本发明属于生物技术领域，具体涉及一种唾液链球菌的发酵粗提物及其制备方法和应用。
背景技术：
龋齿，俗称虫牙、蛀牙，是一种细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。如不及时治疗，病变继续发展，形成龋洞，终至牙冠完全破坏消失，其发展的最终结果是牙齿丧失。龋齿特点是发病率高，分布广。该病是口腔主要的常见病，也是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。
引发龋齿的因素众多，如细菌、口腔环境(食物、唾液)、宿主等，其中，细菌是龋齿发生必要条件，一般认为致龋菌有两种类型，一种是产酸菌属，其中主要为变形链球菌(streptococcusmutans，简称s.mutans)、放线菌属和乳杆菌，可使碳水化合物分解产酸，导致牙齿无机质脱矿；另一种是革兰阳性球菌，可破坏有机质，经过长期作用可使牙齿形成龋洞。上述致龋菌中，变形链球菌被国内外学者公认为是引发龋齿的最主要和最重要的病原菌。然而上述这些病原菌并不是直接定植于牙齿表面，而是通过与变形链球菌所产生的生物膜(不溶性多糖)结合形成牙菌斑后，间接地粘附于牙齿表面，随着致龋菌不断在生物膜上的积累，龋齿的程度逐渐恶化。因此，减少其生物膜的产量也可达到防治龋齿的目的。
目前，有关龋齿治疗的研究中绝大部分报道集中于控制或降低口腔中变形链球菌的数量，然而，健康的口腔环境一般是处于有害菌与有益菌达到平衡的状态，有害菌过度的减少会带来口腔菌群失衡，进而引起人体的其他不良反应。此外，临床上使用的一些针对变形链球菌的杀菌药物，如氨硝酸银等化合物，副作用强，长期使用会令牙齿染色，故不适用于前牙治疗。而通过减少变形链球菌生物膜产量同样可降低龋齿患病风险，并且不破坏口腔菌群的固有平衡或产生副作用，但这方面的报道相对较少，尤其是与微生物有关的研究极其有限，可应用的微生物资源相当匮乏。因此，筛选并提供具有抑制变形链球菌生物膜活性的新型乳酸菌菌株并以此制备相应功能的粗提物是当务之急。上述这些都是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
基于上述技术问题，本发明提供了一种唾液链球菌的发酵粗提物及其制备方法和应用，该唾液链球菌的发酵粗提物具有抑制变形链球菌生物膜形成的效果。
具体的，一方面，本发明提供了一种唾液链球菌的发酵粗提物的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将唾液链球菌cgmccno.13308接种于含蔗糖的m17培养基中进行发酵，得到发酵液，将所得发酵液离心取上清液；
(2)向步骤(1)所得的上清液中加入硫酸铵，离心收集硫酸铵饱和度为40～80％时析出的沉淀，将所得沉淀溶解后透析，冷冻干燥即得。
所述唾液链球菌(streptococcussalivarius)cgmccno.13308菌株已于2016年11月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
优选的，步骤(1)中，唾液链球菌cgmccno.13308的接种量为7x106～3.5x107cfu/ml。接种量过多或过少时，唾液链球菌cgmccno.13308菌种的繁殖速度缓慢，使获得的发酵粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。
优选的，步骤(1)中，所述m17培养基中蔗糖含量为0.25～5％(w/v)。蔗糖的含量过高或过低时，均不利于菌种发酵生成粗提物。
优选的，步骤(1)中，所述发酵的温度为26～42℃，发酵的时间为8～24h。发酵温度过高或过低时，唾液链球菌cgmccno.13308菌种的代谢缓慢，会导致发酵粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。
优选的，步骤(1)中，所述发酵为厌氧培养。在厌氧条件下，唾液链球菌cgmccno.13308菌种能够快速繁殖，发酵生成对变形链球菌生物膜形成具有抑制活性的粗提物。
优选的，步骤(1)中，所述离心的速度为8000～12000g，离心的时间为10～20min。在所述优选范围内，能够获得具有抑制变形链球菌生物膜形成活性的发酵上清液。
优选的，步骤(2)中，所述离心的速度为8000～12000g，离心的时间为10～20min。在所述优选范围内，能够获得具有抑制变形链球菌生物膜形成活性的发酵粗提物。
优选的，步骤(2)中，所述透析的截留分子量为8000～12000da，透析时间为1～3d，以便得到分子量大于8000～12000da的发酵粗提物，分子量大于8000～12000da的发酵粗提物具有抑制变形链球菌生物膜形成的活性。
第二方面，还提供了一种由所述任一制备方法制得的唾液链球菌的发酵粗提物。
