酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器及其制备方法与流程

本发明属于材料技术领域，涉及酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器及其制备方法。

背景技术：

随着人类工作生活方式的改变，出现环境恶化与食品安全等问题，全球患癌人数已超1400万。目前治疗癌症的方法主要有外科手术、放疗、生物疗法、化疗等。每种方法都各有优缺点，临床中一般会相互配合治疗。其中外科手术法理论上可以痊愈，但对人体创伤极大。放疗是使用辐射线杀死癌细胞，缩小肿瘤，但放射线也会破坏正常细胞，使人体淋巴细胞数量和活性降低。生物疗法相对副作用小，但一般用于辅助治疗。以上三种方法属于局部治疗，只对治疗部位的肿瘤有效，对于潜在的转移病灶和已经发生临床转移的癌症就难以发挥有效治疗。而化学疗法是一种全身治疗的手段，无论采用什么途径给药，化疗药物都会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官和组织。因此它最主要的缺点是没有专一性，在杀伤恶性细胞的同时，也会杀死正常组织细胞。

为了解决上述问题，可以选择性释放药物的智能纳米容器应运而生。现阶段的纳米容器如ph-刺激响应型智能纳米容器(wang,t.,etal.(2014).chemicalcommunications,50(83),12469-12472.)、酶刺激响应型智能纳米容器均是单重响应，刺激源响应时间长，过程繁琐复杂，灵敏度低，应用范围具有局限性，限制了纳米容器在生物医学领域的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、生物相容性好、可重复利用的酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器及其制备方法。

实现本发明目的的技术解决方案为：

酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器，其分子结构如下：

其中，介孔二氧化硅微球通过酯链连接苯并咪唑基团修饰的环糊精分子，罗丹明或吉西他滨经吸附贮存在介孔二氧化硅微球内部。

酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器的制备方法，通过对介孔二氧化硅微球以及环糊精分子进行表面改性，使其具有释放酸性及酶双重刺激响应特性，从而释放药物分子，具体步骤如下：

步骤1，将介孔二氧化硅微球与硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到无水甲苯中，加热回流，进行无水无氧缩醇反应，得到表面氨基化的介孔二氧化硅微球msns-nh2；

步骤2，将msns-nh2与丁二酸酐、三乙胺加入到二甲基亚砜中，30～50℃下进行反应，得到羧基化的介孔二氧化硅微球msns-cooh；

步骤3，将msns-cooh与2-(2-丙炔氧基)乙醇、n，n-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入到二甲亚砜中，35～45℃下反应24～36h，得到炔基化的介孔二氧化硅微球msns-alkyne；

步骤4，将2-o-单炔丙基-β-环糊精和1h-咪唑-1-磺酰叠氮溶于无水n,n-二甲基甲酰胺中，在亚磷酸三乙酯碘化亚铜催化下进行点击反应，得到2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-β-环糊精；

步骤5，在三苯基膦的催化下，将2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-β-环糊精与碘加入到无水n,n-二甲基甲酰胺中，70～90℃下反应18～20h，得到2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-碘-6-脱氧-β-环糊精；

步骤6，将2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-碘-6-脱氧-β-环糊精与叠氮化钠溶于无水n,n-二甲基甲酰胺中，70～90℃搅拌反应18～20h，得到2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-叠氮-6-脱氧-β-环糊精；

步骤7，将2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-叠氮-6-脱氧-β-环糊精、msns-alkyne、无水硫酸铜和抗坏血酸钠溶于n,n-二甲基甲酰胺中，产物用水洗后得到智能纳米容器msns-cd；

步骤8，将真空干燥后的msns-cd分散在含有吸附分子的ph＝1的盐酸溶液中，吸附结束后，调节ph至中性，得到酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器。

