白术在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用及药物的制作方法

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种白术在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用及药物。
背景技术：
：白术(rhizomaatractylodismacroephalae)为菊科(compositae)植物，白术甘苦温无毒，固表止汗消五谷。胎动不安治痰湿，脾虚泄泻皆能服。白术的作用主要有镇静、血管扩张、抗血凝、抗胃溃疡、保肝利胆、利尿、强壮、提高免疫、抗氧化、抗菌等。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种白术在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用及药物，其旨在改善现有的骨髓间充质干细胞增殖活性弱，扩增速度慢的问题。本发明提供一种技术方案：白术在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用。进一步地，上述白术的水煎剂在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用。进一步地，上述白术的水提醇沉物在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用。进一步地，上述白术的水提醇沉物通过以下步骤制得：将质量比为1:18-22的白术与水回流提取，采用乙醇将回流提取后的体系于4-6℃下醇沉。本发明还提供一种技术方案：一种用于促进骨髓间充质干细胞增殖的药物，其原料包括白术。进一步地，上述药物包括白术的水提醇沉物、骨髓间充质干细胞。进一步地，上述白术的水提醇沉物通过以下步骤制得：将质量比为1:18-22的白术与水回流提取，采用乙醇将回流提取后的体系于4-6℃下醇沉。进一步地，上述采用乙醇将回流提取后的体系进行醇沉，乙醇于体系内的体积分数为88-92％，将醇沉后的液体采用正丁醇萃取。进一步地，上述骨髓间充质干细胞以静脉注射的方式给药。进一步地，上述白术的水提醇沉物的给药方式为口服。本发明提供的白术在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用及药物的有益效果是：白术、白术水煎剂或者白术水提醇沉物能够促进骨髓间充质干细胞在培养过程的增殖，提升骨髓间充质干细胞的增殖能力，为临床需求提供一种新的实现方法。此外，本发明提供的药物，包括白术水提醇沉物以及bmscs，对结肠粘膜损伤具有修复作用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1示出了第三代bmscs生长曲线；图2示出了第三代bmscs流式细胞仪表型鉴定。具体实施方式骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemceils，bmsc)是骨髓中的一类干细胞，可在适当的诱导剂刺激下在体内外分化成多种类型的细胞，具有取材方便、体外培养容易、易于诱导等特点。但是，骨髓中bmscs含量极少，仅占骨髓单核细胞的0.001％～0.010％，并且干细胞归巢数量少，在损伤区分化和生存率低，长期增殖活性弱，扩增速度慢，逐渐向脂肪老化，无法满足大量的临床需求。通过发明人的实验研究发现，白术能够促进骨髓间充质干细胞的增殖。为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的白术在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用及药物进行具体说明。白术在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用。