一种表达鸭肝炎病毒VP1基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学的技术领域。本发明涉及ⅰ型鸭甲型肝炎病毒和重组aaav(禽腺联病毒)载体，以及该重组病毒载体的构建方法和应用。

背景技术：

鸭甲型肝炎病毒(duckhepatitisavirus,dhav)属于小rna病毒科禽肝炎病毒属鸭甲型肝炎病毒种，主要侵害3周龄以下雏鸭发生急性肝炎，该病以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征。临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，以肝肿胀和出血为特征性病变。1周龄以内的雏鸭病死率高达100％，对养鸭业造成了严重危害。dhav可分为三种血清型：dhav-i(经典的dhv-i)、dhav-ii(新发现于中国台湾的血清型)和dhav-iii(新发现于中国和韩国的血清型)，3个血清型之间存在明显的差异，无交叉免疫性。dhav-i流行较普遍，呈世界性分布，并常与其他病毒、细菌混合感染，对养鸭业危害最大。

dhav-1包含vp0、vp1和vp3三种结构蛋白，其中，vp1蛋白位于病毒粒子表面，为其主要的结构蛋白之一，是决定病毒抗原性的主要成分，与dhav的致病性有密切的关系。而且vp1包含多个中和抗原表位，可诱导机体产生保护性中和抗体，被认为是检测病毒感染的可靠指标。

目前，鸭病毒性肝炎的预防主要以鸡胚化弱毒疫苗为主，但普遍存在安全性低、免疫效果不够理想等缺点，并且异毒株的出现使其免疫失败也逐渐增多。因此，需研制更安全、有效、实用的新型疫苗。

随着dhav-i的全基因组破译，利用分子生物学技术研究出鸭病毒性肝炎新型基因工程疫苗将成为主要研究方向。活载体疫苗由于其自身具备的独特优点，是基因工程苗研究的热点之一。目前已用作重组病毒载体的病毒有疱疹病毒、痘病毒、腺病毒、反转录病毒、腺联病毒等。其中，腺联病毒(adeno-associatedvirus，aav)被公认为最安全的病毒载体，可介导外源基因在体内长期表达，目前在人医上已广泛应用于基因治疗和疫苗研究中。禽腺联病毒(avianadeno-associatedvirus，aaav)于1973年由yatesv等人首次报道，其理化性质、基因组结构等与aav基本相似，提示可作为家禽基因转移载体进行开发应用。2008年，perozo等以重组aaav为载体分别构建了表达ibdv和ndv保护性抗原的基因工程疫苗，均取得了良好的保护效果。本研究所用载体通过删除aaav全部基因组，只保留了两端具有调控作用的反向末端重复序列(invertedterminalrepeats，itr)，因而具有更好的安全性。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供一种表达鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗，以解决弱毒疫苗存在的毒力返强的问题。

本发明的第二目的是提供一种表达鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒的构建方法。

本发明的第三目的载体提供一种表达鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗在制备预防和治疗鸭病毒性肝炎药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种表达鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗，该疫苗由dhav-1主要保护性抗原基因vp1和重组禽腺联病毒载体raaav组成，所述vp1是dhav的致病决定基因。

一种表达鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)获取dhav病毒总rna；

(2)根据dhavvp1基因序列设计一对特异性引物，在起始密码子上游引入kozak序列，引物序列为：

vp1-itr-f:5′-taactcgagaccatgggtgattccaaccagttgggg-3′

vp1-itr-r:5′-cgagcggccgcttattcaatttccagattgagttc-3′；

(3)通过rt-pcr扩增得到dhav-vp1全长cdna基因序列；

(4)将vp1全长cdna序列克隆入含有禽腺联病毒itrs序列的杆状病毒转移载体pfb-aitr中，获得重组质粒pfb-aitr-vp1；

(5)将pfb-aitr-vp1按常规方法转化dh10bac感受态细胞进行同源重组，通过抗性和蓝白斑筛选及pcr鉴定，获得同源重组正确的杆粒bacmiddna，并利用碱裂解法制备杆粒；

