本发明属于宠物医疗技术领域，涉及一种控制猫瘟热的药物及其制备方法和应用。
背景技术：
猫瘟热又称猫传染性肠炎、猫泛白细胞减少症，该病是由猫细小病毒引起的一种高度接触性急性传染病，具有突然发高热、呕吐、腹泻、白细胞急剧减少等的特征。
在自然条件下可通过直接接触及间接接触病毒传播，各种年龄的猫均可感染，多数情况下，1岁以下的猫易感染，感染率可达70％，死亡率为50-60％，5月龄以下的幼猫死亡率高达80-90％，随年龄的增长发病率逐渐降低。猫感染了猫细小病毒之后，在病猫的呕吐物、粪、尿、唾液、鼻和眼分泌物中含有大量病毒；甚至病猫康复后数周至一年以上仍能从粪、尿中排出病毒。这些排泄物和分泌物污染了饲料、饮用水、用具或周围环境，并把疾病扩大传播开，因此群养的猫可全群爆发或全窝发病。
目前针对各种症状，主要是进行注射庆大霉素、卡那霉素等抗生素进行消炎、注射胃复安注射液进行止吐以缓解症状，不能从根本上消除病症，而猫瘟热高免血清因为医疗条件保存较少、多次使用后有较大的副作用，不能广泛应用，因此针对猫瘟热目前没有特效药。
脐带间充质干细胞(msc)在体外培养过程中分泌大量的生物活性因子，如血小板衍生因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、转化生长因子(tgf)、白细胞介素6(il-6)等各类生物活性因子，能够支持人体内造血功能、营养神经及降低炎症反应。
基于现有知识和上述问题，本发明进行研究，获得一种有效控制猫瘟热的药物。
技术实现要素：
针对现有药物不能根治猫瘟热的问题，本发明提供了一种有效控制猫瘟热的药物，所述药物的制备方法，以及所述药物在治疗猫瘟热疾病中的应用。
一种控制猫瘟热的药物，所述药物包括含有生物活性因子的人脐带间充质干细胞培养上清液，所述生物活性因子的分子量为3～100kda，其中所述人脐带间充质干细胞培养上清液中生物活性因子的蛋白质浓度为1～5mg/ml。
进一步的，所述控制猫瘟热的药物还包括干扰素和粒细胞集落刺激因子，其中所述干扰素的浓度为5～20万u/ml，所述粒细胞集落刺激因子的浓度为20～30μg/ml。
优选的，所述控制猫瘟热的药物，所述人脐带间充质干细胞培养上清液中生物活性因子的蛋白质浓度为2mg/ml，所述干扰素的浓度为10万u/ml，所述粒细胞集落刺激因子的浓度为25μg/ml。
进一步的，所述控制猫瘟热的药物，所述干扰素为重组干扰素。所述干扰素优选为重组猫ω-干扰素。
一种控制猫瘟热的药物的制备方法，其包括的步骤为：
(a)在常规条件下培养人脐带间充质干细胞，当所述人脐带间充质干细胞融合度达到80％时，按照常规方法消化传代培养，并收集所述细胞培养上清液；
(b)常规方法离心所述步骤(a)中获得的细胞上清液，去除细胞碎片，并收集所述人脐带间充质干细胞的培养上清液；
(c)对所述步骤(b)收集的人脐带间充质干细胞的培养上清液进行超滤，以去除分子量超过100kda的蛋白质和其它物质；和
(d)将所述步骤(c)超滤后的人脐带间充质干细胞培养上清液使用3kda的超滤膜片进行超滤浓缩，并使用注射用水重悬所述超滤浓缩液，获得控制猫瘟热的药物，其中所述超滤浓缩液含有分子量为3～100kda的生物活性因子。
一种控制猫瘟热的药物的制备方法，所述步骤还包括：
(1)使用注射用水调整人脐带间充质干细胞培养上清液中生物活性因子的蛋白质浓度为1～5mg/ml，其中所述生物活性因子的分子量为3～100kda；
(2)使用所述步骤(1)中浓度调整后的人脐带间充质干细胞培养上清液对所述干扰素进行重悬溶解，使干扰素浓度为10～20万u/ml；和
(3)使用所述步骤(2)中溶解所述干扰素的人脐带间充质干细胞培养上清液对粒细胞集落刺激因子进行重悬溶解，使其浓度为20～30ug/ml。
进一步的，所述控制猫瘟热的药物组合物的制备方法中，所述人脐带间充质干细胞培养上清液中生物活性因子的蛋白质浓度为2mg/ml，所述干扰素的浓度为10万u/ml，所述粒细胞集落刺激因子的浓度为25μg/ml。
本发明的制备的控制猫瘟热的药物，可以用于治疗猫的猫瘟热疾病。本发明的药物可进行静脉注射治疗猫的猫瘟热病。
有益效果
采用本发明的技术方案，使本发明具有以下优点：
1)本发明通过收集人脐带间充质干细胞在体外培养过程中分泌的大量的生物活性因子，通过纯化、浓缩其中的活性因子应用于抑制病毒和缓解因猫瘟病毒引起的各类症状，大大降价了废弃细胞培养上清作为生物垃圾对自然环境和人类健康存在的潜在危害；
2)本发明的猫瘟热药物，不仅可以有效控制猫细小病毒增殖及提高治病能力，同时缓解因病毒感染引起的高热、顽固性呕吐、腹泻、白细胞急剧减少的症状，减轻机体的损伤；
3)本发明的药物，可以方便长距离运输、长期存放，使用方便，是一种针对猫瘟病毒的特效药，应用前景广阔。
具体实施方式
本发明的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程和产生的效果。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于多种用途，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权力要求范围内。