骨髓间充质干细胞存在于骨髓基质中，可以作为组织工程的种子细胞，研究bmcss体外分离、培养和扩增的方法，可以为组织工程技术奠定良好基础，以便于进一步应用bmscs。发明人的实验发现白术能够促进bmscs的增殖。进一步地，上述白术的水煎剂在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用。具体地，白术的水煎剂通过以下步骤制得：白术加适量水，浸泡40min，武火(温度110℃-140℃)至水开，再用文火(温度90℃-100℃)煎煮30min，取水煎液，共煎煮两次。两次水煎液混合、过滤，“去滓再煎”浓缩至含生药0.1g/ml，灭菌密封4℃保存备用。在本发明较佳的实施例中，白术的水提醇沉物在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能并且分化组织具有良好可移植性，另外间充质干细胞还具有造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。骨髓间充质干细胞的这些特性，其被越来越多的应用于临床多种疾病的治疗。所以，发明人发现白术能够促进bmscs的增殖，所以白术的水提醇沉物或者含有白术的药物可以促进bmscs的增殖，可以将增殖后的bmscs用于制备治疗多种疾病的药物。例如骨科疾病、肺部疾病、肝脏疾病、神经系统损伤等多种疾病。进一步地，上述白术的水提醇沉物通过以下步骤制得：将质量比为1:18-22的白术与水回流提取，采用乙醇将回流提取后的体系于4-6℃下醇沉。具体地，在制备过程中，取白术及水以料液质量比为1:20，蒸馏水回流加热提取4h，过滤，溶液经过旋转蒸发器旋转蒸发至体积约80ml，边搅拌边加入3倍体积的95％乙醇，调整乙醇浓度为90％，于4℃下静置12小时醇沉，抽滤。进一步地，在其他实施例中，取白术及水以料液质量比为1:20，蒸馏水回流加热提取4h，过滤，溶液经过旋转蒸发器旋转蒸发至体积约80ml，采用正丁醇萃取，取正丁醇部分。发明人发现白术的水提醇沉物的醇提物中多糖的含量更高，对bmscs细胞增殖的作用更为显著。进一步地，培养液中上述白术的水提醇沉物的浓度为125mg/ml、62.5mg/ml时，对bmscs作用24小时后，细胞增殖显著，具有统计学差异。本发明还提供一种技术方案：一种用于促进骨髓间充质干细胞增殖的药物，其原料包括白术。进一步地，上述药物包括白术的水提醇沉物、骨髓间充质干细胞。进一步地，上述白术的水提醇沉物通过以下步骤制得：将质量比为1:18-22的白术与水回流提取，采用乙醇将回流提取后的体系于4-6℃下醇沉。进一步地，上述采用乙醇将回流提取后的体系进行醇沉，乙醇于体系内的体积分数为88-92％，将醇沉后的液体采用正丁醇萃取。进一步地，上述骨髓间充质干细胞以静脉注射的方式给药。通常bmscs的移植方式有两种，即局部移植和外周静脉移植。局部腹腔途径移植方法操作简单，创伤性小，对干细胞基本无丢失，可以移植足够数量的干细胞，但是其主要缺点是腹腔内微环境复杂，且细胞植入起始环境差，细胞活力会受到很大影响，干细胞很难存活。外周静脉移植主要是尾静脉注射移植，移植后通过血液循环途径到达受损部位定植，此种方法难度不大，方便可行，然而细胞的静脉注射属于全身给药，经静脉先入体循环，后入肺循环，更有利于干细胞的存活和迁移。进一步地，上述白术的水提醇沉物的给药方式为口服。在本发明的其他实施例中，白术的水提醇沉物的给药剂型可以为多种，例如片剂、胶囊、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂等。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供了一种药物，该药物由以下制备方法制得：取40g白术、800ml蒸馏水(料液比1:20)，蒸馏水回流加热提取4h，过滤，溶液经过旋转蒸发器旋转蒸发至体积约80ml，边搅拌边加入3倍体积的95％乙醇，调整乙醇浓度为90％，于4℃下静置12小时醇沉，抽滤干燥。