优选地，步骤1中，所述的介孔二氧化硅微球为mcm-41。

优选地，步骤1中，所述的介孔二氧化硅微球与硅烷偶联剂的摩尔比为1:1～1.2:1。

优选地，步骤8中，所述的吸附分子为罗丹明或吉西他滨。

与现有技术相比，本发明利用酸性与脂肪酶双重刺激感应，提高了纳米容器的敏感性及应用范围。

附图说明

图1为酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器的装配图。

图2为酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器脂肪酶刺激下罗丹明的释放图。

图3为酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器酸刺激下吉西他滨的释放图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，对本发明做进一步详细说明。

本发明的原理是：如图1所示组装结构，在脂肪酶或者酸性条件刺激响应下，连接环糊精分子与二氧化硅球的化学键酯键断裂，环糊精抛离，药物分子释放。

实施例1

酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器的制备方法，步骤如下：

1.制备介孔二氧化硅微球mcm-41

将十六烷基三甲基溴化铵(ctab，0.5g)，naoh溶液(2mol/l，1.75ml)与h2o(240ml)混合，80℃下搅拌30min。逐滴加入正硅酸乙酯(teos，2.5ml)，充分搅拌10min后形成白色沉淀。80℃下搅拌2h，趁热过滤，用水和甲醇充分清洗产物，90℃下真空干燥。

称取0.3g干燥固体，超声分散于异丙醇(60ml)和浓盐酸(3ml)的混合溶液，加热回流6h，离心分离，用水和甲醇充分清洗，90℃下真空干燥得到介孔二氧化硅微球(mcm-41)。

2.介孔二氧化硅的表面修饰

将干燥后的mcm-41(200mg)超声分散在无水甲苯(10ml)中，逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes，100ul)，加热回流，搅拌反应24h，反应结束后固体粉末通过离心收集并用无水甲苯和甲醇各洗2次。80℃烘干过夜得白色粉末msns-nh2。

取msns-nh2(180mg)分散在二甲亚砜(dmso，10ml)，加入丁二酸酐(0.08g)，三乙胺(0.08g)，在40℃条件下反应48小时，反应结束后固体粉末通过离心收集并用乙醇和甲醇各洗2次，干燥过夜得白色粉末msns-cooh。

取msns-cooh(100mg)分散于二甲基亚砜(90ml)加入2-(2-丙炔氧基)乙醇(0.184g)，n，n-二异丙基碳二亚胺(0.24g)，4-二甲氨基吡啶(0.24g)，在40℃条件下反应24小时，反应结束后固体粉末通过离心收集并依次用水、甲醇、氯仿、水清洗，干燥过夜得白色粉末msns-alkyne。

3.制备基于环糊精的纳米阀门

制备2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-β-环糊精：将2-(o-炔丙基)-β-环糊精(300mg)和1h-咪唑-1-磺酰叠氮(100mg)溶于无水n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中，加入少量催化剂亚磷酸三乙酯碘化亚铜，反应温度90～120℃，反应时间为3-5小时。

制备2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-碘-6-脱氧-β-环糊精：在三苯基膦(8.8mmol)的催化下，2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-β-环糊精(0.44mmol)与碘(8.8mmol)于无水n,n-二甲基甲酰胺(9ml)中70～90℃反应18～20小时得到产物。

制备2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-叠氮-6-脱氧-β-环糊精：2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-碘-6-脱氧-β-环糊精(0.157mmol)与叠氮化钠(1.538mmol)溶于无水n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中，氮气保护下70～90℃搅拌反应18～20小时得到。

4.组装智能纳米容器

将2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-叠氮-6-脱氧-β-环糊精(25mg)、msns-alkyne(30mg)、无水硫酸铜(130mg)、和抗坏血酸钠(201.5mg)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，常温下搅拌72小时，反应结束后固体粉末通过离心收集并用水洗到基本无色，得到msns-cd。

取msns-cd(50mg)分散在饱和罗丹明b的盐酸溶液(ph＝1)中，室温下吸附搅拌48h，吸附结束后加入氢氧化钠溶液将ph调至中性得到酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器msnps1。