第三方面，还提供一种所述唾液链球菌的发酵粗提物在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用。10mg/ml的发酵粗提物溶液对变形链球菌生物膜形成的抑制率＞50％。
本发明的有益效果：本发明首次采用唾液链球菌cgmccno.13308菌株制备得到发酵粗提物，该唾液链球菌的发酵粗提物对变形链球菌生物膜形成具有抑制效果，披露了唾液链球菌cgmccno.13308具有发酵产生变形链球菌生物膜形成抑制剂的新用途，拓宽了变形链球菌生物膜形成抑制剂的来源。同时，唾液链球菌cgmccno.13308的发酵粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制活性显著，稳定性佳。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：
在一个具体的实施方式中，本发明提供了一种唾液链球菌的发酵粗提物的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)将唾液链球菌cgmccno.13308接种于含蔗糖的m17培养基中进行发酵，得到发酵液，将所得发酵液离心取上清液；(2)向步骤(1)所得的上清液中加入硫酸铵，离心收集硫酸铵饱和度为40～80％时析出的沉淀，将所得沉淀溶解后透析，冷冻干燥即得。
上述技术方案，首次采用唾液链球菌(streptococcussalivarius)cgmccno.13308，以m17培养基为培养介质，并经离心，硫酸铵沉淀，透析，冷冻干燥制备得到对变形链球菌生物膜形成具有抑制效果的粗提物，披露了唾液链球菌cgmccno.13308的发酵粗提物具有抑制变形链球菌生物膜形成的用途，拓宽了变形链球菌生物膜抑制剂的来源。同时，唾液链球菌cgmccno.13308发酵m17培养基所制备的唾液链球菌的发酵粗提物的活性显著，稳定性佳。
优选的，步骤(1)中，唾液链球菌cgmccno.13308的接种量为7x106～3.5x107cfu/ml；较佳地为1.4x107～2.8x107cfu/ml，更佳地为2.1x107cfu/ml。接种量过多或过少时，唾液链球菌cgmccno.13308菌种的繁殖速度缓慢，使获得的发酵粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。
优选的，步骤(1)中，m17培养基中蔗糖含量为0.25～5％(w/v)，较佳地为0.5～3％(w/v)，更佳地为1％(w/v)。蔗糖为唾液链球菌cgmccno.13308生长提供碳源，蔗糖的含量过高或过低时，均不利于菌种发酵生成粗提物。
优选的，步骤(1)中，所述发酵的温度为26～42℃，较佳地为30～38℃；更佳地为34℃；发酵的时间为8～24h，较佳地为30～38℃；更佳地为34℃。发酵温度过高或过低时，唾液链球菌cgmccno.13308菌种的代谢缓慢，会导致发酵粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。
优选的，步骤(1)中，所述发酵为厌氧培养。唾液链球菌cgmccno.13308为厌氧菌，在厌氧条件下，唾液链球菌cgmccno.13308菌种能够快速繁殖，发酵生成对变形链球菌生物膜形成具有抑制活性的粗提物。
优选的，步骤(1)中，优选的离心的速度为8000～12000g，较佳地为9000～11000g，更佳地为10000g；优选的离心时间为10～20min，较佳地为13～17min，更佳地为15min。在所述优选范围内，能够获得具有抑制变形链球菌生物膜形成活性的发酵上清液。
优选的，步骤(2)中，离心的速度为8000～12000g，较佳地为9000～11000g，更佳地为10000g；离心时间为10～20min，较佳地为13～17min，更佳地为15min。在所述优选范围内，能够获得具有抑制变形链球菌生物膜形成活性的发酵粗提物。
优选的，步骤(2)中，透析截留分子量为8000～12000da，更佳地为10000da。优选的透析时间为1～3d，更佳地为2d；透析以便得到分子量大于8000～12000da的发酵粗提物，分子量大于8000～12000da的发酵粗提物具有抑制变形链球菌生物膜形成的活性。
结合对比例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，唾液链球菌cgmccno.13308发酵m17培养基所制备的粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制效果均发生明显地下降。而在优选范围之内，接种量，蔗糖浓度，培养温度，发酵时间以及硫酸铵饱和度相互影响，使得唾液链球菌cgmccno.13308发酵产生的生物膜抑制活性更佳。
下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。
实施例1
1、材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：
