本发明涉及紫苏叶油的成分及用途，尤其是以紫苏醛为主要成分的紫苏叶油的用途，属于医药领域。
背景技术：
：紫苏叶为唇形科植物紫苏perillafrutescens(l.)britt.的干燥叶(或带嫩枝)，收载于历版《中国药典》中，同时也收载于15、16版的《日本药典》中。在历版《中国药典》中，对紫苏叶含量测定这部分，仅写明照挥发油测定法测定，保持微沸2.5小时，挥发油含量不得少于0.40％，均没有紫苏叶油中有效成分的含量测定项，在日本药典中，明确了紫苏叶中(干重)有效成分紫苏醛(perillaldehyde)的含量不得低于0.08％。紫苏的植物资源分布广泛，野生资源丰富，同时因紫苏是卫生部公布的药食同源植物，除了供药用，还可用作食用香料、食物色素和作蔬菜食用，消费量大，因此在国内也形成了十分丰富的栽培品系。从植物分类上，《中国植物志》记录紫苏为单种属，种下分4个变种，大致可根据栽培和野生来划分，栽培类型有紫苏p.fruteseensvar.frutescens(l.)britt.和回回苏p.fruteseensvar.crispa(thunb.)hand.-mazz.两个变种，全国各地广泛栽培；野生类型为野生紫苏p.frutescensvar.acuta(thunb.)kudo，和耳齿紫苏p.frutescensvar.auriculato-dentatac.y.wuethsuanexh.w.li.，除东北和西北广布于各地。关于紫苏油的制备方法及从紫苏油中提取紫苏醛的报道如下：在“直通蒸汽法提取紫苏叶挥发油工艺优化及评价”一文中，袁某等公开了采用直通蒸汽方式，不对紫苏叶进行粉碎，提取3小时，蒸汽压力为0.02mpa，收油率高，但是并没有对内容物进行分析。(袁晓燕等，直通蒸汽法提取紫苏叶挥发油工艺优化及评价，《成都医学院学报，2014年03期)200910164797.8(公开号为cn101613638a)公开了一种从绿苏叶中提取天然香料紫苏醛的清洁生产方法，该方法是将绿苏叶采用蒸馏的方法进行提取，馏出液用吸附树脂进行吸附，然后用乙醇进行洗脱，洗脱液采用常压蒸馏的方法回收乙醇，黄色浓缩液即为紫苏醛产品。201310670697.0(公开号为cn104710294a)公开了紫苏醛的提取物方法，具体步骤为：原料压榨，离心机萃取，回流浓缩，吸附洗脱，蒸馏浓缩。关于紫苏叶油的有效成分：在“紫苏叶油的研究进展”一文，伍某等揭示了“国内也有部分研究工作报道，均指出紫苏叶油的有效成分主要是紫苏醛，还有少量的柠檬烯及α-蒎烯等”，当然也提出了“对国产的紫苏叶精油化学成分进行分析，结果发现紫苏叶中不含紫苏醛，而紫苏酮的含量却很高，白苏不含紫苏醛，而含紫苏酮”，说法不一。同时，该文也写明，在药理上，紫苏叶油与紫苏醛都具有明显的抗皮肤真菌作用，紫苏醛与柠檬醛对皮肤丝状真菌生长有协同抑制作用。(伍永富等，紫苏叶油的研究进展，时珍国医国药，2007年18卷8期，2019-2020)于占洋等报道紫苏醛是紫苏中的有效成分，约占挥发油重量的50％(这段内容经常被引用)，但据作者对我国产的样品进行分析表明，紫苏并不含紫苏醛，紫苏酮的含量却较高，而白苏则含紫苏醛，紫苏酮的含量则不高。(于占洋等，紫苏属植物的研究及其新进展，国外医学.药学分册，1986年03期)也有将根据紫苏叶油中含有的成分进行分型的，如分为7个化学型：1、pa型，以紫苏醛(含量16-93％)为主要成分，有时含微量紫苏酮，有28份属于该型；2、pk型，以紫苏酮(含量12-90％)为主要成分，有时含微量紫苏醛，有10份属于该型；3、papk型，既含紫苏醛(含量11.5-29.6％)也含紫苏酮(含量6.2-30.2％)，有8份属于该型；4、pl型，主含紫苏烯(含量66.93％)，只有1份样品属于该型，属于少见类型；5、pp型：pp-a型：主要成分为芹菜脑(apiole，21.75％-81.65％)，有6份属于该型；pp-m型，主要成分为肉豆蔻醚(73.03％-83.22％)，有3份是属于该型；pp-e型:主要成分为榄香素(60.06％、67.38％)，有2份属于该型；pp-as型，主要成分为细辛脑(asarone，23.91％)，有1份样品属于该型；6、pt型，主要成分为薄荷烯酮(41.73％-46.55％)，柠檬烯(26.3％-38.03％)，有2份属于该型；7、f型：主要成分为2-己酰呋喃(2-hexanoylfuran，39.11％-50.45％)，有2份属于该型。因此，国产紫苏的化学型以pa、pk、papk、pp型为主要化学型(见魏长玲等，紫苏叶挥发油的不同化学型及研究进展，中国中药杂志，2015年8月，第40卷第15期，2937-2944)。发明人对紫苏叶油进行研究，得到一种新的紫苏叶油及应用。技术实现要素：为了解决上述提及的紫苏叶油药源广泛，成分分布复杂，无可靠安全有效的紫苏叶油的统一标准的问题，本发明的一个目的在于提供一种药效成分明确，安全有效的紫苏叶油。现有技术中，紫苏叶油中含有的紫苏醛的含量是16-93％，其他成分未进行限定，本发明是现有技术基础上的选择发明。本发明提供一种新的紫苏叶油，各组分的重量百分比如下：紫苏醛29-70％，石竹烯2-27％，紫苏烯或紫苏酮0-5％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为40-85％。