一种蒽环类抗肿瘤抗生素复方胶束及其制备方法与用途与流程

本发明涉及一种基于两亲性高分子聚合物材料同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方纳米胶束，并提供制备该纳米胶束的方法，及其用途，属生物医药
技术领域：
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背景技术：
：癌症是一类严重威胁人类生命健康的疾病，传统化疗药物是癌症临床治疗的主体。其中，蒽环类抗肿瘤抗生素是一类以引起dna链的断裂和结构的破坏为主要作用机制的抗肿瘤药物，具有抗瘤谱广、对乏氧细胞有效的特点，又为放射增敏剂，在肿瘤治疗中占有重要地位，是急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌及多种其它实体肿瘤一线治疗方案的核心药物，主要包括阿霉素（doxorubicin,adm,dox）、表阿霉素（epirubicin,epi）、柔红霉素（daunorubicin,dnr）、吡喃阿霉素（pirarubicin,thp-adm）、阿那霉素（aclacinomycin,acm）、米托蒽醌（mtt、dhad）等。由于蒽环类抗肿瘤抗生素口服生物利用度低，临床多进行静脉滴注给药，但采用传统的注射制剂给药，药物经静脉滴注后迅速分布全身，在病灶部位作用效率低，同时受肿瘤多药耐药影响，必须通过增加用药剂量来提高疗效。另一方面，这类药物会诱导产生以心脏毒性为主的剂量限制性毒性，限制了其在恶性肿瘤临床治疗时剂量的提高。因此，改善蒽环类抗肿瘤抗生素临床效果的关键在于：（1）克服肿瘤细胞多药耐药；（2）有效拮抗药物诱导的心脏毒性；（3）改变药物的体内过程，提高组织分布选择性，在增效的同时实现减毒。肿瘤细胞多药耐药（multidrugresistance,mdr）是指肿瘤细胞对一种药物产生耐药性的同时也对与之结构无关、作用机制完全不同的药物产生交叉性耐药的广谱耐药现象，是当前癌症治疗中化疗失败的主要原因之一。肿瘤临床治疗实践证明，将具有不同作用机制的药物联合应用，可以降低总的用药剂量，产生互补的作用及多重效应，是克服多药耐药的有效途径。然而，由于肿瘤细胞多药耐药性的产生涉及多种因素、多种基因的异常，机制十分复杂，采用单一模式的多药耐药调节剂或免疫治疗方法，很难有效地逆转肿瘤细胞的多药耐药性。从传统中药及天然产物中发现对肿瘤发生、发展、转移和耐药具有多靶点综合作用优势和高安全性的活性成分进行联用，为改善传统化疗药物疗效提供了新的解决途径，成为抗肿瘤药物研究新热点。丹酚酸a，也称丹参酚酸a、丹参丹酚酸a（salvianolicacida,saa），是从中药丹参提取得到的一种水溶性酚酸类成分，1984年由中国医学科学院医药生物技术研究所黎莲娘教授首次分离并鉴定结构。该课题组后续开展的一系列研究结果表明，saa是丹参活血化瘀的重要功效成分。综上所述，saa具备与蒽环类抗肿瘤抗生素联用经多种途径实现协同增效并减毒的良好应用前景，能够同时负载两类不同药物的联合载药胶束载体在构建抗肿瘤药物联合递送系统方面具有潜在的优势。然而，由于蒽环类抗肿瘤抗生素和saa在理化性质上存在显著差异，如何实现二者的同时联合递送成为最大的困难和挑战，也是实现其临床联用的关键。目前，有关saa和蒽环类抗肿瘤抗生素联用的复方制剂尚未见报道，同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和saa的复方胶束载药系统仍为空白。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束及其制备方法和用途。本发明提供一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束，该胶束包含治疗有效量的蒽环类抗肿瘤抗生素、丹酚酸a以及两亲性高分子聚合物；所述的蒽环类抗肿瘤抗生素选自游离基或盐形式存在的阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、表柔红霉素、吡喃阿霉素、伊达霉素、阿那霉素、米托蒽醌中的任意一种或多种；所述的两亲性高分子聚合物为a-b型两嵌段共聚物，其中，a嵌段为数均分子量为400~20000的聚乙二醇（peg）或聚乙二醇单甲醚（mpeg）；b嵌段聚酯为数均分子量为500~100000的左旋丙交酯、右旋丙交酯、消旋丙交酯、乙交酯或ε-己内酯的聚合物，或者上述单体的一种或两种的无规共聚物；所述蒽环类抗肿瘤抗生素、高分子聚合物、丹酚酸a的质量比为1∶（100~5）∶（0.2~10）。