青藤碱磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌增殖能力的靶向药物中的应用的制作方法

本发明涉及药学领域，尤其是一种青藤碱磁性靶向载药微球在制备胰腺癌增殖能力的靶向药物中的应用。

背景技术：

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，其早期症状隐匿，发现时多已是晚期，手术切除率低，预后差^[1]。因此，更多地了解胰腺癌的发病机制对于胰腺癌的早期发现、诊断及治疗至关重要。

青藤碱(sinomenine，sin)是从防己科植物青藤及毛青藤的藤茎中提取的一种生物碱，其分子式为c19h23no4，分子量329.38。青藤碱具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、抗血管生成、抗心律失常等作用。近年来随着对青藤碱研究的深入，发现了一些新的药理作用和作用机制，尤其是抗肿瘤方面的作用越来越受到国内外学者的重视。青藤碱能够抑制多种恶性肿瘤细胞，对肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤均具有显著的抑制作用。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种青藤碱磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌增殖能力的靶向药物中的应用，它对胰腺癌增殖能力具有显著的抑制作用。

本发明是这样实现的：青藤碱磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌增殖能力的靶向药物中的应用。

青藤碱磁性靶向载药微球作为唯一有效成分。

将青藤碱磁性靶向载药微球与药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的剂型。

为了验证本发明的实验效果，进行了以下体内实验：

1方法

1.2细胞培养：sw1990细胞用含10％胎牛血清的高糖dmem，置于37℃、5％co2的恒温培养箱培养。细胞呈单层贴壁生长，实验均取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml。接种细胞24h后进入对数生长期后开始进行药物干预。

1.3青藤碱对胰腺癌细胞增殖的影响：采用cck-8法检测。将细胞浓度调整为1×10⁵个/ml，以3×10³个/孔细胞接种于96孔板内，每组设5个复孔。细胞接种24后进入对数生长期，开始给药。实验设对照组和给药组，给药组加入青藤碱溶液，使其终浓度为0.125，0.25，0.5，1.0，2.0mmol/l，对照组给予等体积的完全培养基，37℃、5％co2的培养箱中分别培养24h，48h，72h后，检测前每孔加入cck-810ul和无血清dmem100ul的混合液，37℃继续培养2h后，酶标仪检测波长450nm处的吸光度(od值)。细胞增殖率＝(给药组od值/对照组)×100％。

1.4青藤碱对胰腺癌细胞集落形成的影响：采用平板克隆实验。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，于6cm培养皿中种植3000个细胞，37℃培养24h后，待细胞完全贴壁，进入对数生长期，开始给药。实验设置对照组和给药组，给药组加入青藤碱溶液，使其终浓度为0.125，0.25，0.5，1.0，2.0mmol/l，对照组给予等体积的完全培养基，37℃、5％co2的培养箱中培养10～14天后，4％多聚甲醛固定30min，1％结晶紫染色30min，pbs洗3遍后干燥处理。数字拍摄成像，于显微镜下计数＞10个细胞的克隆数。

1.5流式细胞术检测青藤碱对细胞凋亡的影响。将细胞浓度调整为1×10⁵个/ml接种于6孔板中，37℃、5％co2的培养箱中培养24小时后，开始加药。实验设置对照组和给药组，给药组加入青藤碱溶液，使其终浓度为0.125，0.25，0.5，1.0，2.0mmol/l，对照组给予等体积的完全培养基，37℃、5％co2的培养箱中培养24h。收集上清液，pbs洗一遍，每孔用不含edta的0.25％胰酶消化，加入等体积的dmem完全培养基终止消化收集细胞，800rpm离心5min后，pbs洗涤2次，弃上清，每组加入200ul1×bindingbuffer，悬浮细胞约为1×10⁵个，在细胞悬液中加入2.5ulannexinv-fitc、5ulpi，混匀；4℃避光反应15min；流式细胞仪上机检测，记录结果。

1.6westernblotting检测蛋白的表达。细胞处理同1.5项下，每孔加100ulripa裂解液充分裂解提取细胞总蛋白。使用bca蛋白定量试剂盒对各组样品进行定量，每孔50ug的蛋白质量进行12％sds-page电泳，转至聚亚乙烯双氧化物(pvdf)膜上，振荡封闭，加入一抗(1：1000)，4℃摇床过夜，室温孵育二抗(1:2000)2h，ecl化学发光后曝光，以gapdh为内参照。