优选地，本发明的新的紫苏叶油，各组分的重量百分比如下：紫苏醛35-70％，石竹烯7-27％，紫苏烯或紫苏酮0-5％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为45-85％。进一步优选的，本发明的新的紫苏叶油，各组分的重量百分比如下：紫苏醛40-62％，石竹烯10-27％，紫苏烯或紫苏酮0-4.1％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为56-85％。再进一步优选，本发明的新的紫苏叶油，各组分的重量百分比如下：紫苏醛40-55％，石竹烯14-22％，紫苏烯或紫苏酮0-4.1％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为60-70％。更进一步优选，本发明的新的紫苏叶油，各组分的重量百分比如下：紫苏醛40-53％，石竹烯14-22％，紫苏烯或紫苏酮0-4.1％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为60-70％。最佳优选为，本发明的新的紫苏叶油，各组分的重量百分比如下：紫苏醛46-49.2％，石竹烯14.5-22％，紫苏烯或紫苏酮0-4.1％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为62-68％。上述紫苏叶油中：所述石竹烯为β-石竹烯(β-caryophyllene)，结构如下：本发明还提供了上述紫苏叶油的制备方法，该方法包括以下步骤：将紫苏叶用水蒸气蒸馏，蒸汽压力保持在0.1mpa，从滴油开始计时，蒸馏3-5小时，温度100-120℃，蒸汽冷凝后收集馏出液，药渣弃去，馏出液静置20分钟以上，得到水层、挥发油层和乳化层，分离出挥发油层、乳化层此外，本发明还创造性地将水层收集进行二次水蒸气蒸馏，蒸馏时间为30分钟分离挥发油层、乳化层并分别与第一次水蒸气蒸馏得到的挥发油层、乳化层混合，弃去水层，将乳化层静置，乳化层静置12h以上，合并挥发油层即得紫苏叶油。所述紫苏叶优选湖南汉寿县、湖南桃源县、湖南鼎城、江苏连云港、这将潮州、河南南阳、广西玉林、安国石佛镇、重庆涪陵、山东烟台等地的紫苏叶。不限绿色、单面绿色单面紫色或双面紫色的紫苏，也不限野生紫苏(p.frutescensvar.acuta)、会会苏(p.frutescensvar.crispa)、紫苏(p.frutescensvar.frutescens)。所述馏出液静置时间优选为20-30分钟。所述乳化层静置时间优选为12h-18h。本发明还提供了上述紫苏叶油在制备抗菌、抗炎、促进小肠蠕动、解热的药物中的应用。所述药物不限于紫苏油单品，还包括复方，如藿香正气系列品种，特别是应用于藿香正气滴丸中。本发明的又一目的在于提供一种紫苏叶油制剂，所述紫苏叶油制剂是以本发明的紫苏叶油为活性成分，与药学上可接受的载体一起采用常规方法制备成药学上可接受的各种药物制剂。结合实施例及实验例对本发明的具体实施方式进一步进行说明，以便更清楚地描述本发明的优点和特点。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明的有益效果在于：1、因紫苏药材资源广泛，种类繁多，且成分分布差异较大，而在《中国药典》中又尚未纳入有效成分的含量测定项，紫苏叶油常直接作为原料入药，如藿香正气系列产品、杏苏感冒冲剂、风寒感冒颗粒、散风宁嗽糖浆、解肌宁嗽片等就以紫苏叶油为组方成分，仅藿香正气系列上市品种就有650家之多。紫苏叶油成分的差异势必影响药效的差异及毒性差异，如wilsonbj研究报道紫苏酮对小鼠具有强效肺选择毒性，而在此之前，大家在使用紫苏叶油时仅按照紫苏叶中总挥发油的含量来检验紫苏叶，用检验合格的紫苏叶去提取挥发油用于成方制剂，不去关注挥发油中的成分，可能会发生潜在的风险，长期使用势必会导致身体伤害，因此，正本溯源迫在眉睫，探讨紫苏叶油物质基础与药效之间的关系，进而确定用于制备紫苏叶油的紫苏药材的基原和产地，并进一步制定紫苏叶油的质量标准，为含紫苏叶油的成方制剂提供可靠的原料及研究基础。2、本发明的意义在于：(1)创建了紫苏叶油的制备方法，同时明确了各种紫苏叶油的药理活性和毒性，比如紫苏烯型紫苏叶油、紫苏醛型紫苏叶油、紫苏酮型紫苏叶油，发现：紫苏醛型紫苏叶油效果好，毒性低，为紫苏叶油在制剂中的应用提供了明确指导。(2)提高了含紫苏叶油的复方中药的用药安全性和有效性。(3)为紫苏药材和紫苏叶油质量标准的完善提供了可靠的研究基础。(4)不同化学型的紫苏叶油的药理活性研究，为紫苏叶油的深入开发指明了方向。3、本发明人在项目开展过程中又选取四份不同化学成分类型的紫苏叶(样品1，紫苏烯、紫苏酮、紫苏醛三者均有；样品2：紫苏烯；样品3：紫苏醛；样品4：紫苏酮)对其进行了dna提取及序列扩增，通过将测序峰图进行预处理及拼接后，与中药材dna条形码鉴定系统进行序列对比，结果证明四份紫苏叶样品均为正品紫苏。由此可见，生药鉴定为正品的紫苏叶，其体内化学成分也会不一致。4、关于本发明的制备方法：蒸汽压力：如果压力过高，挥发油提取器中的液体会上涌，提取出来的挥发油会随水液一起冲出冷凝器而收集不到，造成资源浪费，蒸汽压力如果过低，导致提取效率低下，提取不充分，挥发油收率较低，发明人进行研究发现，0.1mpa是提取紫苏叶挥发油最适宜的压力。提取时间：是通过肉眼观察挥发油提取器中挥发油的液面不再上升时，即为提取终点；提取温度的确定是通过记录稳定提取压力对应的蒸汽温度，所以当提取压力稳定时，根据理想气体状态方程pv＝nrt，提取温度也是稳定的。