上述一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束，优选的是，所述的蒽环类抗肿瘤抗生素为游离基或盐形式存在的阿霉素。上述一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束，优选的是，所述的两亲性高分子聚合物为聚乙二醇单甲醚（mpeg）-聚己内酯（pcl）组成的a-b型两嵌段共聚物。上述一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束，优选的是，所述的蒽环类抗肿瘤抗生素与两亲性高分子聚合物的质量比值为1∶（15~25）。上述一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束，优选的是，所述的蒽环类抗肿瘤抗生素与丹酚酸a的质量比值为1∶（3~5）。本发明还提供一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束的制备方法，该方法的技术思路是在水性介质中，通过物理包覆的方式将蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a共同包载于两亲性高分子聚合物自组装形成的胶束核中，制得同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束。所述的一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束的制备方法，包括以下步骤：（1）将亲水性高分子聚合物和丹酚酸a溶于有机溶剂中，按每1ml有机溶剂加入亲水高分子聚合物（1~50）mg和丹酚酸a（1~10mg）的投料比进行投料，然后55℃下通过旋转蒸发去除有机溶剂制得含丹酚酸a的聚合物薄膜，所述的有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈中的任意一种或几种；（2）于步骤（1）所得到的聚合物薄膜中加入水性介质，（25~70）℃下水化（1~60）min，制得丹酚酸a浓度为（0.2~20）mg/ml的丹酚酸a载药胶束；（3）将以稳定可溶盐形式存在的蒽环类抗肿瘤抗生素溶于水性介质中，制得蒽环类抗肿瘤抗生素浓度为（1~10）mg/ml的水溶液；（4）按1∶（0.05~0.5）∶（0.1~1）的体积比，于步骤（2）所得到的丹酚酸a载药胶束中依次加入ph7~9的弱碱性缓冲溶液和步骤（3）所得到的蒽环类抗肿瘤抗生素水溶液，在（25~70）℃下搅拌15~30min，经机械过滤，得到粒径分布于10~200nm范围内的同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方纳米胶束；步骤（2）、（3）中所述水性介质为水、生理盐水、葡萄糖注射液、缓冲溶液、组织培养液或体液中的任意一种或几种。上述一种同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方胶束的制备方法，优选的是，所述的有机溶剂选自丙酮。本发明所述的同时担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方纳米胶束，采用药学公知的制剂技术，加入药学上可接受的辅料，制成冻干粉，供注射、口服、黏膜或外用。本发明的又一目的旨在提供前述复方纳米胶束在抗肿瘤中的应用。与现有技术相比，本发明基于纳米技术的药物递送系统可以克服传统化疗药物稳定性差、特异性低、毒性高等缺点，并且其独特的尺寸效应可将纳米药物载体负载的化疗药物通过高通透性和滞留效应（epr效应）在肿瘤组织的选择性富集，是实现传统化疗药物增效减毒的重要策略。本发明再者利用生物相容性的两亲高分子聚合物作为基础材料自组装制备的聚合物胶束载体，本发明的制备方法具有制备工艺简单和药物缓释、靶向、长循环等优势。此外，本发明同时包载两种理化性质不同药物的联合载药胶束载体，不仅能够弥补胶束载药量较低的缺陷，而且能够同时发挥药物的各自作用及协同作用，在构建抗肿瘤药物联合递送系统方面有着潜在的优势。该载体复合物能够同时将蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a联合传输到肿瘤病灶部位，且能够实现智能控释，实现药物对肿瘤部位的被动靶向作用，降低对正常组织的损伤。