唾液链球菌cgmccno.13308：将唾液链球菌cgmccno.13308的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于m17固体培养基(购买自oxoidco.，英国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mlm17液体培养基(购买自oxoidco.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于m17液体培养基(购买自oxoidco.，英国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为7x108cfu/ml。
变形链球菌cgmcc1.2499：将变形链球菌cgmcc1.2499(购买自cgmcc)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于bhi固体培养基(购买自oxoidco.，英国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mlbhi液体培养基(购买自oxoidco.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于bhi液体培养基(购买自oxoidco.，英国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为6x108cfu/ml。
(2)粗提物对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：将粗提物溶解于ph6.80的pbs缓冲液中配制成浓度为10mg/ml的粗提物溶液，取100μl上述溶液与100μl重悬有变形链球菌(105cfu/ml)的含蔗糖(0.25％w/v)bhi液体培养基同时加入96微孔板中，37℃厌氧培养24h，用去离子水将参与反应的微孔洗涤3次，去除游离细菌，室温下倒扣微孔板，待其自然干燥后，向微孔内加入100μl0.5g/l的结晶紫溶液，室温下染色15min后除去染色液，以大量去离子水冲洗去未吸附的结晶紫，自然干燥后每孔加入200μl无水乙醇溶解吸附的结晶紫，使用酶标仪检测600nm下样品组吸光度值od样品组，以无菌水替代上述粗提物溶液进行相同操作在600nm下测得相应的对照组吸光度值od对照组，用公式“抑制率＝(1-od样品组/od对照组)×100％”计算对生物膜形成的抑制率。
2、变形链球菌生物膜抑制剂粗提物的制备与活性检测
将唾液链球菌cgmccno.13308种子以接种量3％(v/v)无菌接种于含蔗糖1％(w/v)的m17液体培养基中，34℃厌氧培养16h得发酵液。
向上述上清液中缓慢加入硫酸铵，10000g离心15min收集硫酸铵饱和度50～70％时析出的沉淀，该沉淀以蒸馏水复溶后用截留量为10000da的透析袋透析2d，每天换水3次，透析完成后透析袋内溶液冷冻干燥，即得变形链球菌生物膜抑制剂的粗提物a。
经测定，10mg/ml的粗提物a溶液对变形链球菌生物膜形成的抑制率为68％。
实施例2
1、材料与方法：同实施例1
2、变形链球菌生物膜抑制剂粗提物的制备与活性检测
将唾液链球菌cgmccno.13308种子以接种量1％(v/v)无菌接种于含蔗糖5％(w/v)的m17液体培养基中，42℃厌氧培养24h得发酵液，将所得的发酵液12000g离心10min取上清。
向上述上清液中缓慢加入硫酸铵，12000g离心10min收集硫酸铵饱和度40～60％时析出的沉淀，该沉淀以蒸馏水复溶后用截留量为9000da的透析袋透析1d，每天换水4次，透析完成后透析袋内溶液冷冻干燥，即得变形链球菌生物膜抑制剂的粗提物b。
经测定，10mg/ml的粗提物b溶液对变形链球菌生物膜形成的抑制率为58％。
实施例3
1、材料与方法：同实施例1
2、变形链球菌生物膜抑制剂粗提物的制备与活性检测
将唾液链球菌cgmccno.13308种子以接种量5％(v/v)无菌接种于含蔗糖0.25％(w/v)的m17液体培养基中，26℃厌氧培养8h得发酵液，将所得的发酵液8000g离心20min取上清。
向上述上清液中缓慢加入硫酸铵，8000g离心20min收集硫酸铵饱和度60～80％时析出的沉淀，该沉淀以蒸馏水复溶后用截留量为11000da的透析袋透析3d，每天换水2次，透析完成后透析袋内溶液冷冻干燥，即得变形链球菌生物膜抑制剂的粗提物c。
经测定，10mg/ml的粗提物c溶液对变形链球菌生物膜形成的抑制率为61％。
实施例4
1、材料与方法：同实施例1
2、变形链球菌生物膜抑制剂粗提物的制备与活性检测
将唾液链球菌cgmccno.13308种子以接种量2％(v/v)无菌接种于含蔗糖2％(w/v)的m17液体培养基中，38℃厌氧培养12h得发酵液，将所得的发酵液11000g离心13min取上清。