本发明区别于现有技术的关键优势在于提取到的挥发油的后续纯化处理：除水。水因其易引起药物水解及易感染微生物常常导致药物稳定性变差，而紫苏叶油具有部分水溶性，所以在用水蒸气蒸馏提取挥发油时，挥发油层会含有部分水分，同时在挥发油提取器中会出现很厚的乳化层，乳化层即挥发油和水的混合层，并且同时因部分紫苏叶油溶于水层而使水层中也混有部分紫苏叶油，为了保证挥发油收率，必须将水层的挥发油及乳化层中的挥发油分离出来，将水层的挥发油分离出来，本发明人采取的方式是二次水蒸气蒸馏的方式，技术方案为：将水层单独收集起来置于水蒸气蒸馏装置中，蒸馏30分钟，将水层弃去，挥发油层、乳化层分别与第一次蒸馏得到的挥发油层、乳化层合并处理。在分离水层中混合的挥发油时，本发明人除了尝试二次水蒸气蒸馏的方式外，还尝试了有机溶剂萃取的方式，但是因有机溶剂萃取会引入杂质及溶剂残留，带来安全性风险，且因本发明紫苏叶油的挥发性，当与石油醚、乙酸乙酯有机溶剂混合时，有机溶剂的回收会将部分挥发油带走，造成挥发油的收率降低。因此，从挥发油的收率和安全性角度综合考虑，选择二次水蒸气蒸馏的方式进行水层中挥发油的分离。二次水蒸气蒸馏的时间也是通过工艺验证的方式，以挥发油的收率为指标进行细致的考察，结果表明，30分钟以后挥发油的收率不再增加，从提高收率和生产效率角度综合考虑，将二次蒸馏的时间定为30分钟。为了保证挥发油的稳定性必须保证挥发油层和乳化层中的水彻底分离出去，本发明人曾经尝试过加入不同干燥剂、静置分离的手段等多种方式去分离乳化层，结果表明，静置分离的手段既简单可行，又不会引入其他不稳定因素。经过5、10、15、20、25、30、40分钟等详细的工艺验证，结果表明馏出液静置20分钟以上，挥发油层的水分才能被完全去除，乳化层经过4、8、12、16、20、24小时的详细工艺验证，结果表明静置12h-18h，分离得到的紫苏叶油的收率及稳定性最好。因此，综合考虑紫苏叶油质量和生产效率，馏出液静置时间设定为20分钟以上，乳化层的静置时间设定为12h以上，且优选为12h-18h。采用本发明提供的方法制备的紫苏叶油收率高，含水量少，纯度高。5、将本发明提供的紫苏叶油与现有紫苏叶油进行比较，本发明在抗菌、消炎、促进小肠蠕动、解热上面，效果均优于现有技术。具体实施方式实施例1：紫苏叶油的制备方法1)称量：称取10kg紫苏叶，备用；2)蒸馏：将紫苏叶投入已经清洁过的提取罐中，用水蒸气蒸馏，蒸汽压力保持在0.1mpa，从滴油开始计时，蒸馏3-5小时，温度100-120℃；3)收油：蒸汽冷凝后收集馏出液，药渣弃去，馏出液静置20分钟，得到水层、挥发油层和乳化层，分离出挥发油层，弃去水层，将乳化部分层放入分液漏斗中继续静置；乳化层静置12h，弃去水层，合并挥发油层即得紫苏叶油(收率是0.5％)。实验例1：内容物检测按照实施例1的方法，对湖南汉寿县、湖南桃源县、湖南鼎城、江苏连云港、这将潮州、河南南阳、广西玉林、安国石佛镇、重庆涪陵、山东烟台等地的紫苏叶进行处理，提取制备得到的紫苏叶油进行检测，具体检测方法为：1、供试品溶液的制备：取紫苏叶油约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2、对照品溶液的制备：取紫苏醛对照品适量，精密称定，加正己烷制成每1ml含紫苏醛4mg的溶液，即得。3、gc/ms分析方法：色谱条件：色谱柱，hp-5ms(30m*250μm*0.25μm)，载气为氦气，程序升温，进口温度为200℃，起始温度为50℃，10℃/min升到100℃，保留3min，5℃/min升到200℃，保留3min，分流比：20：1，进样1μl。质朴条件，离子源为ei:70ev，接口温度250℃，质量扫描范围：50-500amu，溶剂延迟时间3min。4、分析结果：采用gc/ms法对紫苏叶挥发油样品进行分析，通过数据库nist2.0进行检索，核对相关文献资料，鉴定出化合。检测结果见表1-1、1-2、1-3。表1-1多个样品中的紫苏叶油各成分含量成分分子式样品1样品2样品3样品4样品5样品6样品7样品8紫苏醛c10h14o40.9758.0049.1746.854.8240.1347.4843.08石竹烯c15h2420.752718.7920.0419.0020.6914.6626.27紫苏烯c10h14o————————————————紫苏酮c10h14o23.91--1.912.852.573.634.11.09表1-2多个样品中的紫苏叶油各成分含量成分样品9样品10样品11样品12样品13样品14样品15样品16紫苏醛41.9670.0049.0361.2453.0039.5054.0051.86石竹烯14.123.1516.1714.7316.8210.152.318.77紫苏烯————————————————紫苏酮0.91——1.912.850.91——1.231.54表1-3多个样品中的紫苏叶油各成分含量成分样品17样品18样品19样品20样品21样品22样品23紫苏醛35.0047.0229.5332.6450.0046.0035.00石竹烯10.927.6527.008.995.728.7712.99紫苏烯——————————————紫苏酮1.930.860.240.250.570.631.31注：--为未检出实验例2：水分的检测1、检测方法为卡尔费休氏非水滴定法，测定程序如下：(1)标定：用20微升纯化水用减重法进行标定，重复测定三次，三次的标定含量的rsd不大于1.0％时，方可进行样品测定。