一种抗炎活性提取物、抗炎组合物及其制备方法与流程

本发明属于菊科植物有效成分提取及分离纯化领域，具体涉及一种白花鬼针草bidensalba(linn.)dc抗炎活性提取物、抗炎组合物及其制备方法。

背景技术：

白花鬼针草的中文名称比较混乱。2007年版本的《广州野生植物》和2005年版本的《广东植物名录》将拉丁文名为bidensalba(linn.)dc.称为白花鬼针草，将bidenspilosalinn.var.radiatasch.-bip.称之为三叶鬼针草；而1979年版本的《中国植物志》和1999年版本的《中华本草》将bidenspilosalinn.var.radiatasch.-bip.称之为白花鬼针草，对bidensalba(linn.)dc.没有记载。可能的原因是bidensalba(linn.)dc.在我国是入侵物种，而且仅分布在我国的广东、广西以及海南等热带、亚热带地区，另外，仅在近年来由于bidensalba(linn.)dc.对当地的生态造成严重的影响，才引起重视。尽管中文名称混乱，但是多数学者在做研究时，均指出该物种的具体分类，并标注拉丁文名。如无特殊说明的情况下，本专利研究所涉及的所有白花鬼针草均指bidensalba(linn.)dc。

白花鬼针草(bidensalba(linn.)dc.)属于双子叶植物纲(dicotyledoneae)菊目(asterales)菊科(compositae)鬼针草属(bienslinn.)的一种，一年或多年生草本植物，原产热带美洲。在我国，白花鬼针草属于入侵物种，是一种传播快、防控难、危害大的恶性害草，在道路旁、山林边、庄稼地边以及撂荒地中形成大面积单一群落，严重影响其他生物物种的生存，生态防控压力巨大。

目前，白花鬼针草bidensalba(linn.)dc主要分布在我国的岭南地区，包括广东、广西、海南等省份，尤其在广东省分布广泛(田兴山等，2010)。白花鬼针草喜高温高湿气候，岭南以北地区基本没有白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的生长；而与之相反的是，鬼针草属的其他物种在岭南地区则相对较少。其生长的地域性等差异显著决定了白花鬼针草bidensalba(linn.)dc可能与鬼针草属的其他物种在生理特性上有所不同。

有关白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的研究较少，尤其在生物利用上的研究更少。白花鬼针草bidensalba(linn.)dc作为一种入侵物种，如果能将其研究透彻，并进行资源化利用，将具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种白花鬼针草bidensalba(linn.)dc抗炎活性提取物、抗炎组合物及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种抗炎活性提取物，其有效成分为白花鬼针草bidensalba(linn.)dc全草的醇提物进一步经过有机溶剂萃取后得到的提取物；其中，有机溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、正庚烷、乙醚、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、甲醇、异丙醇、环氧乙烷、醋酸甲酯、醋酸丙酯、丙酮、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙腈，或其同分异构体。

优选的，有机溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、氯仿。

申请人经过实验验证，如果用水提取白花鬼针草bidensalba(linn.)dc全草得到的提取物，基本检测不到活性。如果仅用乙醇溶液提取白花鬼针草bidensalba(linn.)dc全草得到提取物，可以检测到较弱的活性。而将醇提物进一步经过石油醚或乙酸乙酯或氯仿萃取后得到的提取物，其抗炎活性较强。

一种抗炎活性提取物的制备方法，包括下列步骤：

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，加入乙醇溶液，超声提取，得到提取液，离心去除叶绿素，然后减压浓缩去除乙醇；加入适量水，用有机溶剂萃取，得到抗炎活性提取物；

其中，有机溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、正庚烷、乙醚、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、甲醇、异丙醇、环氧乙烷、醋酸甲酯、醋酸丙酯、丙酮、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙腈，或其同分异构体。

