1000倍的照片中盐孔明显被压扁，这也从另一方面证明pfoe支架能够保持住临时形状。(e)和(f)为pfoe在水中回复后冷冻干燥后拍得的sem照片，(e)为500倍，(f)为1000倍。从图中可以看出盐孔结构很好的回复回来，并且保持了形变前的多孔结构。这一系列的sem照片从另一方面完美的验证了pfoe的形状回复效果。

(6)溶胀率及形状回复效果的表征

同样是选取交联24h综合性能较好的支架进行实验，根据公式

可以算出pfoe多孔支架的质量溶胀率可以达到1071％，体积溶胀率105％。因为pfoe支架的孔隙率特别大，整个支架能够吸收大量的水分，使得质量能够达到原来的10倍左右，但是pfoe多孔支架的形状回复率在100％左右，因此体积溶胀的程度没有太大变化。同时也可以说明所制备的pfoe支架的形状回复不是因为在水中材料被胀大而导致的。

pfoe多孔支架能在水中具有形状回复的效果，通过图11可以看出初始的时候(图11a)支架长度约为9mm，压缩过后(图11b)的长度约为3mm。当润湿过后10s中内便有了明显回复，1分钟内就伸长到了5mm，pfoe支架在五分钟后可以完全回复到初始形状。

(7)体外降解性能表征

如图12所示，利用扫描电子显微镜(sem)对降解了四周后的支架进行了观察。从放大200倍的照片可以看出支架的整体结构依然保持了连通的孔道结构，但是很多地方已经降解，从放大500倍的照片可以看出已经没有完好的盐孔结构存在，大部分盐孔都被破坏，从放大1000倍的照片可以明显看出，盐孔的孔壁都已降解。由此可以看出pfoe具有很好的降解性能且在降解期间依然能够保持良好的多孔结构，为细胞生长提供良好的环境。