食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用的制作方法

本发明涉及基因检测领域，具体的涉及食管鳞癌早期分子诊断标志物及其在临床诊治中的应用，更具体的涉及mir-1277及其成熟mirna在制备食管鳞癌诊断制剂中的应用。

背景技术：

食管癌是人类常见的十大恶性肿瘤之一，我国是食管癌高发的国家之一，尤其是食管鳞癌(escc)为我国食管癌的主要病理类型。食管鳞癌的发生经历从正常食管粘膜、炎症、食管粘膜上皮异型增生、原位癌、粘膜内癌、早期浸润癌、晚期癌的过程。食管癌起病隐匿，许多患者早期阶段无任何症状，50％以上患者在确诊时己无法切除或己出现影像学可见的转移灶，中晚期患者术后5年整体生存率多年以来一直徘徊在10％左右。如能找到精确的诊断方法患者及时进行干预，并防止对低危组患者过度治疗，从而延长手术患者的寿命。研究表明通过对接受手术切除的早期食管鳞癌患者的长期随访，发现5年总体生存率可高达百分之八十以上。因此，早诊早治对于降低食管鳞癌的死亡率更为关键。目前可应用于食管鳞癌早期诊断的影像学方法有食管钡餐造影、计算机断层扫描和核磁共振成像，内镜技术有高放大倍数高分辨率内镜、色素内镜、窄谱成像内镜、自体荧光成像内镜、激光共聚焦内镜、光学连续x线断层扫描内镜、以及影像学与内镜相结合的内镜超声，病理细胞学方法有食管拉网脱落细胞学检查。这些方法各具优点，但同时也各显示有某方面的不足。由于技术水平所造成的诊断不明确，很可能会导致部分早期食管鳞癌患者失去最佳的治疗机会。上述现状充分表明，目前食管鳞癌的诊断方法，尤其是对术后患者的预后风险分层、早期癌精确诊断以及癌前病变癌变风险预警，需要更准确的指标进行补充。运用分子生物学方法研究鉴定有效的分子标志物，是辅助现有临床诊断、指导临床干预和癌前预警的关键手段之一。

本发明对3例发生转移的食管鳞癌组织、3例未发生转移的食管鳞癌组织及6例癌旁组织的样本进行转录组测序，并运用生物信息学方法进行分析，找到一些与食管鳞癌相关的分子标志物，其中mir-1277-5p在癌组织中的表达量高于癌旁组织，进一步，荧光定量pcr实验结果与高通量测序结果一致。本发明为临床食管鳞癌的精准诊断提供了潜在的分子标志物，具有重要的实际应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种治疗食管癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：

(a)化合物或组合物，所述化合物下调mir-1277和/或其成熟mirna的转录和/或抑制mir-1277和/或其成熟mirna的活性；

(b)药剂学上能接受的载体。

所述mir-1277序列见seqidno1：accucccaaauauauauauauauguacguauguguauauaaauguauacguagauauauauguauuuuugguggguuu，其成熟mirna为mir-1277-5p和mir-1277-3p，序列见seqidno2：aaauauauauauauauguacguau和seqidno3：uacguagauauauauguauuuu。

进一步，采用反义寡核苷酸、mirnainhibitor、antagomirs、mirna海绵、mirnaerasers、targetmasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-1277和/或其成熟mirna的转录和/或抑制mir-1277和/或其成熟mirna的活性。

进一步，药物组合物抑制食管鳞癌细胞的生长。

本发明的目的在于提供上述药物组合物在治疗食管鳞癌中的应用。

进一步，mirnainhibitor序列见seqidno6。

本发明的目的在于提供一种食管癌诊断试剂，所述诊断试剂检测样本中mir-1277和/或其成熟mirna的表达情况。

进一步，食管癌包括食管鳞癌和食管腺癌，优选为食管鳞癌。

所述的样本为肿瘤组织或外周血。

进一步，食管鳞癌诊断试剂基于高通量测序方法和/或基因芯片法和/或定量pcr方法和/或探针杂交方法检测样本中mir-1277和/或其成熟mirna的转录情况。

高通量测序方法主要是指454lifesciences公司、abi公司和illumina公司推出的二代测序技术以及helicosheliscope^tm和pacificbiosciences的单分子测序技术。

优选采用二代测序方法、单分子测序方法、northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中mir-1277和/或其成熟mirna的转录。