优选的，乙醇溶液的体积百分比浓度为50％-99％。

优选的，乙醇溶液的体积百分比浓度为75％-95％。

优选的，将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，按照料液比为1:4-1:25加入乙醇溶液。

优选的，将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，按照料液比为1:5-1:20加入乙醇溶液。

优选的，超声提取的条件包括：频率为20-1100khz，温度为20-50℃，时间为30-120min，超声次数为1-5次。

优选的，有机溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、氯仿。

优选的，萃取时，加入体积为1-5倍量的石油醚或乙酸乙酯或氯仿，萃取1-5次，合并萃取液，减压浓缩，真空干燥，得到抗炎活性提取物。

优选的，萃取时，加入体积为1-3倍量的石油醚或乙酸乙酯或氯仿，萃取1-3次，合并萃取液，减压浓缩，真空干燥，得到抗炎活性提取物。

一种抗炎组合物，其特征在于：其有效成分为上述任一项所述的抗炎活性提取物。

优选的，该抗炎组合物还包括药物辅料。

优选的，所述的辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。

优选的，抗炎组合物包括各种剂型：

按照剂型的分散系统进行分类，具体来说，可以制成以下剂型：溶液型、胶体溶液型、乳剂型、混悬型、气体分散型、微粒分散型、固体分散型；

按照形态分类，具体来说，可以制成以下剂型：液体剂型(如芳香水剂、溶液剂、注射剂、合剂、洗剂、搽剂等)，气体剂型(如气雾剂、喷雾剂等)，固体剂型(如散剂、丸剂、片剂、膜剂等)，半固体剂型(如软膏剂、栓剂、糊剂等)；

按照给药途径分类，具体来说，可以制成以下剂型：经胃肠道给药的剂型、不经胃肠道给药的剂型。

一种抗炎组合物的制备方法，将上述任一项制备得到的抗炎活性提取物用低毒性溶剂溶解，再加入低毒性助剂，制备得到抗炎组合物。

优选的，低毒性溶剂为二甲亚砜。

优选的，低毒性助剂为吐温-80。

上述任一项所述的抗炎活性提取物或抗炎组合物在制备治疗急慢性炎症药物中的应用。

所述急慢性炎症包括肺炎、肝炎、肾炎、胃肠炎、阑尾炎、上呼吸道感染等疾病所涉及的炎症。

本发明的有益效果是：

本发明公开了一种抗炎活性提取物及抗炎组合物，其有效成分为白花鬼针草bidensalba(linn.)dc全草的醇提物进一步经过石油醚或乙酸乙酯或氯仿萃取后得到的提取物，其效果优于白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的水提物、或醇提物。

本发明研究发现所获白花鬼针草抗炎活性提取物及其药物制剂具有较好的抗炎作用，当石油醚萃取物浓度为12.6μg/ml时，对lps诱导的raw264.7巨噬细胞no释放产生96.9％的抑制；当白花鬼针草的石油醚萃取物进一步制成抗炎药物制剂后，药物浓度分别为2.4，12.1，60.7mg/kg时，对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高抑制效果与阿司匹林20mg/kg时相当。当白花鬼针草的氯仿萃取物浓度为16.7μg/ml时，对lps诱导的raw264.7巨噬细胞no释放产生85.8％的抑制；将白花鬼针草的氯仿萃取物制成抗炎药物制剂，在剂量0.8mg/kg时，对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高抑制效果与20mg/kg阿司匹林相当。当白花鬼针草的乙酸乙酯萃取物浓度大于0.8μg/ml时，对lps诱导的raw264.7巨噬细胞no释放产生90％以上的抑制。阿司匹林是一种传统的解热、镇痛、抗炎药物，用于治感冒、发热、头痛、牙痛、及类风湿关节炎等疾病。所以本发明的抗炎药物制剂，其药物浓度在0.8-12.1mg/kg时就可以获得20mg/kg的阿司匹林的效果，具有广阔的市场前景。

白花鬼针草(bidensalba(linn.)dc.)作为一种入侵物种，具有传播快、防控难、危害大等特点，本发明的研究对白花鬼针草(bidensalba(linn.)dc.)的资源利用化开辟了道路，具有重大的现实意义。

附图说明

图1为实施例1的白花鬼针草抗炎活性提取物(石油醚萃取物)对raw264.7的细胞毒性实验结果；

图2为实施例1的白花鬼针草抗炎活性提取物(石油醚萃取物)对脂多糖lps诱导raw264.7的no释放抑制率实验结果；

图3为实施例1的白花鬼针草抗炎药物制剂(石油醚萃取物)对于醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高抑制实验结果；

图4为实施例2的白花鬼针草抗炎活性提取物(氯仿萃取物)对于raw264.7的细胞毒性实验结果；

图5为实施例2的白花鬼针草抗炎活性提取物(氯仿萃取物)对于脂多糖lps诱导raw264.7的no释放抑制率实验结果；

图6为实施例2的白花鬼针草抗炎药物制剂(氯仿萃取物)对于醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高抑制实验结果；