实施例2本实施例提供了一种药物，该药物由以下制备方法制得：取30g白术，先用450g的蒸馏水浸泡30min，然后置煎煮容器中，文火煎煮2h，过滤，滤渣再用10倍的蒸馏水文火煎煮2h，合并煎液，浓缩为300ml，相当于原生药材0.1g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱保存备用。实施例3本实施例提供了一种药物，该药物由以下制备方法制得：取40g白术、720ml蒸馏水(料液比1:18)，蒸馏水回流加热提取4h，过滤，溶液经过旋转蒸发器旋转蒸发至体积约80ml，采用正丁醇对浓缩后的溶液进行萃取，取萃取部分。实施例4本实施例提供了一种药物，该药物由以下制备方法制得：取40g白术、880ml蒸馏水(料液比1:22)，蒸馏水回流加热提取4h，过滤，溶液经过旋转蒸发器旋转蒸发至体积约80ml，边搅拌边加入3倍体积的95％乙醇，调整乙醇浓度为92％，于6℃下静置12小时醇沉，抽滤干燥。实施例5本实施例提供了一种药物，该药物由以下制备方法制得：取40g白术、560ml蒸馏水(料液比1:22)，浸泡40min，武火至水开，再用文火煎煮30min，取水煎液，共煎煮两次。两次水煎液混合、过滤、“去滓再煎”浓缩至含生药0.1g/ml。试验例1试验例1对实施例1制备得到的药物以及实施例2制备得到的药物进行实验，具体地，对bmscs细胞增殖的影响进行实验。应用cck8检测不同浓度实施例1制备得到的药物(白术水提醇沉提取物)、实施例2制备得到的药物(白术水煎剂)对bmscs细胞增殖的作用。96孔细胞培养板接种第4代bmscs1000个/100μl培养基/孔，在培养箱中预培养12小时(37℃，5％co2)，向每孔中加入10μl不同浓度实施例1制备得到的药物(终1000、500、250、125、62.5、0mg/ml)；不同浓度实施例2制备得到的药物(终1000、500、250、125、62.5、0mg/ml)；每个浓度设4个复孔，在培养箱中孵育24小时，每孔加入10μlcck-8，培养箱中孵育2小时，酶标仪测定450nm处的吸光度。检测结果如表1所示：表1药物对bmscs细胞增殖的作用注：与空白组比较*p<0.05。通过表1可知，实施例1制备得到的药物以及实施例2制备得到的药物对bmscs细胞增殖具有作用，进一步地，在相同浓度下，实施例1制备得到的药物对bmscs细胞增殖的效果佳于实施例2制备得到的药物。此外，与空白对照组比较，125、62.5mg/ml的实施例1制备得到的药物对bmscs作用24小时后，细胞增殖显著，具有统计学差异。试验例2试验例2对实施例1制备得到的药物对bmscs细胞增殖进行实验。实验动物：健康清洁级sd大鼠，雌雄不限；3—4周龄，体重约50g，用于原代bmscs取材；7-8周龄，体重约200g，用于制作uc(溃疡性结肠炎)动物模型，均由山东中医药大学实验动物中心提供。bmscs的分离培养：大鼠脱颈椎处死，无菌分离双下肢股骨及胫骨，暴露骨髓腔，用含10％胎牛血清的l-dmem反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液接种于培养瓶中，置于37℃，体积分数为5％co2、饱和湿度培养箱中培养。24h半量换液，72h全量换液，细胞贴壁后每2d换液一次。细胞80％-90％融合时用0.25％胰酶edta37℃消化，1：2比例传代。bmscs的表型鉴定(cd45、cd90)：取融合至90％左右生长状态良好第3代bmscs消化，以每管5×105个细胞收集于流式管中，70％乙醇固定，pbs洗涤后，分别加入1：500荧光标记抗体pe-cy5cd45、pecd90及同型对照，避光孵育30分钟，pbs洗涤3次重悬后上机检验。