优选的，所述的用于定量pcr方法包括特异性扩增mir-1277和/或其成熟mirna的引物；所述的基于探针杂交方法包括与mir-1277和/或其成熟mirna的核酸序列杂交的探针。

进一步，加尾法扩增mir-1277-5p的引物为序列seqidno4：aaatatatatatatatgtacgtat。

本发明的目的还在于提供上述mir-1277和/或其成熟mirna在制备食管鳞癌诊断工具中的应用。

定义：

mirna是一类内源性、高度保守的、长度大约为22个核苷酸的非编码小分子rna。mirna通过其5'端可以与靶基因的3'端非翻译区(3'utr)特异性结合，在转录后水平发挥调控作用。当mirna与靶基因3'utr以碱基完全互补配对的方式结合会引起靶mrna的降解，而通过非完全互补配对结合的方式则会抑制mrna的蛋白翻译。近年来，循环mirna作为各类疾病标志物的研究备受关注。循环mirna是指存在于血清、血浆、一些体液如唾液、尿液和脑脊液中，游离于组织外的mirna的统称。循环mirna作为一个较新且有前景的研究领域，近几年关于其作为肿瘤诊断标志物的研究成为热点。

现阶段检测mirna的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基因芯片、基于核苷酸杂交和基于pcr的mirna检测方法。基于探针杂交技术的mirna检测方法是一种直接检测法，不需要对样本rna进行预扩增，包括northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。

(1)northern杂交

又称rna印迹技术为最经典的检测真核生物rna大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定mirna样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶mirna序列互补的dna探针，然后与经过标记的样本mirna杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。

(2)mirna表达谱芯片

原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上mirna基因及内参序列，可精确分析出样品中相应mirna的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又称多功能悬浮点阵(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。

(3)核酶保护分析技术(rpa)

mirna的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测rna样本混合，热变性后杂交，未杂交的rna和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的rna分子，最后通过变性page电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知mirna。

(4)rake法

rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基础上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna与固定的dna探针杂交的方法。rake可以敏感特异地检测mirna，适用于大量快速的筛选所有己知的mirna。能够在特定的细胞和肿瘤中检测mirna表达谱情况。不仅如此，rake法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出mirna并对其进行分析，为从存档标本中分析mirna开启了希望之门。

(5)原位杂交(insituhybridization)

原位杂交技术可直观了解mirna表达方式，是观测mirna时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是当前应用较多的探针方式。

(6)基于微球的流式细胞术(bead-basedflowcytometry)

是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。

(7)实时荧光定量pcr技术(real-timepcr，rt-pcr)

荧光检测pcr仪可对整个pcr过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的pcr循环数(一般用特定阈值循环数ct来表达)越少。由于mirna长度仅为22nt，传统的qrt-pcr不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于mirna的实时定量pcr方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的mirna检测qrt-pcr方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测mirna为模板逆转录合成cdna第一链，该cdna一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cdna的长度，随后以合成的cdna为模板设计引物进行实时定量pcr扩增。qrt-pcr具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。

(8)测序法

大部分已知的mirna都是通过cdna克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建mirna的cdna文库，再进行pcr扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。takada开发了一种改进的扩增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cdna链的3’末端。当5’端接头与cdna链的poly(c)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cdna的pcr扩增。由于mrap高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中mirna的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(sage)技术的基础上发展了检测效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个mirna，明显提高了检测效率。

高通量测序(high-throughputsequencing)又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有mirna的序列信息，解密mirna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。

基于rna的microrna功能获得性技术即通过外源性补充mirnas合成的前体物质来升高mirnas的水平。例如，可以人工合成与内源性mirna序列一致的短发夹样rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做启动子，以病毒为载体转染细胞，被dicer酶修饰后载入risc发挥作用，相当于升高pre-mirna的水平，作用效果稳定而持久。

基因特异性mirmimics技术该技术避免了mirna与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’utr互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与mirna相同的转录后调节作用。

包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearicacidmagnesium)及矿物油(mineraloil)等，但并非局限于此。

本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

附图说明

图1是mir-1277-5p的相对表达情况图

图2是mir-1277-5p诊断食管鳞癌的roc曲线图

图3是cck8法检测mir-1277-5p对细胞生长的影响图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1样品的收集

3例发生转移的食管鳞癌组织、3例未发生转移的食管鳞癌组织及6例癌旁组织的样本均来自医院2015年6月-2017年1月手术切除的标本，所有标本均在离体10分钟以内放入液氮罐中，随后转移至-80℃冰箱中储存。