图7为实施例3的白花鬼针草抗炎活性提取物(乙酸乙酯萃取物)对于raw264.7的细胞毒性实验结果；

图8为实施例3的白花鬼针草抗炎活性提取物(乙酸乙酯萃取物)对于脂多糖lps诱导raw264.7的no释放抑制率实验结果；

图9为对比例1的白花鬼针草水提物对raw264.7的细胞毒性实验结果；

图10为对比例2的白花鬼针草醇提物对raw264.7的细胞毒性实验结果。

具体实施方式

如无特殊说明的情况下，本专利所涉及的所有白花鬼针草均指bidensalba(linn.)dc。本专利的白花鬼针草品种已经经过中国科学院华南植物园易绮斐副研究员鉴定。

一种抗炎活性提取物，其有效成分为白花鬼针草bidensalba(linn.)dc全草的醇提物进一步经过有机溶剂萃取后得到的提取物；其中，有机溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、正庚烷、乙醚、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、甲醇、异丙醇、环氧乙烷、醋酸甲酯、醋酸丙酯、丙酮、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙腈，或其同分异构体。

优选的，有机溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、氯仿。

一种抗炎活性提取物的制备方法，具体步骤如下：

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，粒度为10-40目，按照料液比1:4-1:25加入体积百分比浓度为50％-99％的乙醇溶液，超声提取包括频率为20-1100khz，温度为20-50℃，时间为30-120min，超声次数为1-5次，获得提取液。提取液减压浓缩至一定体积，离心去除叶绿素，然后继续浓缩至无醇味，再加入适量蒸馏水溶解，用1-5倍量石油醚或乙酸乙酯或氯仿等溶剂萃取1-5次，合并萃取液，减压浓缩，真空干燥，得到白花鬼针草bidensalba(linn.)dc抗炎活性提取物。

一种抗炎组合物，其有效成分为上述抗炎活性提取物。

优选的，该抗炎组合物还包括药物辅料；所述的辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。

该抗炎组合物包括各种剂型：

按照剂型的分散系统进行分类，具体来说，可以制成以下剂型：溶液型、胶体溶液型、乳剂型、混悬型、气体分散型、微粒分散型、固体分散型；

按照形态分类，具体来说，可以制成以下剂型：液体剂型(如芳香水剂、溶液剂、注射剂、合剂、洗剂、搽剂等)，气体剂型(如气雾剂、喷雾剂等)，固体剂型(如散剂、丸剂、片剂、膜剂等)，半固体剂型(如软膏剂、栓剂、糊剂等)；

按照给药途径分类，具体来说，可以制成以下剂型：经胃肠道给药的剂型、不经胃肠道给药的剂型。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于此。

实施例1

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，粒度为25目，按照料液比1:8加入体积百分比浓度为95％的乙醇溶液，超声提取包括：频率为800khz，温度30℃，时间60min，超声次数3次，获得提取液。提取液减压浓缩至一定体积，离心去除叶绿素，然后继续浓缩至无醇味，再加入适量蒸馏水溶解，用2倍量石油醚萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，于800pa，45℃条件下真空干燥150min，得到白花鬼针草抗炎活性提取物。

将白花鬼针草抗炎活性提取物粉末用二甲亚砜溶解，再利用吐温-80作为药物助剂，制备成各浓度的白花鬼针草抗炎药物制剂。

对实施例1所获得白花鬼针草抗炎活性提取物(即醇提物的石油醚萃取物)进行功能方面的实验研究。

一、白花鬼针草抗炎活性提取物对raw264.7细胞毒性评价实验

药物溶解及稀释：将白花鬼针草抗炎活性提取物粉末溶解在分析纯的dmso中，然后用基础培养基dmem稀释至1/8倍，使dmso浓度降低至12.5％；随后各次稀释液均采用含12.5％dmso基础培养基对倍稀释药物。

将raw264.7细胞(密度为2×10⁵个/ml，100μl)接种于96孔扳中，完成后在恒温培养箱中37℃培育24h，至贴壁细胞达到底部面积的70-80％左右，加入3.3μl梯度浓度药物，使每孔dmso含量均为0.4％。培育24h，加入mtt(0.5mg/ml)20μl，继续培养4h。小心弃去上清后然后加入150μldmso溶解，振摇10min，使生成的甲瓒结晶充分溶解后，用酶标仪在490nm处测定各孔吸光度值，计算细胞抑制率。每板设空白组(不加药品，加等量细胞培养液)、调零组(不加细胞、不加药物，仅加入100μl基础培养基)和给药组，其中每个样品设置6个复孔，共重复三次实验。结果见图1。