(2)样品测定：称取0.1g样品进行测定，每份样品重复测定三次，三次的含量rsd不大于1.0％时，记录三次测定值的均值，即为样品的水分含量(％)。2、检测结果：见表2-1、2-2、2-3表2-1：二次水蒸气蒸馏时间对总挥发油收率的影响说明：1、挥发油收率＝挥发油的重量/提取用紫苏叶的重量×100％2、0时刻的挥发油收率即为第一次水蒸气蒸馏得到的挥发油收率。表2-2：馏出液静置时间对水分的影响表2-3：乳化层静置时间对水分的影响——：表示未检出。表2-1结果显示：二次水蒸气蒸馏时间在30分钟以上，水层中的挥发油才能被完全分离出来，30分钟以上，挥发油的收率不再增加，因此，从提高收率和提高效率考虑，将二次水蒸气蒸馏的时间优选为30分钟。表2-2结果显示：馏出液静置20分钟以上，挥发油层的水分才能被完全去除，优选时间为20-30分钟。表2-3结果显示：乳化层静置时间小于12h时，所得紫苏叶油的水分值高于3％，影响紫苏叶油的稳定性；乳化层静置时间超过18h时，所得紫苏叶油的水分值不再降低，出于节省时间提高效率考虑，将乳化层静置时间优选为12h-18h。实施例2藿香正气滴丸的制备1、处方：苍术160g、陈皮160g、姜厚朴160g、白芷240g、茯苓240g、大腹皮240g、生半夏160g、甘草浸膏20g、广藿香油1.6ml、紫苏叶油0.8ml(紫苏醛含量约47.02％，实验例1表1-3的样品17)。2、制备方法：(1)以上十味，苍术、陈皮、白芷、姜厚朴加70％乙醇回流提取二次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.15(75℃)，备用；茯苓、大腹皮加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，煎液滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05(75℃)，加入甘草浸膏，混合备用；生半夏加水浸泡，每8小时换水一次，泡至透心后，另加干姜13.5g，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，煎液滤过，滤液浓缩至相对密度为1.04(75℃)，加入乙醇使含醇量达60％，静置，取上清液，回收乙醇，药液与上述浓缩液合并，浓缩至相对密度为1.32的稠膏。(2)称取聚乙二醇6000765g，85℃加热使熔融，加入广藿香油、实施例1制备的紫苏叶油及上述稠膏，混匀，滴制成丸，包薄膜衣，制成约1066g，即得。实施例3杏苏感冒冲剂1、处方：苦杏仁63g、陈皮47g、紫苏叶油3.1ml(紫苏醛含量约46％，实验例1表1-3的样品22)、前胡63g、桔梗47g、甘草16g。2、制备方法：取苦杏仁捣碎，加温水浸泡24小时，水蒸气蒸馏，收集蒸馏液50ml至90％乙醇0.8ml中，再重蒸馏一次，收集重蒸馏液事业，测定重蒸馏液氢氰酸含量，加水稀释至每1ml含氢氰酸3.0mg的苦杏仁重蒸馏液，备用；前胡、陈皮提取挥发油，药渣与桔梗、甘草加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量，加入蔗糖适量，制成颗粒，干燥放冷，喷入上述苦杏仁重蒸馏液17ml及紫苏叶油、陈皮、前胡挥发油，混匀，制成1000g，即得。实施例4：紫苏叶油软胶囊1、称量：称取紫苏叶油1kg(紫苏醛含量约54.00％，实验例1表1-2的样品15)，一级成品菜籽油1kg，明胶150lb82kg，甘油0.6kg，纯化水：3.3kg，备用；2、化胶：将处方量的甘油、纯化水置于化胶罐中，混合均匀，加热升温至80℃，开启搅拌，均匀地投入明胶，升温至胶液温度保持在80-90℃，至胶液透明无胶粒时关闭搅拌，静置1小时；3、化料：将处方量的紫苏叶油和菜籽油置于化料罐中，搅拌均匀，密闭静置；4、滴制：将胶液和药液投入软胶囊滴制设备中，保持冷凝液温度在8-18℃单位内，胶槽内胶液温度在65-75℃范围内，开始滴制；5、定型、干燥：将胶丸置于滚动转笼内，进行吹风定型。每笼中每次放入适量块方巾擦拭胶丸表面，时检查方巾表面的清洁状态并及时更换，将定型后的胶丸置于干燥箱中进行干燥，干燥风的温度不超过34℃，相对湿度不超过35％，干燥至胶片水分<10％即得紫苏叶油软胶囊。实施例5：紫苏叶油胶囊1、紫苏叶油β-环糊精包合物制备：称取1kgβ-环糊精，置于容器中，加入适量蒸馏水，水浴加热使β-环糊精溶解，制备β-环糊精的包合水溶液，然后缓缓滴入紫苏叶挥发油100ml(溶于1倍体积95％乙醇中)，在相应温度下以75rpm的速度搅拌包合4小时后，至冰箱中冷藏24小时，抽滤，分别用适量水、乙醚洗涤包合物沉淀至无挥发油气味，于40℃干燥6小时，即得包合物；2、灌囊：将1)的包合物与适量滑石粉混合均匀后，灌入胶囊，即得紫苏叶油胶囊。实验例3：不同化学类型的紫苏叶油的解热实验、促进小肠推进实验、抗炎实验一、材料与方法1、受试品：紫苏提取物，中国医学科学院药用植物研究所鉴定研究室提供批号：20151206。pl水提物：每100克生药得20.03g水提取物(pl为紫苏烯)；pa水提物：每100克生药得16.53g水提取物(pa为紫苏醛)；pk水提物：每100克生药得22.52g水提取物(pk为紫苏酮)；pl油：每100克生药得0.361g提取物，其中经检测pl含量为71.21％。