向上述上清液中缓慢加入硫酸铵，11000g离心13min收集硫酸铵饱和度40～70％时析出的沉淀，该沉淀以蒸馏水复溶后用截留量为8000da的透析袋透析2d，每天换水3次，透析完成后透析袋内溶液冷冻干燥，即得变形链球菌生物膜抑制剂的粗提物d。
经测定，10mg/ml的粗提物d溶液对变形链球菌生物膜形成的抑制率为60％。
实施例5
1、材料与方法：同实施例1
2、变形链球菌生物膜抑制剂粗提物的制备与活性检测
将唾液链球菌cgmccno.13308种子以接种量4％(v/v)无菌接种于含蔗糖0.5％(w/v)的m17液体培养基中，30℃厌氧培养20h得发酵液，将所得的发酵液9000g离心17min取上清。
向上述上清液中缓慢加入硫酸铵，9000g离心17min收集硫酸铵饱和度40～70％时析出的沉淀，该沉淀以蒸馏水复溶后用截留量为12000da的透析袋透析1d，每天换水4次，透析完成后透析袋内溶液冷冻干燥，即得变形链球菌生物膜抑制剂的粗提物e。
经测定，10mg/ml的粗提物e溶液对变形链球菌生物膜形成的抑制率为56％。
效果实施例1冷藏条件下粗提物对变形链球菌生物膜抑制效果的稳定性
将实施例1-5制备的粗提物a、b、c、d和e置于冷藏条件(8℃)保存0、5、10和15d后取出，分别测定各样品对变形链球菌生物膜的抑制率，结果如表1所示。
表1冷藏条件下粗提物对变形链球菌生物膜抑制效果的稳定性
由表1可知，所有测试的粗提物在冷藏(8℃)保存15d后，对变形链球菌生物膜抑制活性稳定保持在同一水平，稳定性较好。
对比例1
将实施例1中的接种量，蔗糖浓度，培养温度，发酵时间以及硫酸铵饱和度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的粗提物，将各组所得粗提物参照实施例1所述方法测定对变形链球菌生物膜形成的抑制效果，结果如表2所示。
表2不同方法制备的粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制效果
参照表2所示的结果中可以得出，将所述粗提物的制备方法中接种量，蔗糖浓度，培养温度，发酵时间以及硫酸铵饱和度调整到优选范围之外的时候，所制备的粗提物依然可以抑制变形链球菌及其生物膜的形成，但是效果明显下降。
对比例2
参考实施例1所述方法，比较由唾液链球菌cgmccno.13308、乳酸乳球菌cgmcc1.2472(购买自cgmcc)、嗜热链球菌(s.thermophilus)st-body-3(由科.汉森公司提供)制备的粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制效果，具体操作如下：
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：
将唾液链球菌cgmccno.13308、嗜热链球菌st-body-3和乳酸乳球菌cgmcc1.2472的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于m17固体培养基(购买自merckco.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mlm17液体(购买自merckco.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mlm17液体，37℃培养24h后，培养物9000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
(2)各菌株制备的粗提物对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：同实施例1。
2、各菌株粗提物的制备与活性检测
将各菌株种子以接种量3％(v/v)无菌接种于含蔗糖1％(w/v)的m17液体培养基中，34℃厌氧培养16h得发酵液，将所得的发酵液10000g离心15min取上清。
向上述上清液中缓慢加入硫酸铵，10000g离心15min收集硫酸铵饱和度50～70％时析出的沉淀，该沉淀以蒸馏水复溶后用截留量为10000da的透析袋透析2d，每天换水3次，透析完成后透析袋内溶液冷冻干燥，即得由各菌株制备而成的变形链球菌生物膜抑制剂的粗提物。各组粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制率如表3所示。
表3不同菌株制备的粗提物对变形链球菌生物膜形成的抑制效果
由表3可知，其他常规m17发酵菌株不具有发酵m17产生抑制变形链球菌生物膜形成的物质的能力，而唾液链球菌cgmccno.13308可以发酵m17培养基，最后得到抑制变形链球菌生物膜形成的物质。
以上对本发明所提供的变形链球菌抑制剂及其制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。