从图1中可知，当提取物浓度为25.5μg/ml时，对raw264.7的抑制率为17.1％，大于25.5μg/ml时，有明显的细胞毒性，小于25.5μg/ml时，细胞毒性较小。

二、白花鬼针草抗炎活性提取物对脂多糖诱导raw264.7的no释放抑制实验

将raw264.7细胞(密度为2×10⁵个/ml，100μl)接种于96孔扳中，完成后在培养箱中37℃培育24h，至贴壁细胞达到底部面积的70-80％左右，加入3.3μl梯度浓度药物，使每孔dmso含量均为0.4％，药物终浓度分别为1.6，3.2，6.4，12.7μg/ml，继续培养6h后，加入终浓度2μg/ml的lps溶液，继续培养24h。接着将细胞上清液80μl转移到新的96孔板中，加入20μlgriess试剂i和ii。在恒温混匀器上振荡10min后，用酶标仪在550nm下检测no吸光度值。每板设空白组(不加lps和药品，加等量细胞培养液)，模型组(不加药品，加等量lps)和给药组，每个样品设定6个复孔，共重复3次实验。结果见图2。

从图2中可知，当提取物的浓度为3.2-12.7μg/ml时，能显著抑制lps诱导的raw264.7巨噬细胞no释放，当达到12.7μg/ml时，抑制率为96.9％。

三、白花鬼针草抗炎活性药物制剂对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高抑制实验

昆明小鼠60只，雌雄各半，体重20±2g。随机分为正常组、阴性对照组(生理盐水组，本组致炎但不给药)、阳性药物对照组(阿司匹林，20mg/kg)、实施例1的白花鬼针草抗炎药物制剂高、中、低剂量组，每组10只。用吐温-80作为药物稀释剂，高、中、低剂量组的给药浓度均低于中药常规无毒性剂量标准(5000mg/kg)，分别为60.7，12.1，2.4mg/kg。

各组小鼠连续给药3天，每天一次灌注给药0.5ml药物。最后一次给药30min后，按10ml/kg剂量尾静脉注射0.5％的伊文斯蓝，60min后按10mg/kg剂量腹腔注射含0.6％的醋酸生理盐水。50min后，所有小鼠颈椎脱臼处死，同时向腹腔注射4ml生理盐水，轻揉数下后，收集腹腔渗出液，离心(4℃，5min，3000rpm/min)，分别取各组上清液，于590nm检测。以渗出液中被染色部分的浓度大小代表血管通透性强弱。结果见图3。

从图3中可知：抗炎成分的浓度分别为2.4，12.1，60.7mg/kg时，对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高抑制效果与阿司匹林20mg/kg时相当。而且抗炎成分的浓度仅为2.4mg/kg时就可以获得与阿司匹林20mg/kg相当的效果，说明本发明的白花鬼针草抗炎活性药物制剂具有良好的市场前景。

实施例2

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，粒度为25目，按照料液比1:8加入体积百分比浓度为95％的乙醇溶液，超声提取包括：频率为800khz，温度30℃，时间60min，超声次数3次，获得提取液。提取液减压浓缩至一定体积，离心去除叶绿素，然后继续浓缩至无醇味，再加入适量蒸馏水溶解，用2倍量氯仿萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，于800pa，45℃条件下真空干燥150min，得到白花鬼针草抗炎活性提取物。

将白花鬼针草抗炎提取物粉末用二甲亚砜溶解，再利用吐温-80作为药物助剂，制备成各浓度的白花鬼针草抗炎药物制剂。

对实施例2所获得白花鬼针草抗炎活性提取物(即醇提物的氯仿萃取物)进行功能方面的实验研究。

一、白花鬼针草抗炎活性提取物对raw264.7细胞毒性评价实验

药物溶解及稀释：将白花鬼针草抗炎活性提取物粉末溶解在分析纯的dmso中，然后用基础培养基dmem稀释至1/8倍，使dmso浓度降低至12.5％；随后各次稀释液均采用含12.5％dmso基础培养基对倍稀释药物。