pa油：每100克生药得0.312g提取物，其中经检测pa含量为74.32％。pk油：每100克生药得0.609g提取物，其中经检测pk含量为76.18％。2、实验动物：sd大鼠，非近交系封闭群，雄性。体重：180-200g，190只；icr小鼠，非近交系封闭群，体重：18-20g，216只。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号:scxk(京)2012-0001。3、测试仪器：mettlertoledoal104梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；手动打孔器德州润昕实验仪器有限公司生产。4、药品及试剂：二甲苯(500ml)分析纯北京长海化工厂，批号：141204解热止痛片：佳木斯制药厂生产,规格:0.423g/片,批号:120809。强的松片:浙江仙琚制药股份有限公司,批号：150115麻仁润肠丸:北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，国药准字z11020159，批号:15015655，规格:每丸重6克。5、剂量设计：药典规定紫苏生药用量为5-10g生药/人/天，折算为大鼠等效量为1.025g生药/kg。首次实验：实验用量为人用等效量的2倍剂量，即2.05g生药/kg，折算提取物用量进行实验。二次实验：实验用量为人用量的等效量，即1.025g生药/kg，折算提取物用量进行实验。6、试验方法:1)对酵母所致大鼠发热模型的作用：选用体重180-200g大鼠，先测量正常体温(一般为36.6～38.3℃，肛表插入肛门内6cm左右)。选用体温合格者，在背部皮下注射10％酵母混悬液5ml/kg,待体温上升后选择升温显著者(0.8℃以上)大鼠，随机分为10组,分别给予待试药、对照药等,给药后1、2、3、4h测体温一次，记录体温变化,以观察柴胡提取物的作用。2)对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用：每组15只小鼠，雌雄各半，灌胃给药，对照组给以蒸馏水灌胃，阳性对照组选用强的松，各组每鼠于灌胃后1h，涂抹20ul二甲苯于右耳，1h后处死，剪下每鼠双侧外耳，用8mm打孔器取每鼠外耳中部皮肤称重，计算左右耳重的差值，计算对肿胀的抑制率。{(右耳重-左耳重)/左耳重}作为肿胀率(％)表示,比较给药组与对照组肿胀率的差异。3)对小鼠小肠运动的作用：取禁食20小时体重相近的小鼠96只，随机分为8组，每组12只，苦味酸标记。各组分别灌服含50％碳素墨汁的药物混悬液0.2ml/10g体重。给药后30min脱颈椎处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管，置于托盘上。轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度作为“小肠总长度”。从幽门至墨汁前沿的距离作为“墨汁在肠内推进距离”，用公式计算墨汁推进百分率。每组取均值进行比较。给药途径与体积：口服灌胃，大鼠，1ml/100g，小鼠0.2ml/10g，对照组给以等体积蒸馏水。统计方法：所有数据采用spss13.0统计软件处理，组间比较采用t检验，计量资料用表示。二、结果1、紫苏提取物对酵母所致发热大鼠体温增高值的影响：见表3-1表3-1紫苏提取物对酵母所致发热大鼠体温增高值的影响(n＝10)aa：与对照组比较，p<0.01b：与模型组相比，p<0.05；bb，与模型组相比，p<0.01由以上结果可见，与对照组大鼠比较，模型组大鼠体温在造模5h后明显升高，有统计学差异(p＜0.01)。与模型组相比，阳性对照组解热止痛片可明显降低干酵母所致的大鼠体温升高，给药后1h即起效，并可持续4小时降温，提示模型成功。与模型组比较，紫苏提取物挥发油部分及pk水提部分有降低发热大鼠体温的作用，挥发油部分给药后1小时开始起效，pa型四个时间点均有显著性差异(p<0.01)，pk型给药后1-2小时有差异(p<0.05)、3-4小时有极显著性差异(p<0.01)，挥发油各型之间比较解热作用没有统计学差异。pl型给药后1-3小时有统计学意义(p<0.05)，pk水提部分给药后3-4小时解热作用有统计学意义(p<0.05)，pa及pl水提部分未表现有解热作用。2、紫苏提取物对酵母所致发热大鼠体温增高值的影响：见表3-2表3-2紫苏提取物对酵母所致发热大鼠体温增高值的影响(n＝10)与对照组比较，aap<0.01与模型组相比，bp<0.05，bbp<0.01由以上结果可见，与对照组大鼠比较，模型组大鼠体温在造模5h后明显升高，有统计学差异(p＜0.01)。与模型组相比，阳性对照组解热止痛片可明显降低干酵母所致的大鼠体温升高，给药后1h即起效，并可持续4小时降温，提示模型成功。在降低各实验组给药剂量后，紫苏提取物pk挥发油部分有降低发热大鼠体温的作用，给药后2小时开始起效，与模型组比较，在2h、3h点有差异(p＜0.05)，在4h点有显著性差异(p＜0.01)，作用持续而稳定，pa挥发油在给药后2h点有显著性差异(p＜0.01)，但是在随后的时间段体温显著反弹，呈上升趋势。在实验剂量下水提各部分均未表现出明显的解热作用。