详述技术思路及创新点如下：本发明的复方纳米胶束以两亲性高分子聚合物为载体材料，通过蒽环类抗肿瘤抗生素的碱性基团与丹酚酸a的酸性基团间静电引力和水性介质中自组装的共同作用，实现二者的同时联合递送，所得到的共同担载蒽环类抗肿瘤抗生素和丹酚酸a的复方纳米胶束粒径均一、包封率高，载药量和稳定性均明显优于单药胶束，为有效克服和预防蒽环类抗肿瘤抗生素诱导的心脏毒性和肿瘤细胞多药耐药性从而改善肿瘤治疗效果提供了可行的方法和技术，具有抗肿瘤治疗的应用前景。本发明采用的高分子聚合物载体材料为生物相容和生物可降解的两亲性两嵌段共聚物，在水性介质自组装过程中，由聚乙二醇或聚乙二醇单甲醚组成的亲水链段向外形成亲水性的胶束外壳，由聚酯组成的疏水性链段包载丹酚酸a和蒽环类抗肿瘤抗生素，共同形成疏水性的胶束内核，对药物起到有效的隔离保护作用，有利于提高药物的稳定性，同时在血液循环中通过“增强的渗透和滞留效应”（epr）在肿瘤部位蓄积，实现药物对肿瘤部位的被动靶向作用，降低对正常组织的损伤，并有助于克服肿瘤细胞的多药耐药性，有效提高了药物的利用效率，有利于复方药物组分发挥协同抗肿瘤增效和减毒的综合治疗效果。试验结果证明：本发明以两亲性高分子聚合物为载体材料制备的复方纳米胶束较单药胶束的基本药剂学特性明显改善，粒径和粒径分布更小，载药量、包封率及表面zeta电位的绝对数值显著增大，可保证药物在水基溶媒中的溶解性、耐稀释性和体内稳定性，从而有效提高药物的系统生物利用度。本发明采用物理而非化学的担载方式进行两种药物的同时担载，避免了化学担载方法制备的高分子键合药需要从聚合物载体上进行药物解离的问题，具有药物担载过程简单、药物释放机制明确的优点，制备方法简便易行、可控性好、成本低廉，便于推广，具有良好的产业化应用前景。附图说明图1为本发明实施例1中共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束的制备工艺示意图；图2为共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束在1%和10%bsa溶液中37℃下温孵的粒径变化；图3为共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束在1%和10%bsa溶液中37℃下温孵的zeta电位变化；图4为不同药物处理后24小时的大鼠血清ctnt含量比较；图5为不同药物处理组多发性骨髓瘤阿霉素耐药细胞rpmi8226/dox荷瘤裸鼠的肿瘤体积变化曲线；图6为不同药物处理组多发性骨髓瘤阿霉素耐药细胞rpmi8226/dox荷瘤裸鼠的体重变化曲线。具体实施方式为了便于理解本发明，特列举实施例和试验例，以进一步诠释本发明，而不是对本发明的任何方式的限制。实施例1共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束的制备和表征复方纳米胶束的制备：取20mg丹酚酸a和100mg嵌段共聚物mpeg-pcl溶解于5ml丙酮中，55℃下通过旋转蒸发去除有机溶剂，即得载丹酚酸a的聚合物薄膜，加入超纯水5ml水化30~60min，继续加入ph7.4的pbs缓冲溶液（10×）0.5ml和阿霉素水溶液（浓度3mg/ml）2ml，室温下电磁搅拌（350rpm×20min）至溶液完全澄清，经0.22μm除菌膜过滤，即得共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束。同时在相同条件下制备不含丹酚酸a的阿霉素单药胶束；将3mg阿霉素溶于1ml超纯水中，制得阿霉素浓度为3mg/ml的阿霉素水溶液。制备工艺如图1所示。表征观察：通过高效液相色谱法测定胶束的载药量和包封率，通过纳米粒度及动电位测定仪（马尔文nanozs90）测定胶束粒径、粒径分布（多分散系数，pdi）及电位，结果见表1。表1共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束（ⅰ）和阿霉素单药胶束（ⅱ）的表征观察结果比较胶束类别粒径(nm)pdizeta电位(mv)阿霉素载药量(%)包封率(%)ⅰ26.10.117-4.1619.099.5ⅱ50.90.160-1.052.969.4结果发现：与阿霉素单药胶束相比，共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束具有更小的粒径和更均匀的粒径分布；表面电位的方向一致，但绝对数值明显增大，因而不易发生粒子聚沉，稳定性提高；包封率和载药量均显著提高，表明共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束具有更佳的综合药剂学基本特性。