1.7统计学处理方法应用spss13.0统计学软件进行数据分析，各组数据以均数±标准差(x±s)表示，方差检验齐性，实验组及对照组比较用单因素方差分析，样本间比较采用配对样本t检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1青藤碱对胰腺癌细胞sw1990增殖的影响。青藤碱各剂量组在24h、48h及72h对sw1990细胞均出现抑制作用，与对照组比较差异均有统计学意义(p＜0.05，见图1)。各剂量从低到高处理细胞后，处理24h的细胞相对对照组的增殖率分别为88.6％、78％、71.13％、37.8％、15.4％；处理48h的细胞相对对照组的增殖率分别为81.8％、72.2％、60％、37.47％、11.45％；处理72h的细胞相对对照组的增殖率分别为78.18％、67.42％、57.30％、32.03％、8.54％。以上结果显示细胞增殖率随青藤碱浓度的增加而降低，具有时间和浓度依赖性。

2.2青藤碱对胰腺癌细胞集落形成的影响。青藤碱组除0.125mmol/l与对照组无显著差别(p＞0.05，见图2)外，其余组随着浓度的增加细胞集落逐渐减少，差异均有统计学意义(p＜0.05，见图2)。提示青藤碱具有抑制胰腺癌细胞的克隆形成能力。

2.3青藤碱对人胰腺癌sw1990细胞凋亡的影响。流式细胞分析显示青藤碱组除与对照组无显著差别(p＞0.05，图3)外，其余各剂量组与对照组具有明显差异，且随着青藤碱浓度的增加细胞凋亡逐渐增加，差异具有统计学意义(p＜0.05，图3)。westernblot检测凋亡蛋白parp发现青藤碱组叫对照组显著增加，差异具有统计学意义(p＜0.05，图4)。表明随着青藤碱浓度的增加，其促进胰腺癌细胞sw1990凋亡作用逐渐增强。

3讨论

多项实验表明非甾体类抗炎药(nasids)，如阿司匹林、塞来昔布等，具有治疗和预防肿瘤的作用。青藤碱是从防己科植物青藤及毛青藤的藤茎中提取的一种生物碱单体，青藤碱具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、抗血管生成、抗心律失常等作用。青藤碱作为一类抗风湿及类风湿关节炎药物，近年来随着对青藤碱研究的深入，发现了一些新的药理作用和作用机制，尤其是抗肿瘤方面的作用越来越受到国内外学者的重视。青藤碱能够抑制多种恶性肿瘤细胞，对肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤均具有显著的抑制作用。然而，其对胰腺癌的作用还未知。本发明重点从体外实验出发，以cck-8实验、平板克隆实验、流式细胞实验以及westernblot实验探讨青藤碱对胰腺癌细胞sw1990增殖和凋亡方面的影响。

细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去，他是生物生长、发育、繁殖和遗传的基础。陈伟毅等用不同浓度青藤碱作用于胃癌mgc803细胞株，用mtt法检测发现，与对照组比较，青藤碱对mgc803细胞株具有显著的增殖抑制作用。杨国才等研究发现青藤碱对a549细胞具有增殖抑制作用。本实验通过体外细胞培养sw1990细胞，采用cck-8实验，得出随着浓度的增加和时间延长，青藤碱对细胞的抑制作用也越来越强，抑制率最高可达91.46％。平板克隆实验显示，随着浓度的不断增加，sw1990细胞集落逐渐减少。以上表明青藤碱能够抑制胰腺癌sw1990细胞的生长，并具有时间浓度依赖性。

细胞凋亡是活体内个别细胞程序性死亡的表现形式，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动性死亡。流式细胞学检测发现随着青藤碱浓度的增加，胰腺癌细胞sw1990凋亡逐渐增强。本研究还发现青藤碱作用与胰腺癌细胞sw1990后，凋亡蛋白parp表达明显增加。诱导细胞凋亡是药物抗肿瘤作用机制之一，青藤碱对细胞凋亡的诱导作用与其抑制细胞生长密切相关。

本发明发现了青藤碱与胰腺癌细胞增殖的相关性，利用青藤碱磁性载药微球作为有效成分来制成药物，该药物对于胰腺癌细胞增殖具有显著的抑制作用。

附图说明

图1青藤碱的化学结构式；

图2不同浓度青藤碱对sw1990细胞增殖能力的影响(cck-8)；

图3不同浓度的青藤碱对sw1990细胞克隆形成的影响(平板克隆)

图4不同浓度的青藤碱对sw1990细胞凋亡的影响；

图5不用药物浓度的青藤碱对parp蛋白表达的影响。

具体实施方式

本发明的实施例：

将适量的peg4000、青藤碱水溶液、磁流体、白蛋白混合搅拌，分溶解混合后加入与含有表面活性剂span80的蓖麻油100ml混合，拌10min，充分乳化，取蓖麻油100iill加热至160℃，入上述乳浊液，60℃保温10min，后室温恒速搅拌6h。加乙醚200rill脱脂，离心，去油相，淀依次用乙醚、乙醇漂洗，后置换在蒸馏水中，冷冻干燥48h。