实施例2总rna提取

1提取方法

1)取80mg组织块，加入800μllysis/binding缓冲液，使用匀浆器对组织块进行匀浆。匀浆的过程中样品要置于冰上保持低温状态。

2)再加入1/10体积homogenateadditive到上述已经匀浆的组织样品中，冰上放置10min。

3)加入与lysis/binding缓冲液等量体积的水饱和酚，震荡45s,10,000×g室温离心5min。

4)小心取出上清到新的试管中，加入1.25倍体积的无水乙醇，混匀后，移入纯化柱中，10,000×g，离心15s，倒掉收集管中的液体。由于柱子的最大的体积只有700μl，因此重复此步操作，直到所有的上清都过滤完成。

5)向离心柱子中加入700μlmirna洗脱液1，室温，10,000×g，离心15s,倒掉收集液，换用新的收集管。

6)再用500μl洗脱液2/3加入离心柱中，10,000×g，离心10s，重复这一步骤一次。

7)离心1min，10,000×g，弃去多余的液体。

8)将上述液体转移到新的离心管，加100μl95℃预热的depc处理30s，10,000×g，离心。

9)使用nanodrop测定rna浓度和260nm/280nm的比值。

10)得到的rna保存于-80℃冰箱。

2提取标准

测定rna浓度和260nm/280nm的比值：总rna的纯度要求是od260/od280值应在1.8至2.2之间；rna完整性的检测：用1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性；

根据测序公司的要求，小rna测序总量3μg以上，浓度在300ng/μl以上。

实施例3测序及数据分析

由测序公司进行测序文库的建立及上机测序，所使用的测序仪为illumina公司的hiseq2000测序仪。

根据测序公司提供的数据进行统计学分析，fdr<0.001，log2(fc)绝对值>1，两组count平均值之差大于100。对差异表达mirna人为挑选过滤中差异表达明显的mirna，几个之前从未被报道过的与食管鳞癌相关的分子标志物进入我们的研究范围，其中mir-1277-5p在转移组和患病组两组间虽然有差异表达，但是差异不明显，在转移和患病癌组织中的表达量均显著高于癌旁组织。

实施例4real-timepcr检测食管鳞癌外周血样本中mirna的表达

1样品采集：

26例食管鳞癌病人外周血样本和31例健康对照外周血样本均来自医院，患病组均是经过病理检测确诊。

2mirna提取：

使用sigma公司的genelutetm血浆/血清rna小量纯化试剂盒(产品编号rnb500)，具体操作参照试剂盒操作说明书。

3mirna逆转录

表1rt体系

abi9700型pcr仪上37℃保温60min使逆转录反应完全后，95℃5min终止反应。加入80μlnuclease-freeh2o稀释至100μl储存在-20℃冰箱，用于后续实验。

4荧光定量pcr

表2rt-pcr体系

mirnas的表达检测每次设置3个平行管反应，microrna-specificprimer引物见表3，以通用的snrnau6作为内参。

pcr程序：95℃10min；40个循环(95℃10s，60℃30s)。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。5统计学分析

采用originpro8.1软件进行分析。统计方法均数间比较采用t检验，p<0.05(差异显著)和p<0.01(差异非常显著)定为有统计学意义。结果显示与健康对照相比，食管鳞癌组mir-1277-5p显著升高，为对照组的约2.4倍(见图1)，rt-pcr结果与高通量数据分析结果一致。

实施例5诊断效能的评价分析

对于单个mirna分子或是诊断模型的效能评价的方法为建立受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线，通过计算曲线下面积(areaundercurve)来判断诊断的能力。我们将tcga数据库中有关食管鳞癌的数据进行下载，获得数据集(包括13例对照组和95例病例组)，进而进行分析，结果显示，mir-1277诊断食管鳞癌的auc为0.779(见图2)，表明mir-1277在诊断食管鳞癌方面具有较好的参考价值。

实施例6食管鳞癌细胞株的培养及瞬时转染

一、材料准备：

食管鳞癌细胞系ec109购自中科院上海细胞库。

lipofectamine^tm2000transfectionreagent(invitrogen)。

rpmi1640和dmem培养基购自gibco公司，新生牛血清和胎牛而清购自paa公司。

mir-1277-5p序列发给合成公司，请其化学合成mir-1277-5pmimics(seqidno5：aaauauauauauauauguacguau)、mir-1277-5pinhibitor(seqidno6：auacguacauauauauauauauuu)及其非特异性对照。