实施例2共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束冻干粉制备取20mg丹酚酸a和100mg嵌段共聚物mpeg-pcl溶解于5ml丙酮中，55℃下通过旋转蒸发去除有机溶剂，加入5ml超纯水，水化30~45min溶解药膜。同时在相同条件下制备不含丹酚酸a的阿霉素单药胶束，将1~10mg阿霉素溶于1ml超纯水中，制得阿霉素浓度为（1~10）mg/ml的阿霉素水溶液。然后，继续加入ph7.4的pbs缓冲溶液（10×）0.5ml和阿霉素水溶液（浓度3mg/ml）2ml，室温下电磁搅拌（300rpm×30min）至溶液完全澄清，然后，经0.22μm除菌膜过滤，即得共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束。或室温下电磁搅拌（300rpm×30min）至溶液完全澄清后，加入100mg甘露醇，溶液经0.22μm除菌膜过滤后冻干，即得共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束冻干粉。经测定，该复方胶束冻干粉经生理盐水复溶成含丹酚酸a5mg/ml、阿霉素1.5mg/ml的溶液，室温下放置24小时，溶液中溶解状态的药物含量大于95%，粒径和变化zeta电位变化小于5%。试验例3共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束的稳定性考察以实施例1中所得的共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束为对象，分别测定复方纳米胶束在1%和10%胎牛血清白蛋白（bsa）溶液中37℃下温孵24小时内的粒径和zeta电位变化，以考察复方纳米胶束的体内稳定性，结果见图2、图3。结果表明：复方纳米胶束在含1%bsa和10%bsa的介质中37℃温孵，胶束粒径在12小时内和温孵前相比均无显著改变（p>0.05），至24小时可见粒径增大（**p<0.01），因此，复方纳米胶束在模拟体液循环条件下至少在12小时内保持稳定（图2）；复方纳米胶束在含1%bsa和10%bsa的介质中37℃温孵12小时的zeta电位均为负值，且较不含bsa的未经温孵的等浓度复方纳米胶束溶液对照组在绝对数值上显著增大（*p<0.05,**p<0.01），而等电点为4.7的bsa在中性ph条件下以负电荷的形式存在，因此，较大的负zeta电位是保证本发明提供的复方纳米胶束体内稳定性的关键因素之一（图3）。试验例4共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束对大鼠心脏毒性的影响实验健康雄性sd大鼠18只，体重（250±20）g，随机分为3组（n=6），分别经尾静脉注射给予实施例1中所得的共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束、阿霉素-丹酚酸a物理混合物和阿霉素，以阿霉素计的给药剂量均为20mg/kg，给药处理后24小时采集动物血清，按试剂盒（上海酶研生物科技有限公司）规定步骤，elisa法测定特异性心肌细胞损伤的血清标志物心肌肌钙蛋白t（ctnt）含量，观察药物干预对大鼠心肌的损伤和影响。结果见图4。结果发现：共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束以及与复方纳米胶束相同剂量的阿霉素-丹酚酸a物理混合物干预组动物血清的ctnt含量均明显低于阿霉素组，差异有显著意义（**p<0.01），表明丹酚酸a对阿霉素诱导的大鼠心肌损伤具有保护作用；且共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束较等剂量的物理混合物具有明显更强的保护效果（＃p<0.05）。试验例5共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束抑制肿瘤细胞体外增殖的实验以实施例1中所得的共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束为对象，以阿霉素为对照，在人肺腺癌细胞a549体外培养模型上，应用mtt法考察抗肿瘤活性。取对数生长期的a549细胞悬液，以5×103个/孔的数量接种于96孔细胞培养板，在含5%co2的细胞培养箱中37℃培养24小时，给予10μl不同浓度药物进行干预处理，于37℃、5%co2条件下继续培养48h。