(6)将制备的重组bacmiddna在脂质体介导下转染昆虫细胞sf9，72h后收获病毒上清，即为p1代重组杆状病毒rbac-vp1；

(7)将重组杆状病毒rbac-vp1扩增至p3代；

(8)将杆状病毒rbac-vp1与表达禽腺联病毒功能蛋白rep的重组杆状病毒rbac-rep及表达禽腺联病毒结构蛋白的重组杆状病毒rbac-vp分别以感染复数为5，共感染悬浮培养的sf9细胞，72h后，收集细胞沉淀，经3此反复冻融后，离心收获上清，即为含鸭肝炎病毒vp1基因重组禽腺联病毒活载体疫苗。

步骤(3)中，在pcr反应中，反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸10min。

步骤(4)中，在重组质粒pfb-aitr-vp1的构建中，杆状病毒转移载体pfb-aitr包括禽腺联病毒itrs序列、qcmv启动子、egfp开放阅读框和polya加尾信号，即itr-qcmv-egfp-polya-itr。

步骤(4)中，重组质粒载体的构建用到的载体pfb-aitr，是以invitrogen公司bac-to-bac系统中的杆状病毒转移载体pfastbacdual为基础，通过删除该载体本身所带的两个启动子pph和pp10，中间替换以两侧含有禽腺联病毒itrs序列中间携带egfp表达框的dna片段itr-qcmv-egfp-polya-itr。

步骤(8)中，sf9细胞的培养直接在摇瓶中进行，初始接种密度不低于5×10⁵cells/ml，27℃105rpm培养至密度约2×10⁶cells/ml，接种杆状病毒。

本发明的表达鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗在制备预防鸭病毒性肝炎药物中的应用。

本发明的表达鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗在制备治疗鸭病毒性肝炎药物中的应用。

有益效果：本发明具有以下优点：

(1)操作简便，易于进行扩大生产，昆虫细胞sf9是一种悬浮培养细胞，培养要求较低，非常适合生产实践中大规模生产；(2)禽腺联病毒无致病性，安全性较高，能介导外源基因在个组织细胞中长期稳定的表达；(3)与市场现有的弱毒疫苗相比，本发明的重组活载体疫苗更加安全有效。

附图说明

图1为rt-pcr扩增vp1基因的电泳鉴定图；其中，m：1kbdnaladder；1：vp1基因片段；

图2为重组质粒pfb-aitr-vp1的酶切鉴定图；其中，m：1kbdnaladder；1：pfb-aitr-vp1的noti和xhoi双酶切；

图3为重组质粒pfb-aitr-vp1的结构示意图；

图4为重组杆粒bacmiddna的pcr鉴定图；其中，m：1kbdnaladder；1：重组杆粒bacmiddna以m13-f/vp1-f为引物的pcr产物；2：重组杆粒bacmiddna以m13-r/vp1-r为引物的pcr产物；

图5为本发明的表达鸭肝炎病毒vp1基因重组禽腺联病毒的透射电镜图；其中，a:raaav-vp1的透射电镜图(97000×)b:raaav-vp1的透射电镜图(195000×)；

图6为本发明的表达鸭肝炎病毒vp1基因重组禽腺联病毒的westernblot分析图；其中，m：蛋白marker；1：重组禽腺联病毒纯化产物；2：空白对照

图7为本发明的表达鸭肝炎病毒vp1基因重组禽腺联病毒的pcr鉴定图；其中，m：1kbdnaladder；1：重组禽腺联病毒核酸；

图8为本发明的重组禽腺联病毒介导的vp1的体外细胞表达实验，其中，a:重组禽腺联病毒感染的df-1细胞；b：未感染的正常细胞。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：通过常规方法提取dhav病毒总rna。例如：将dhavsh病毒株10倍稀释后，取0.2ml经尿囊腔接种9日龄鸭胚，37℃孵化箱孵化。选择48～72h之内死亡的鸭胚，置于4℃过夜，收集鸭胚肝脏，用剪刀剪碎研磨，将研磨液反复冻融3次后，用按trizol法提取总rna。除上述方法外，还可以采用其他常规方法提取dhav病毒总rna，本发明对于具体方法不做限定。