二、实验方法

1、细胞培养

食管鳞癌细胞株ec109采用含10％新生牛血清的rpmi1640培养基，在37℃、5％co2、饱和湿度的条件下传代培养，待细胞培养至贴壁约80％密度时，pbs洗涤2次后用0.25％的胰酶消化细胞并用含血清的完全培养基终止消化，按需要比例传代，采用对数生长期的细胞进行后续实验。

2、细胞冻存与复苏

将细胞用适量0.25％胰酶消化并用含血清的完全培养基终止消化后，加入含10％dmso的冻存液制成单细胞悬液，加入1ml至无菌冻存管中，逐步降温后在液氮中保存。冻存程序为：4℃30min、-20℃1-2h、-80℃过夜，之后转移至液氮罐中保存。细胞复苏时，在37℃水浴中迅速解冻后转移到培养基中进行培养。12-16小时后换液进行常规培养。

3、mirna瞬时转染

操作按lipofectamine^tm2000试剂说明书进行。转染前24h将生长状态良好的ec109细胞接种到6孔板中，细胞计数约为4×10⁵/l，常规培养至转染当天，细胞融合度为70-80％时进行实验。将100nmmir-1277-5pmimics/mir1277-5pinhibitor加入到250μl无血清1640培养基中，轻柔混匀；另用250μl无血清1640培养基稀释5μllipofectamine^tm2000脂质体，轻柔混匀；混合，室温孵育20min，以形成转染复合物：然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，培养4-6h后更换为含有10％小牛血清完全培养基。其中，非特异性的mimicsnegativecontrol(mimicsnc)和inhibitornegativecontrol(inhibitornc)序列作为对照。

培养24-48h后抽提细胞总rna，逆转录成cdna，实时定量pcr检测瞬时转染后mir-1277-5p表达的改变。

4.实验结果

采用阳离子脂质体法进行瞬时转染，分别将mir-1277-5pmimics或mir-1277-5pinhibitor及相应对照序列negativecontrol(nc)转染食管鳞癌细胞株ec109。转染48h后，抽提细胞总rna。以u6为内对照，实时定量pcr检测mir-1277-5p的表达。结果显示：与对照组相比，ec109转染mir-1277-5pmimics后，mir-1277-5p的表达增高了约3.3倍；转染mir-1277-5pinhibitor后，表达下降了近71％。以上结果表明，通过瞬时转染mir-1277-5pmimics和mir-1277-5pinhibitor可有效上调或下调mir-1277-5p的表达，结果可靠可进行后续实验。

实施例7转染mir-1277-5p对人食管鳞癌细胞生长的影响

cck-8法采用日本同仁化学研究所(dojindo)的cellcountingkit-8试剂盒检测。细胞转染步骤参照实施例6。转染24h后检测有活性的细胞数，吸去旧的培养基，每孔加入新鲜配制的cck8检测试剂。先配制所测孔数相应的检测试剂(每孔100微升1640培养基和10微升cck8)，混匀后每孔加入100微升混合物。同时设置一组空白对照，即为只有cck8检测试剂无检测细胞组。细胞放入孵箱继续培养，2h后酶标仪检测od450。依次于转染48h，72h，96h后相同时间点加入cck8检测试剂，孵育2h后检测od450。根据每组均值和标准差绘制细胞生长曲线图。

采用cck-8法检测mir-1277-5p对食管鳞癌细胞体外生长的影响。结果发现在ec109细胞中过表达mir-1277-5p(转染mir-1277-5pmimics)后可明显促进细胞生长，而抑制mir-1277-5p(转染mir-1277-5pinhibitor)后可降低细胞存活能力(见图3)。

虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。

因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。

序列表

<110>北京泱深生物信息技术有限公司

<120>食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>78

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

accucccaaauauauauauauauguacguauguguauauaaauguauacguagauauaua60

uguauuuuugguggguuu78

<210>2

<211>24

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaauauauauauauauguacguau24

<210>3

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

uacguagauauauauguauuuu22

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aaatatatatatatatgtacgtat24

<210>5

<211>24

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aaauauauauauauauguacguau24

<210>6

<211>24

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

auacguacauauauauauauauuu24