bmscs生长曲线绘制：取生长状态良好的第三代bmscs，0.25％胰酶消化后制备成细胞悬液，根据细胞计数结果以每孔细胞浓度为1×104/l接种于96孔板各孔，每孔0.1ml，置于37℃，5％co2饱和湿度下常规培养。于培养第24h起，每隔24h取12孔加入10μlcck-8溶液，37℃下孵育2小时，酶标仪测定450nm处的od值。连续8天，以培养时间为横轴，od值为纵坐标绘制细胞生长曲线。第三代bmscs生长曲线如图1所示。bmscs的cm-dil标记：以1mlpbs重悬第三代bmscs1×109-1×1010个，加入1g/lcm-dil(50μldmso溶解50μgcm-dil)5μl，37℃、5％co2、饱和湿度恒温培养箱中孵育5min，4℃冰箱放置15min，pbs清洗2次，去除未结合cm-dil。置倒置荧光显微镜计数cm-dil阳性细胞数及细胞总数，计算标记率。标记率＝视野内阳性细胞总数/视野内细胞总数×100％。最后以5×106个bmscs/mlpbs重悬细胞，用于尾静脉注射移植。动物分组及造模：将60只健康的sf级sd大鼠随机分为分为6组，分别为空白组、模型组、bmscs1周组、bmscs2周组，bmscs药物1周组，bmscs药物2周组，每组10只大鼠。造模前大鼠禁食不禁水24h，称重。模型组采用等体积tnbs/50％乙醇溶液局部灌肠建立uc大鼠模型，5％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，依据0.2mltnbs/100g大鼠给予等体积tnbs/50％乙醇溶液局部灌肠，后将大鼠提尾倒置3min，使药液充分浸润结肠，将大鼠放入笼中待其自然苏醒；正常组则给予同体积的生理盐水相对照。bmscs移植、大鼠灌胃：造模第2天，按照5×106个cm-dil阳性bmscs/只大鼠，尾静脉注射移植入以下四组大鼠：bmscs1周组、bmscs2周组、bmscs药物1周组(bmscs+实施例1提供的药物(以下简称药物))、bmscs药物2周组。bmscs药物1周组、bmscs药物2周组分别给予药物灌胃1周和2周，空白组、模型组、bmscs1周组、bmscs2周组给予等体积的生理盐水灌胃，每天用药一次，观察记录大鼠的症状和体征，记录体重。组织取材及指标检测：治疗结束后将各组大鼠腹腔注射5％水合氯醛麻醉，无菌腹主动脉取血，离心收集血清，按照elisa试剂盒步骤测il-6、il-17a、il-10、tgf-β水平。取结肠组织，纵行剖开，冰生理盐水冲洗干净，置冰上肉观察结肠组织病理改变情况并作结肠粘膜损伤指数(cmdi)评分，评分标准见表2。取结肠的溃疡和非溃疡部制成15μm恒冷切片，每隔10张取一张，溃疡和非溃疡部分别取10张，荧光显微下观察，并于每张切片上随机取4个高倍镜视野，计数每个视野cm-dil阳性细胞数，求均值。相同切片再经he染色，做结肠组织学评分(hs)，评分标准见表3。表2结肠粘膜损伤指数cmdi评分标准表3结肠组织病理学(hs)评分标准评分(分)组织病理学变化0无损伤1黏膜充血、水肿、未出现溃疡2黏膜充血、水肿、轻度糜烂，无溃疡3黏膜充血、水肿、中度糜烂，有单个溃疡4黏膜充血、水肿、高度糜烂，有多处溃疡5黏膜充血、水肿、高度糜烂，有>1cm溃疡统计学方法：由spss19.0处理，计量资料多组间采用单因素方差分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，lsd方法检验；计数资料用秩和检验；p＜0.05为差异具有统计学意义。实验结果bmscs体外扩增、鉴定及标记倒置相差显微镜下，接种的全骨髓血细胞呈圆形，单个分布，透亮，漂浮，折光性强。24h半量换液后，部分细胞贴壁变形。72h首次全量换液，可见数量较多的多角形贴壁细胞。4-5d细胞可达到80％融合，传代后细胞呈均一的梭形漩涡状排列。cm-dil标记0h橙黄色圆形悬浮状，标记24小时后贴壁，生长良好。图2示出了第三代bmscs流式细胞仪表型鉴定，从图2可知，流式细胞仪检测显示生长良好的第三代细胞表达cd90，阳性率为94.05％；而cd45表达率为2.26％。