实施例2：根据genbank中发表的dhav-ish株vp1基因序列设计一对特异性引物，上下游中分别插入noti、xhoi酶切位点，为提高表达效率在起始密码子上游引入kozak序列，vp1基因的引物序列：

vp1-itr-f：5′-taactcgagaccatgggtgattccaaccagttgggg-3′；

vp1-itr-r：5′-cgagcggccgcttattcaatttccagattgagttc-3′。

实施例3：扩增dhav-vp1全长cdna基因序列。以提取的总rna为模板，根据invitrogen公司的rt-pcr试剂盒说明书进行操作，反应体系为：rna4μl、depc7μl、oligodt1μl、5×rtasebuffer4μl、rna抑制剂1μl、dntp2μl、rtase1μl，总体积20μl。反应程序设定为：25℃10min；42℃90min；70℃10min。以扩增的cdna为模板，vp1的上下游引物进行高保真pcr扩增目的基因。50μl反应体系：pfudnapolymerase1μl、10×buffer5μl、dntp(2mmol/l)5μl、primerf2μl、primerr2μl、cdna2μl、去离子水33μl。反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例4：将实施例3扩增的vp1片段，按爱思进dna凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。vp1片段及含有禽腺联病毒itrs序列的杆状病毒转移载体pfb-aitr经noti和xhoi双酶切后，利用获得爱思进dna凝胶回收试剂盒说明书回收vp1dna片段和空载体片段，具体步骤参考是试剂盒说明书。将回收的vp1dna片段和空载体片段进行连接，连接体系如下：t4dnaligase0.2μl、10×buffer2μl、vp12μl、pfb-aitr2μl、去离子水13.8μl，总体积20μl，鉴定正确的重组质粒命名为pfb-aitr-vp1。

实施例5：将pfb-aitr-vp1按常规方法转化dh10bac感受态细胞进行同源重组，通过抗性和蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落，碱裂解法提取杆粒，利用引物对m13-f：5’-gttttcccagtcacgac-3’；m13-r：5’-caggaaacagctatgac-3’，通过pcr对其进行鉴定，反应体系：taqdna酶(5u/μl)0.5μl，m13-f、m13-r(25mmol/l)各2μl，10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(25mm)2μl，dntp(2.5mmol/l)2.5μl，重组bacmiddna1μl，ddw12.5μl，总体积25μl。反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性45s，49℃退火45s，72℃延伸3min，30个循环后，72℃终延伸10min。反应结束后，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例6：制备鉴定正确的重组bacmiddna，在脂质体介导下转染处于对数生长期的昆虫细胞sf9，具体方法参照脂质体转染试剂盒说明书进行。72h后收获病毒上清，即为p1代重组杆状病毒rbac-vp1。

实施例7：参照invitrogen公司bac-to-bac说明书，将p1代rbac-vp1按moi为0.1感染处于对数生长期的sf9细胞，直至约72h后，细胞出现明显病变，收集上清即为p2代重组病毒，按此方法将病毒传至p3代。同样参照invitrogen公司bac-to-bac说明书，空斑试验测定p3代rbac-vp1的病毒滴度为4.77×10¹²pfu/ml。

实施例8：将杆状病毒rbac-vp1与本实验已经制备的表达禽腺联病毒功能蛋白rep的重组杆状病毒rbac-rep及表达禽腺联病毒结构蛋白的重组杆状病毒rbac-vp分别以感染复数为5，共感染悬浮培养的密度为2×10⁶cells/ml的sf9细胞，72h后，收集细胞沉淀，经3次反复冻融后，离心收获上清，即为含鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒raaav-dhavp1。

将纯化的含鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒raaav-dhavp1感染df-1细胞，72h后，以vp1多抗为一抗，fitc标记的羊抗鼠igg为二抗进行间接免疫荧光检测，荧光显微镜下观察到raaav-dhavp1感染的df-1细胞出现较强的荧光，而未感染的细胞中未见荧光，见图8，说明重组禽腺联病毒能介导vp1基因在鸡细胞中表达。

将纯化的含鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒raaav-dhavp1以免疫剂量为2×10¹⁰v.g.经肌肉免疫3日龄spf级雏鸭，以商品化弱毒疫苗a66作为阳性对照，pbs组作为阴性对照，于注射7d和14d后采血通过间接elisa检测抗体效价。elisa结果显示raaav-dhavp1可以刺激雏鸭产生较高滴度的抗体，其水平与弱毒疫苗组相当。如表1。

以上说明，本发明的含鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒可作为预防和治疗鸭病毒性肝炎用药物进行开发。

表1重组禽腺联病毒raaav-vp1免疫雏鸭的抗体检测

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>江苏农牧科技职业学院

<120>一种表达鸭肝炎病毒vp1基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗及其制备方法和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

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taactcgagaccatgggtgattccaaccagttgggg36

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