将raw264.7细胞(密度为2×10⁵个/ml，100μl)接种于96孔扳中，完成后在恒温培养箱中37℃培育24h，至贴壁细胞达到底部面积的70-80％左右，加入3.3μl梯度浓度药物，使每孔dmso含量均为0.4％。培育24h，加入mtt(0.5mg/ml)20μl，继续培养4h。小心弃去上清后，然后加入150μldmso溶解，振摇10min，使生成的甲瓒结晶充分溶解后，用酶标仪在490nm处测定各孔吸光度值，计算细胞抑制率。每板设空白组(不加药品，加等量细胞培养液)、调零组(不加细胞、不加药物，仅加入100μl基础培养基)和给药组，其中每个样品设置6个复孔，共重复三次实验。结果见图4。

从图4中可知，当提取物浓度33.4μg/ml时，对raw264.7的抑制率为20.4％，大于33.4μg/ml时，有明显的细胞毒性，小于33.4μg/ml时，细胞毒性较小。

二、白花鬼针草抗炎活性提取物对脂多糖诱导raw264.7的no释放抑制实验

将raw264.7细胞(密度为2×10⁵个/ml，100μl)接种于96孔扳中，完成后在培养箱中37℃培育24h，至贴壁细胞达到底部面积的70-80％左右，加入3.3μl梯度浓度药物，使每孔dmso含量均为0.4％，药物终浓度分别为2.1,4.2,8.4,16.7μg/ml，继续培养6h后，加入终浓度2μg/ml的lps溶液，继续培养24h。接着将细胞上清液80μl转移到新的96孔板中，加入20μlgriess试剂i和ii。在恒温混匀器上振荡10min后，用酶标仪在550nm下检测no吸光度值。每板设空白组(不加lps和药品，加等量细胞培养液)，模型组(不加药品，加等量lps)和给药组，每个样品设定6个复孔，共重复3次实验。结果见图5。

从图5中可知，当提取物的浓度在2.1-16.7μg/ml时，能显著抑制lps诱导的raw264.7巨噬细胞no释放，当达到16.7μg/ml时，抑制率为85.8％。

三、白花鬼针草抗炎活性药物制剂对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高抑制实验

昆明小鼠40只，雌雄各半，体重20±2g。随机分为正常组、阴性对照组(生理盐水组，本组致炎但不给药)、阳性药物对照组(阿司匹林，20mg/kg)、实施例2的白花鬼针草抗炎药物制剂组，每组10只。用吐温-80作为药物稀释剂，给药浓度0.8mg/kg，低于中药常规无毒性剂量标准(5000mg/kg)。

各组小鼠连续给药3天，每天一次灌注给药0.5ml药物。最后一次给药30min后，按10ml/kg剂量尾静脉注射0.5％的伊文斯蓝，60min后按10mg/kg剂量腹腔注射含0.6％的醋酸生理盐水。50min后，所有小鼠颈椎脱臼处死，同时向腹腔注射4ml生理盐水，轻揉数下后，收集腹腔渗出液，离心(4℃，5min，3000rpm/min)，分别取各组上清液，于590nm检测。以渗出液中被染色部分的浓度大小代表血管通透性强弱。结果见图6。

从图6中可知，当抗炎成分的浓度在0.8mg/kg时，对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高抑制效果与阿司匹林20mg/kg时相当。

实施例3

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，粒度为25目，按照料液比1:8加入体积百分比浓度为95％的乙醇溶液，超声提取包括：频率为800khz，温度30℃，时间60min，超声次数3次，获得提取液。提取液减压浓缩至一定体积，离心去除叶绿素，然后继续浓缩至无醇味，再加入适量蒸馏水溶解，用2倍量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，于800pa，45℃条件下真空干燥150min，得到白花鬼针草抗炎活性提取物。

对实施例3所获得白花鬼针草抗炎活性提取物(即醇提物的乙酸乙酯萃取物)进行功能方面的实验研究。

一、白花鬼针草抗炎活性提取物对raw264.7细胞毒性评价实验

药物溶解及稀释：将白花鬼针草抗炎活性提取物粉末溶解在分析纯的dmso中，然后用基础培养基dmem稀释至1/8倍，使dmso浓度降低至12.5％；随后各次稀释液均采用含12.5％dmso基础培养基对倍稀释药物。