结果提示：紫苏提取物的解热作用与其不同的化学成分构成及实验剂量密切相关。3、紫苏提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用：见表3-3表3-3：紫苏提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用(n＝15)分组剂量对照侧耳(mg)致炎侧耳(mg)肿胀百分率(％)对照组---45.96±2.8587.56±9.1590.95±21.06强的松25mg/kg44.07±3.0264.73±9.0747.36±21.85aapl水提物0.8212g/kg42.51±2.9781.81±11.7092.34±24.00pl油0.36mg/kg42.84±3.3179.74±17.3386.33±38.46pa水提物0.6778g/kg42.45±4.7275.07±9.8577.67±21.88pa油12.792mg/kg43.29±3.4974.51±9.5573.71±28.93pk水提物0.9234g/kg43.62±3.5878.29±10.7580.57±27.40pk油24.96mg/kg42.84±5.9675.36±12.6576.74±24.78aa：与对照组比p＜0.01由以上结果提示，紫苏各型挥发油及水提物未见明显抑制小鼠二甲苯所致小鼠耳肿胀的作用。4、紫苏提取物对小鼠小肠推进的作用：见表3-4表3-4：紫苏提取物对小鼠小肠推进的作用(n＝12)分组剂量小肠全长(cm)推进长度(cm)肿胀百分率(％)对照组---43.23±6.3817.03±6.2339.95±14.49麻仁润肠丸5.6g/kg42.12±7.2126.17±7.3863.99±18.97aapl(水)0.8212g/kg42.25±4.7818.96±6.6744.61±13.14pl(油)0.36mg/kg42.13±5.4219.04±4.7645.09±9.53pa(水)0.6778g/kg42.63±5.6818.75±5.1044.56±13.26pa(油)12.792mg/kg43.33±5.1521.17±5.6549.15±12.75pk(水)0.9234g/kg43.42±4.7820.42±5.2147.38±12.94pk(油)24.96mg/kg42.88±6.0426.71±7.9563.72±21.33aaaa：与对照组比p＜0.01实验结果提示：紫苏各型水提物及挥发油提取物中，仅pk挥发油具有明显促进小肠推进的作用，与对照组比较有极显著性差异(p<0.01)，具有统计学意义。在人用等效量2倍剂量下，紫苏挥发油pa、pk、pl型及紫苏水提物pk型对酵母所致大鼠发热模型均有一定的解热作用，由解热作用的起效时间及持续时间上看，作用强度依次为pa(油)>pk(油)>pl(油)>pk(水)，但是各型间作用没有统计学差异；在人用量等效剂量下，紫苏挥发油pa、pk型对酵母所致大鼠发热模型均有一定的解热作用，其余各部分未表现出明显的解热作用。三、结论解热：在人用等效量2倍剂量下，紫苏挥发油pa、pk、pl型及紫苏水提物pk型对酵母所致大鼠发热模型均有一定的解热作用，由解热作用的起效时间及持续时间上看，作用强度依次为pa(油)>pk(油)>pl(油)>pk(水)，但是各型间作用没有统计学差异；在人用量等效剂量下，紫苏挥发油pa、pk型对酵母所致大鼠发热模型均有一定的解热作用，其余各部分未表现出明显的解热作用。促进小肠推进：紫苏挥发油pk型具有促进小鼠小肠推进的作用。抗炎：紫苏挥发油及水提物各型对二甲苯所致小鼠耳肿胀未表现出明显抑制作用。综上，在解热、抗炎、促进小肠推进方面，紫苏烯型的紫苏叶油均无效，紫苏酮型的紫苏叶油效果最好，紫苏醛型的紫苏叶油效果次之，但据文献报道，酮型的紫苏叶油有毒性，发明人又进行了醛型和酮型的毒理学研究试验。实验例4：紫苏醛型紫苏叶油和紫苏酮型紫苏叶油的急性毒性研究实验1、实验动物：icr小鼠，spf级，雌雄各半，体重18-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。2、实验样品：紫苏醛型紫苏叶油：紫苏醛含量为47％，批号：20141025；紫苏酮型紫苏叶油：紫苏酮的含量为44％，紫苏醛含量为2.8％，紫苏烯含量为1.1％，批号：20140901。3、给药方法：一天内单次给予受试物，以达到设计给药剂量。实验分组及剂量设定：根据紫苏叶油中紫苏醛的理化性质和成分含量结合文献设定预实验给药剂量，通过预试验找出各受试物0死亡的最小剂量(dn)和100％死亡的最大剂量(dm)的估计值。试验以受试物原液为初始剂量，按照18.32g/kg(1/2原液)7.328g/kg(1/5原液)、3.664g/kg(1/10原液)、1.832g/kg(1/20原液)、732.8mg/kg(1/50原液)、366.4mg/kg(1/100原液)对各受试物进行梯度稀释，每个剂量选取2只动物(雌性各半)，根据24h内死亡情况，以确定ld50可能范围：紫苏叶油bdn为732.8mg/kg(1/50原液)，dm为3.664g/kg(1/10原液)。根据预实验结果，该样品急性毒性ld50在0.733～3.664g/kg之间，设最大给药剂量为5.64g/kg，设组间距i＝0.65，药物剂量组共设6组，分别为5.64、3.66、2.38、1.55、1.01和0.65g/kg。