实施例1、人脐带间充质干细胞的培养及培养上清液的收集
1.人脐带间充质干细胞的制备
人脐带间充质干细胞的制备在超净工作台中进行操作，并采用以下操作步骤：
(1)采集健康人的脐带组织，使用生理盐水洗掉组织及血管中残留的血液；
(2)分离去除脐带静脉、动脉及羊膜组织；
(3)将步骤(2)中脐带组织中胶质部分剪碎至1～2mm3组织块，使用含有0.1％(m/v)胶原酶i(购自sigma)和0.25％胰蛋白酶(购自armesco)的imdm培养基(购自gibco)消化液在37度，100转摇床消化2小时；
(4)2500rpm离心10分钟，去上清，并使用生理盐水洗涤沉淀一次；
(5)使用100μm细胞筛过滤去除残余组织块，并1500rpm离心10分钟，收集沉淀；和
(6)使用含有5％(v/v)的血小板裂解物(购自ultragro)的α-mem培养基(购自gibco)的msc完全培养基重悬细胞，调整细胞密度2～5×105个/cm2并进行原代培养。
2.人脐带间充质干细胞培养上清液的收集
将上述1中制备的人脐带间充质干细胞在37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养，诱导贴壁72小时，之后全量换液，去除未贴壁细胞，并添加新鲜msc完全培养基，根据细胞状态进行适量换液；待间充质干细胞融合度达到80％时，使用0.05％(m/v)胰蛋白酶(购自armesco)按照常规方法消化传代，按照5000个/cm2进行传代培养，收集p2代到p6代细胞培养上清，-20℃保存上清。
实施例2、人脐带间充质干细胞培养上清液中生物活性因子的收集人脐带间充质干细胞培养上清液中生物活性因子的收集的步骤包括：
(1)将实施例1中收集的-20℃保存上清液放置于4℃过夜融化；
(2)2500rpm离心10分钟，去除细胞碎片，并收集人脐带间充质干细胞的培养上清液；
(3)使用搅拌式超滤杯(购自millipore)进行超滤，所述搅拌式超滤杯的超滤膜片截留分子量为100kda，去除培养基中的人基因组片段、微生物及分子量超过100kda的蛋白质和其它物质；和
(4)将超滤后的人脐带间充质干细胞培养上清液使用3kda超滤膜片进行超滤浓缩，去除所述上清液中无机盐离子，酚红指示剂，并使用注射用水重悬超滤浓缩液。
通过上述步骤收集的人脐带间充质干细胞培养上清液包含多种生物活性因子。
实施例3、一种猫瘟热药物及其制备方法
一种有效控制猫瘟热的药物，包括实施例2收集的包含生物活性因子的人脐带间充质干细胞培养上清液，重组猫ω-干扰素、粒细胞集落刺激因子和注射用水。所述生物活性因子的分子量为3～100kda，所述人脐带间充质干细胞培养上清液中生物活性因子的蛋白质浓度为1～5mg/ml，所述重组猫ω-干扰素的浓度为5～20万u/ml，所述粒细胞集落刺激因子的浓度为20～30μg/ml。所述人脐带间充质干细胞培养上清液中生物活性因子的蛋白质最佳浓度为2mg/ml，所述重组猫ω-干扰素的最佳浓度为10万u/ml，所述粒细胞集落刺激因子的浓度为25μg/ml。
一种猫瘟热药物制备的步骤包括：在超净工作台上操作，
(1)首先使用注射用水将实施例2中收集的人脐带间充质干细胞培养上清液的浓度调整，使培养上清液中的生物活性因子蛋白质浓度达到1～5mg/ml，其中生物活性因子蛋白质浓度2mg/ml时为最佳；
(2)取注射用重组猫ω-干扰素(购自北京铁草公司)，使用步骤(1)中浓度调整后的人脐带间充质干细胞培养上清液对ω-干扰素进行重悬溶解，使ω-干扰素浓度达到5～20万u/ml，其中ω-干扰素浓度10万u/ml为最佳；
(3)取注射用粒细胞集落刺激因子(购自齐鲁制药公司)，使用步骤(2)中溶解ω-干扰素的人脐带间充质干细胞培养上清液对粒细胞集落刺激因子进行重悬溶解，使其浓度达到20～30ug/ml，其中粒细胞集落刺激因子浓度25ug/ml为最佳。
本方法制备的猫瘟热药物使用无菌无内毒素西林瓶分装，3ml/支；分装后的药物组合物放置于-20℃保存，有效期2年，使用时常温融化，4℃冰箱存放可以保持活性3月，本方法制备的猫瘟热药物组合物采用静脉注射使用。
实施例4、猫瘟热药物的应用
使用实施例3制备的猫瘟热药物对2窝6只四月龄感染猫瘟热病毒的猫进行治疗，其中猫瘟热药物中生物活性因子浓度为2mg/ml，粒细胞集落刺激因子(g-scf)浓度为25μg/ml、ω-干扰素(ifn-ω)浓度为10万u/ml。采用静脉注射，每3天静脉注射一次，每次3ml，3次注射为一个疗程。对其中5只得病的猫进行注射治疗，另外1只猫未进行干预，为防止病毒间相互传播,未干预的猫同其他猫进行隔离观察。治疗效果如表1所示，在使用本发明的猫瘟热药物组合物治疗之前，感染猫瘟热病毒的猫普遍精神不好、萎靡、嗜睡、呕吐、水样便或者血样便，经过一个疗程后治疗后，猫的的精神状况得到改良，呕吐症状减轻，并无腹泻；而未经本发明药物组合物治疗的猫最终死亡。另一组试验得到同样的效果。由此可见，本发明的猫瘟热药物组合物能够有效的改善感染猫瘟热病毒的猫的精神状况、减轻呕吐等。
表1.猫瘟热药物组合物治疗感染猫瘟热病毒的猫的治疗效果