同时进行空白和对照实验。采用mtt细胞毒性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测细胞生存率，使用酶标仪（美谷分子仪器上海有限公司，versamax）在570nm测定光密度（od），按（药物干预处理细胞od值/空白对照细胞od值）×100%计算细胞生存率，根据细胞生存率随药物浓度变化关系，计算药物对细胞体外增殖的半数抑制浓度（ic50）。结果发现：共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束对a549细胞体外增殖的ic50为17.3μmol/l（以阿霉素计），阿霉素对a549细胞体外增殖的ic50为22.1μmol/l（以阿霉素计），表明复方纳米胶束保持甚至增强了阿霉素的抗肿瘤细胞体外增殖活性。试验例6共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束克服a549/dox细胞耐药性的实验以实施例1中所得的共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束为对象，以阿霉素为对照，在人肺腺癌细胞阿霉素耐药型a549/dox体外培养模型上，应用mtt法考察药物对耐药肿瘤细胞的增殖抑制活性。为保持细胞耐药性，mtt试验前将a549/dox细胞在培养液中脱药培养一周。将调好浓度的a549/dox细胞以5×103个/孔的数量接种于96孔细胞培养板，在含5%co2的细胞培养箱中37℃培养24小时，给予10μl不同浓度药物（生理盐水溶解）进行干预处理，于37℃、5%co2条件下继续培养48h。采用mtt细胞毒性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测细胞生存率，使用酶标仪（美谷分子仪器上海有限公司，versamax）在570nm测定光密度（od），按（药物干预处理细胞od值/空白对照细胞od值）×100%计算细胞生存率，根据细胞生存率随药物浓度变化关系，计算药物对细胞体外增殖的半数抑制浓度（ic50）。结果发现：共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束对a549细胞体外增殖仍有较强的剂量依赖性的抑制作用，ic50为76.7μmol/l（以阿霉素计），而阿霉素对a549/dox细胞体外增殖抑制作用较非耐药细胞明显降低，ic50为1.11mmol/l，表明复方纳米胶束能够克服肿瘤细胞对阿霉素的耐药性，提高肿瘤细胞对于阿霉素的敏感性。试验例7共载阿霉素与丹酚酸a的复方纳米胶束抑制多发性骨髓瘤阿霉素耐药细胞rpmi8226/dox裸鼠异种移植瘤生长的实验雄性balb/c小鼠腹侧皮下接种5×106个rpmi8226/dox细胞。一周后，选取大小均匀、生长良好的荷瘤小鼠30只，随机分为3组，即ⅰ-空白溶媒（生理盐水）组、ⅱ-复方纳米胶束组（来源于实施例1，dox：20mg/kg；saa：20mg/kg）、ⅲ-阿霉素和丹酚酸a混合物组（dox：20mg/kg；saa：20mg/kg），每组10只。分别于第0、4、8天经尾静脉注射不同制剂，隔日称量小鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤大小（a、b分别为肿瘤的长径和短径），计算肿瘤体积（ab2/2），于初次给药后第14天处死全部动物，剥取肿瘤，称重，计算肿瘤体积和肿瘤抑制率。结果发现：与空白溶媒组（ⅰ）相比，等剂量共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束组（ⅱ）和阿霉素与丹酚酸a混合物组（ⅲ）对小鼠移植瘤的生长均显示有抑制作用（图5），但复方纳米胶束组对阿霉素耐药肿瘤细胞在体内生长的抑制作用更强，两组的抑瘤率分别为80.6%和43.2%，表明复方纳米胶束在体内能够克服肿瘤细胞对阿霉素的耐药性，提高体内肿瘤细胞对于阿霉素的敏感性；共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束组（ⅱ）的动物体重无明显变化，但阿霉素与丹酚酸a混合物组（ⅲ）的小鼠体重下降明显（图6），表明阿霉素与丹酚酸a混合物对阿霉素耐药肿瘤的体内生长有一定的抑制作用，但同时也有一定的毒性，而共载阿霉素和丹酚酸a的复方纳米胶束可在降低药物毒性的同时有效克服肿瘤细胞对阿霉素的耐药性，提高肿瘤细胞对于阿霉素的敏感性，产生良好的综合疗效。当前第1页12