将raw264.7细胞(密度为2×10⁵个/ml，100μl)接种于96孔扳中，完成后在恒温培养箱中37℃培育24h，至贴壁细胞达到底部面积的70-80％左右，加入3.3μl梯度浓度药物，使每孔dmso含量均为0.4％。培育24h，加入mtt(0.5mg/ml)20μl，继续培养4h。小心弃去上清后然后加入150μldmso溶解，振摇10min，使生成的甲瓒结晶充分溶解后，用酶标仪在490nm处测定各孔吸光度值，计算细胞抑制率。每板设空白组(不加药品，加等量细胞培养液)、调零组(不加细胞、不加药物，仅加入100μl基础培养基)和给药组，其中每个样品设置6个复孔，共重复三次实验。结果见图7。

从图7中可知，当提取物浓度为51.3μg/ml时，对raw264.7的抑制率为18.0％，大于51.3μg/ml时，有明显的细胞毒性；当提取物浓度小于51.3μg/ml时，未表现出细胞毒性。

二、白花鬼针草抗炎活性提取物对脂多糖诱导raw264.7的no释放抑制实验

将raw264.7细胞(密度为2×10⁵个/ml，100μl)接种于96孔扳中，完成后在培养箱中37℃培育24h，至贴壁细胞达到底部面积的70-80％左右，加入3.3μl梯度浓度药物，使每孔dmso含量均为0.4％，药物终浓度分别为0.2，0.4，0.8，1.2μg/ml，继续培养6h后，加入终浓度2μg/ml的lps溶液，继续培养24h。接着将细胞上清液80μl转移到新的96孔板中，加入20μlgriess试剂i和ii。在恒温混匀器上振荡10min后，用酶标仪在550nm下检测no吸光度值。每板设空白组(不加lps和药品，加等量细胞培养液)，模型组(不加药品，加等量lps)和给药组，每个样品设定6个复孔，共重复3次实验。结果见图8。

从图8中可知，当提取物的浓度为0.2-1.6μg/ml时，能显著抑制lps诱导的raw264.7巨噬细胞no释放，当浓度大于0.8μg/ml时，抑制率为90％以上。

实施例4

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，粒度为10目，按照料液比1:5加入体积百分比浓度为65％的乙醇溶液，超声提取条件包括：频率为100khz，温度25℃，时间30min，超声次数5次，获得提取液。提取液减压浓缩至一定体积，离心去除叶绿素，然后继续浓缩至无醇味，再加入适量蒸馏水溶解，用3倍量石油醚萃取2次，减压浓缩，于800pa，45℃条件下真空干燥150min，得到白花鬼针草抗炎活性提取物。

实施例5

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，粒度为40目，按照料液比1:15加入体积百分比浓度为85％的乙醇溶液，超声提取条件包括：频率为1100khz，温度50℃，时间120min，超声次数1次，获得提取液。提取液减压浓缩至一定体积，离心去除叶绿素，然后继续浓缩至无醇味，再加入适量蒸馏水溶解，用1倍量石油醚萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，于800pa，45℃条件下真空干燥150min得到白花鬼针草抗炎活性提取物。

对比例1

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，粒度为25目，按照料液比1:8加入超纯水，然后110-120℃回流2小时，重复2次，合并水提液，减压浓缩，于800pa，45℃条件下真空干燥150min，得到白花鬼针草水提物。

然后如同实施例1的实验方法进行细胞毒性实验。结果见图9。

由图9可知，水提物的浓度从13μg/ml到1669μg/ml时，对raw264.7的抑制率始终居于9.6％-22.1％之间，而且并没有出现随着药物浓度的增大，抑制率增大的剂量依赖现象。一般认为细胞抑制率低于15％时，药物是没有细胞毒性的。出现这种现象的可能原因是，水提物对raw264.7具有较弱的细胞毒性；同时由于未进行萃取分离，水提物中的糖类、氨基酸等物质促进raw264.7的生长，具体原因需要进一步研究。

对比例2

将白花鬼针草bidensalba(linn.)dc的全草晒干粉碎，粒度为25目，按照料液比1:8加入体积百分比浓度为95％的乙醇溶液，超声提取条件为，800khz，温度30℃，时间60min，超声次数3次，获得提取液。提取液减压浓缩至一定体积，离心去除叶绿素，然后继续浓缩于800pa，45℃条件下真空干燥150min，得到白花鬼针草醇提物(仅实施例1的前半部分，得到醇提物部分)。

同实施例1的实验方法进行细胞毒性实验。结果见图10。

由图10中可知，白花鬼针草的醇提物对raw264.7的细胞毒性较小，当浓度为305.5μg/ml时对raw264.7的抑制率只有12.9％，当浓度为611.0μg/ml时对raw264.7的抑制率只有17.4％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。