经培养至第三代的细胞1d内处于潜伏期，生长缓慢，2～4天处于对数生长期，5～7天进入平台期，细胞基本铺满瓶底，生长缓慢。与模型组大鼠相比bmscs1周组、bmscs模型2周组，bmscs药物1周组，bmscs药物2周组大鼠粘液便和脓血便逐渐减少，饮水饮食量逐渐增加，活动增多，毛发光泽度提高，体重逐渐增加。其中bmscs药物2周组大鼠生活状态、体重恢复优于其它实验组。详见表4。表4大鼠体质量周期变化统计表(单位：g/只)(＊与空白组相比，p<0.01；#与模型组相比，p<0.05。)肉眼对各组大鼠结肠大体形态进行观察，正常组大鼠结肠外壁与周围组织无黏连，肠壁表面光滑，纹理清晰，无炎性水肿及渗出增生。模型组结肠与周围组织黏连严重，肠管变粗，肠壁增厚，可见糜烂及溃疡形成。sasp组、bmscs药物1周组、bmscs药物2周组、bmscs模型组1周组、bmscs模型2周组大鼠结肠大体形态较模型组均可见不同程度的减轻。其中bmscs药物2周组减轻程度最为明显。显微镜下对各组大鼠结肠大体形态进行观察，正常组黏膜上皮结构清晰完整、黏膜无充血水肿、无炎性细胞浸润、无糜烂、溃疡形成；黏膜下层宽窄适度亦无隐窝脓肿；结肠肠壁未见增厚，细胞间连接紧密，腺体排列整齐，血管形态清晰，结构正常，肌层整齐连续。模型组黏膜呈明显非特异性炎症，黏膜表层有大量上皮细胞脱落，结肠组织水肿、充血、缺损，腺体组织结构破坏，黏膜和固有层见大量炎性细胞浸润，部分浸润全层，以中性粒细胞、淋巴细胞为主。与模型组相比，干细胞组、药物1周组干细胞和药物2周组干细胞炎细胞浸润程度有所减轻，可见修复的大小不一腺体；其中药物2周组干细胞减轻程度最为明显。表5示出了药物对大鼠结肠粘膜损伤指数和结肠组织学评分的影响。表5药物对大鼠结肠粘膜损伤指数和结肠组织学评分的影响(分)(与模型组相比，﹟p<0.05，与正常组相比，﹡p<0.05，与sasp组相比，※p<0.05)荧光显微镜观察cm-dil标记的移植bmscs迁移定植情况对模型组、bmscs组和bmscs药物组的肺、肝、脾冰冻切片上均可见镜下cm-dil标记的bmscs呈现橙黄色荧光细胞，可见多个细胞呈团状分布。cm-dil标记的细胞在肺中的数目多于肝、脾组织。与bmscs组相比，bmscs药物组荧光细胞计数的差异无统计学意义。表6示出了bmscs移植7天后各组大鼠不同组织中的细胞计数情况。表6bmscs移植7天后各组大鼠不同组织中的细胞计数情况肠道局部橙黄色荧光分布情况移植后，bmscs组及bmscs药物组均可见标记的bmscs呈橙黄荧光，记录荧光细胞位置并与光镜下同视野的肠道组织标本相对照，可见细胞主要分布于肠道的黏膜和黏膜下层，外膜亦多见。统计结果(表7)显示，移植各组溃疡部位阳性细胞数明显高于非溃疡部位(p<0.01)；与bmscs组相比bmscs药物组的溃疡部位及非溃疡部位的细胞数增加(f＝260.611，p<0.01)。表7bmscs移植后大鼠结肠组织中的细胞计数情况注：▽p<0.01，与非溃疡部位比较；*p<0.01，与bmscs组比较通过试验例2的结果可知：实施例1提供的药物对bmscs的增殖具有较佳的效果，且bmscs生长良好。此外，实施例1提供的药物以及bmscs联用的药物对结肠粘膜损伤具有修复作用，bmscs与药物联用2周效果最佳。进一步说明了本发明提供的具有白术水提醇沉物以及bmscs的药物对结肠粘膜损伤具有修复作用。进一步地，白术的水提醇沉物或者含有白术的药物可以促进bmscs的增殖，可以将增殖后的bmscs用于制备治疗多种疾病的药物。例如骨科疾病、肺部疾病、肝脏疾病、神经系统损伤等多种疾病。本试验例就白术对bmscs增殖，bmscs增殖后与白术用于制备治疗结肠粘膜损伤中的药物，可以理解的是，白术对bmscs进行增殖，增殖之后的bmscs可以用于治疗其他疾病。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12