取雌雄小鼠各5只，每组10只动物。按受试物给予方法给予受试物后观察。同样，根据紫苏叶油中紫苏酮的理化性质和成分含量结合文献设定预实验给药剂量，通过预试验找出各受试物0死亡的最小剂量(dn)和100％死亡的最大剂量(dm)的估计值。试验以受试物原液为初始剂量，按照7.72g/kg(1/5原液)、3.86g/kg(1/10原液)、1.93g/kg(1/20原液)、772mg/kg(1/50原液)、386mg/kg(1/100原液)、193mg/kg(1/200原液)、77.2mg/kg(1/500原液)、38.6mg/kg(1/1000原液)、19.3mg/kg(1/2000原液)对各受试物进行梯度稀释，每个剂量选取2只动物(雌性各半)，根据24h内死亡情况，以确定ld50可能范围：紫苏叶油adn为38.6mg/kg(1/1000原液)，dm为77.2mg/kg(1/500原液)。根据预实验结果，该样品急性毒性ld50在38.6～77.2mg/kg之间，设最大给药剂量为114.37mg/kg，设组间距i＝0.75，药物剂量组共设6组，分别为114.37、85.78、64.33、48.25、36.19和27.14mg/kg。取雌雄小鼠各5只，每组10只动物。按受试物给予方法给予受试物后观察。其基本运算公式为：lgld50＝∑1/2(xi+xi+1)(pi+1-pi)其中，xi为剂量对数，pi为死亡率。ld50的95％可信限＝lg-1(lgld50±1.96×sm)其中，sm：标准误差；d：对数差；n：实验动物数4、实验结果：4.1紫苏醛型紫苏叶油急性毒性实验动物死亡分布情况见表4-1。表4-1紫苏醛型紫苏叶油急性毒性试验动物死亡分布情况表4-1结果显示：经口给予紫苏醛型紫苏叶油，5.64g/kg组15min后小鼠出现自主活动减少，并伴有静卧，20min后多数小鼠出现运动失调，甚至有强制性抽搐等症状，2小时后开始出现死亡，给药当日10只小鼠全部死亡。3.66g/kg剂量组给药后10min后小鼠出现自主活动减少，静卧等症状，其中1只出现抽搐症状，3小时后开始陆续死亡，给药后当日10只小鼠全部死亡。2.38g/kg剂量组给药20min后小鼠出现自主活动减少，静卧等症状，给药当日4只小鼠死亡，给药后第一天4只小鼠死亡。1.55g/kg剂量组给药大约15min后小鼠有静卧等异常反应，但没有出现死亡。1.01g/kg剂量组也出现自主活动减少、静卧等异常症状；0.65g/kg剂量组1只出现自主活动减少外，未见明显异常症状。存活动物继续观察，饲料消耗量正常，体重平稳增长，外观、行为、分泌物、排泄物均未见明显异常。根据寇氏法计算得到ld50为2090mg/kg，95％可信限：2360mg/kg～1860mg/kg。4.2紫苏酮型紫苏叶油急性毒性实验动物死亡分布情况见表4-2表4-2紫苏酮型紫苏叶油急性毒性试验动物死亡分布情况表4-2结果显示：经口给予紫苏酮型紫苏叶油，114.37mg/kg组14min后小鼠出现出汗、兴奋、梳理毛发，25min后出现闭目、自主活动减少等症状，给药当日7只小鼠死亡，给药后第一天3只小鼠死亡。85.78mg/kg剂量组给药后40min小鼠出现出汗、兴奋等症状并伴有梳理毛发，给药后当日3只小鼠死亡，给药后第一天3只小鼠死亡，第二天2只小鼠死亡。64.33mg/kg剂量组给药后小鼠出现自主活动减少，梳理毛发并有出汗等症状，给药当日2只小鼠死亡，给药后第一天2只小鼠死亡。48.25mg/kg剂量组给药后小鼠有出汗，梳理毛发等异常反应，但没有出现死亡。36.19和27.14mg/kg两个剂量组均出现自主活动减少、出汗、梳理毛发等异常症状；存活动物继续观察，饲料消耗量正常，体重平稳增长，外观、行为、分泌物、排泄物均未见明显异常。根据寇氏法计算得到ld50为70.13mg/kg，95％可信限：24.249g/kg～19.059g/kg。5、实验总结：根据上面的实验可知：紫苏烯型紫苏叶油效果较差，紫苏酮型紫苏叶油虽然也有效果，但是毒性较大，紫苏酮型紫苏叶油的毒性是紫苏醛型紫苏叶油的29倍之多，因此，在以后的药物制剂中，如果需要用到紫苏叶油，一定要严格检测其中化学成分，以免发生毒性反应。实验例5：紫苏醛型紫苏叶油的进一步效果探讨发明人对紫苏醛型紫苏叶油进行了进一步探讨，实验方法如下：实验方法同实验例3。分组为：实验组1-9、对比组1-3，其中实验组1为实验例1中的样品20(紫苏醛和石竹烯总含量为41.63％)、实验组2为实验例1中的样品17(紫苏醛和石竹烯总含量为45.92％)、实验组3为实验例1中的样品9(紫苏醛和石竹烯总含量为56.08％)、实验组4为为实验例1中的样品16(紫苏醛和石竹烯总含量为60.63％)、实验组5为实验例1中的样品7(紫苏醛和石竹烯总含量为62.14％)、实验组6为实验例1中的样品11(紫苏醛和石竹烯总含量为65.30％)、实验组7为实验例1中的样品3(紫苏醛和石竹烯总含量为67.96％)、实验组8为实验例1中的样品13(紫苏醛和石竹烯总含量为69.82％)、实验组9为实验例1中的样品9(紫苏醛和石竹烯总含量为85％)。对照组为随机检测过程中的不在本发明范围内的样品。实验结果：1、不同成分含量的紫苏醛型紫苏叶油对酵母发热大鼠体温增高值的影响：见表5-1表5-1：不同成分含量的紫苏醛型紫苏叶油对酵母发热大鼠体温增高值的影响(n＝10)注：aa为与对照组比较，p<0.01；b为与模型组相比，p<0.05；bb为与模型组相比，p<0.01；c为与对比组相比，p<0.05，cc为与对比组相比，p<0.01。