5.智能纳米容器的可控性释放

在石英比色皿中加入含脂肪酶(1mg/ml)的缓冲溶液3.8ml，称取2.0mgmsnps1置于折成锥形的已活化的半透膜中，将半透膜尖端朝下放入比色皿中，确保所有msnps1都浸于缓冲溶液液面以下，利用紫外分光光度计测其动力学变化，如图2所示，释放量达到86.2％。

实施例2

酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器的制备方法，步骤如下：

1.制备介孔二氧化硅微球mcm-41

将十六烷基三甲基溴化铵(ctab，0.5g)，naoh溶液(2mol/l，1.75ml)与h2o(240ml)混合，80℃下搅拌30min。逐滴加入正硅酸乙酯(teos，2.5ml)，充分搅拌10min后形成白色沉淀。80℃下搅拌2h，趁热过滤，用水和甲醇充分清洗产物，90℃下真空干燥。

称取0.3g干燥固体，超声分散于异丙醇(60ml)和浓盐酸(3ml)的混合溶液，加热回流6h，离心分离，用水和甲醇充分清洗，90℃下真空干燥得到介孔二氧化硅微球(mcm-41)。

2.介孔二氧化硅的表面修饰

将干燥后的mcm-41(200mg)超声分散在无水甲苯(10ml)中，逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes，100ul)，加热回流，搅拌反应24h，反应结束后固体粉末通过离心收集并用无水甲苯和甲醇各洗2次。80℃烘干过夜得白色粉末msns-nh2。

取msns-nh2(180mg)分散在二甲亚砜(dmso，10ml)，加入丁二酸酐(0.08g)，三乙胺(0.08g)，在40℃条件下反应48小时，反应结束后固体粉末通过离心收集并用乙醇和甲醇各洗2次，干燥过夜得白色粉末msns-cooh。

取msns-cooh(100mg)分散于二甲基亚砜(90ml)加入2-(2-丙炔氧基)乙醇(0.184g)，n，n-二异丙基碳二亚胺(0.24g)，4-二甲氨基吡啶(0.24g)，在40℃条件下反应24小时，反应结束后固体粉末通过离心收集并依次用水、甲醇、氯仿、水清洗，干燥过夜得白色粉末msns-alkyne。

3.制备基于环糊精的纳米阀门

制备2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-β-环糊精：将2-(o-炔丙基)-β-环糊精(300mg)和1h-咪唑-1-磺酰叠氮(100mg)溶于无水n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中，加入少量催化剂亚磷酸三乙酯碘化亚铜，反应温度90～120℃，反应时间为3-5小时。

制备2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-碘-6-脱氧-β-环糊精：在三苯基膦(8.8mmol)的催化下，2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-β-环糊精(0.44mmol)与碘(8.8mmol)于无水n,n-二甲基甲酰胺(9ml)中70～90℃反应18～20小时得到产物。

制备2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-叠氮-6-脱氧-β-环糊精：2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-碘-6-脱氧-β-环糊精(0.157mmol)与叠氮化钠(1.538mmol)溶于无水n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中，氮气保护下70～90℃搅拌反应18～20小时得到。

4.组装智能纳米容器

将2-o-单{1-(1h-咪唑-1-磺酰)-1h-[1,2,3]三唑-4-亚甲基}-七-6-叠氮-6-脱氧-β-环糊精(25mg)、msns-alkyne(30mg)、无水硫酸铜(130mg)、和抗坏血酸钠(201.5mg)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，常温下搅拌72小时，反应结束后固体粉末通过离心收集并用水洗到基本无色，得到msns-cd。

取msns-cd(50mg)分散在饱和吉西他滨的盐酸溶液(ph＝1)中，室温下吸附搅拌48h，吸附结束后加入氢氧化钠溶液将ph调至中性得到酸性及脂肪酶双重敏感纳米容器msnps2。

5.智能纳米容器的可控性释放

在石英比色皿中加入ph＝3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液3.8ml，称取2.0mgmsnps2置于折成锥形的已活化的半透膜中，将半透膜尖端朝下放入比色皿中，确保所有msnps2都浸于缓冲溶液液面以下，利用紫外分光光度计测其动力学变化，如附图3所示，释放量达到69.26％。