由表5-1结果可知，与对照组大鼠比较，模型组大鼠体温在造模5h后明显升高，有统计学差异(p<0.01)。与模型组相比，阳性对照组解热止痛片可明显降低干酵母所致的大鼠体温升高，给药后1h即起效，并可持续4小时降温，提示模型成功。与模型组比较，各实验组的解热效果均明显优于模型组，三个对比组则没有显著效果；与对比组相比，各实验组有不同程度的解热效果差异。实验结果表明：紫苏叶油中紫苏醛、石竹烯二者成分含量比及含量总和对其解热药理活性影响显著，而当紫苏醛成分含量在46-49.2％，石竹烯成分含量在14.5-22％，紫苏烯或紫苏酮0-4.1％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为62-68％时，解热效果最显著，在给药后1-4小时均能持续降温，且在四个时间点均有显著性差异(p<0.01)。2、不同成分含量的紫苏醛型紫苏叶油对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用：见表5-2表5-3不同成分含量的紫苏醛型紫苏叶油对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用(n＝15)分组剂量对照侧耳(mg)致炎侧耳(mg)肿胀百分率(％)对照组---44.14±1.8588.04±10.0391.03±22.18强的松25mg/kg43.07±2.0565.02±11.2847.36±21.85aa实验组112.792mg/kg44.10±2.0367.21±10.2950.14±23.29a实验组212.792mg/kg42.99±3.9268.10±11.0951.36±20.98a实验组312.792mg/kg43.82±2.7769.83±10.2452.23±23.03ac实验组412.792mg/kg44.05±2.9268.54±9.0751.09±22.14ac实验组512.792mg/kg42.98±3.1365.52±9.2948.38±20.55aacc实验组612.792mg/kg43.44±2.8164.69±10.1249.39±22.18aacc实验组712.792mg/kg42.99±2.5665.08±9.9848.24±21.45aacc实验组812.792mg/kg43.87±3.1467.13±11.1450.92±20.14ac实验组912.792mg/kg44.11±2.1168.09±10.2351.29±24.05ac对比组112.792mg/kg43.59±2.0178.27±9.5473.75±29.13对比组212.792mg/kg42.97±2.9478.59±10.7374.27±25.41对比组312.792mg/kg44.01±2.5277.39±11.6473.77±22.98注：a为与模型组相比，p<0.05；aa为与模型组相比，p<0.01；c为与对比组相比，p<0.05，cc为与对比组相比，p<0.01。由表5-2结果可知，令本发明人意外的是，与实验例3不同，各实验组对二甲苯所致的小鼠耳肿胀均呈现出不同的抑制作用，与实验组比较，各对比组均未见明显抑制小鼠二甲苯所致小鼠耳肿胀作用。综合实验例3和各对比组的紫苏叶油的成分差异可知，紫苏叶油中紫苏醛、石竹烯二者成分含量及含量之和对其抗炎药理活性影响显著，而当紫苏醛成分含量在46-49.2％，石竹烯成分含量在14.5-22％，紫苏烯或紫苏酮0-4.1％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为62-68％时，对二甲苯所致炎症效果最显著，与对比组相比均有极显著性差异(p<0.01)。3、不同成分含量的紫苏醛型紫苏叶油对小鼠小肠推进的作用：见表5-3表5-3不同成分含量的紫苏醛型紫苏叶油对小鼠小肠推进的作用（n＝12)注：a为与模型组相比，p<0.05；aa为与模型组相比，p<0.01；c为与对比组相比，p<0.05，cc为与对比组相比，p<0.01。由表5-3结果可知，同样令本发明人意外的是，与实验例3不同，各实验组均具有明显促进小肠推进的作用，结合各对比组结果观察，各对比组与实验例3的结果一致，均未见明显的促进小肠推进作用，由此可知，紫苏醛型紫苏叶油也可促进小肠推进，只是对小肠推进的促进效果与紫苏叶油中紫苏醛和石竹烯的含量及二者含量之和有关，当紫苏醛成分含量在29-70％，石竹烯成分含量在2-27％，紫苏烯或紫苏酮0-4.1％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为40-85％范围内时，紫苏醛型紫苏叶油才能表现出促进小肠推进作用，而当紫苏醛成分含量在46-49.2％，石竹烯成分含量在14.5-22％，紫苏烯或紫苏酮0-4.1％，其中，紫苏醛和石竹烯二者的合计含量为62-68％范围内时，紫苏醛型紫苏叶油表现出极强的促进小肠推进作用，与对照组相比均有极显著性差异(p<0.01)。总结：1、紫苏醛型紫苏叶油、紫苏酮型紫苏叶油具有解热效果；2、紫苏酮型紫苏叶油具有毒性，紫苏醛型没有毒性；3、对紫苏醛型紫苏叶油进行研究发现，本发明限定的紫苏醛型紫苏叶油具有促进小肠蠕动、解热、抗炎、抗菌效果，可能与紫苏醛、石竹烯的配比和重量有关系。当前第1页12