一种骨瓜提取物注射液制备方法及相应的药物组合物与流程

本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一种骨瓜提取物注射液的生产方法及相应的药物组合物。
背景技术：
：骨瓜提取物注射液含有多种活性多肽和游离氨基酸，具有调节骨代谢，剌激成骨细胞增殖，促进新骨形成，调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松等作用。多肽类骨代谢因子可有效促进机体内影响骨形成和吸收的骨源性生长因子的合成，包括骨形态发生蛋白(bmps)，β-转化生长因子(tgf-β)，成纤维细胞生长因子(fgf)等，从而具有多种生物活性，其主要药理作用有：促进细胞有丝分裂、分化作用、趋化作用和溶骨活性。甜瓜籽提取物是从葫芦科植物甜瓜(cucumismelol.)的成熟干燥的种子经特殊工艺提取而成的，能降低骨折局部毛细血管通透性，减少炎性渗出，促进局部血运障碍的恢复；同时还能降低全血黏度及细胞聚集程度，改善骨痂局部的血液循环，为骨细胞提供一个良好的血供环境，另外还能抑制前列腺素的释放，达到止痛效果；在促进骨折早期愈合中，甜瓜籽提取物与补充的多肽类骨代谢因子具有协同作用，促进骨源性生长因子的合成。技术实现要素：本发明提供了一种骨瓜提取物注射液药物组合物的制备方法，所述药物组合物的剂型为小容量注射剂。本发明特点是调节提取液ph值依次呈酸性、碱性，以破坏蛋白质分子结构外层电荷及水化层，使蛋白质溶解度降低，形成沉淀，过滤除去。然后，利用超滤、大孔吸附树脂进行大分子蛋白质与多肽的分离纯化。本发明不同于其他制备方法，利用大孔吸附树脂技术对蛋白质与多肽进行了分离纯化，并确定了技术参数。本发明使药液中大分子物质降到最低，提高了药物的稳定性。本发明首先涉及一种骨瓜提取物注射液的的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)骨原料和甜瓜籽的前处理；(2)骨多肽提取液的制备；(3)甜瓜籽多肽提取液的制备；(4)骨瓜提取物溶液的制备；(5)骨瓜提取物注射液的制备。所述的骨原料的前处理步骤为：取检疫合格的猪四肢骨，用刀剔去残肉，断开去脂，用水冲洗，控去水分，砸碎。所述的甜瓜籽的前处理步骤为：取甜瓜籽用水冲洗，控去水分，粉碎。所述的骨多肽提取液的制备方法为：(1)前处理后的骨渣置加热锅中，按1:1量加注射用水，121℃热压60分钟，2～3层纱布过滤，残渣同法再次提取2次，合并三次滤液；(2)低温静置，撇去油脂；(3)加热至20～30℃，用2mol/l的盐酸调整ph值至3.0～3.5，煮沸后保持沸腾状态30分钟，随后静置12～24小时；(4)取上清液，相对截留分子量30万道尔顿的中空纤维柱过滤，滤液用5mol/l的naoh溶液调节ph8.5～9.0，加热煮沸，冷却，-35～-25℃速冻一周以上；(5)自然缓化或常温水浴至20～30℃，取上清液(多肽类物质浓度为2～5mg/ml，以牛血清白蛋白计)用2mol/l盐酸调节ph值至6.0～6.5；所述的自然缓化为取出速冻样本后，于常温下静置解冻；所述的以牛血清白蛋白计，即以牛血清白蛋白对照品配制多份标准溶液，测定吸收度，以吸收度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，测得供试品溶液的吸收度，从标准曲线上查得供试品溶液浓度，并乘以稀释倍数，得到样品含量；(6)将调节好ph值的上清液经大孔吸附树脂(xad-1180)以1.2～1.5bv/h流速通过大孔吸附树脂；随后：1)用大孔吸附树脂1倍量的纯化水冲柱，2)用1倍量的60％乙醇浸泡树脂30分钟，3)用3倍量80％乙醇以1.0～1.2bv/h流速洗柱，合并60％乙醇浸泡液和80％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩；浓缩液中的骨多肽含量为7～12mg/ml，以牛血清白蛋白计；(7)-25～-15℃冷冻储存所述的多肽提取液。所述的甜瓜籽多肽提取液的制备方法为：(1)前处理后的甜瓜籽粉碎物置加热锅中，按1:1量加注射用水，121℃热压30分钟，2～3层纱布过滤，残渣同法再次提取2次，合并三次滤液；(2)用2mol/l的盐酸调整ph值3.0～3.5，煮沸后保持沸腾状态30分钟，静置12～24小时；(3)取上清液，相对截留分子量30万道尔顿的中空纤维柱过滤，滤液用5mol/l的naoh溶液调节ph8.5～9.0，加热煮沸，冷却，-35～-25℃速冻一周以上；(4)自然缓化或常温水浴至20～30℃，取上清液(多肽类物质浓度为2～5mg/ml，以牛血清白蛋白计)用2mol/l盐酸调节ph值至6.0～6.5；(5)将调节好ph值的上清液经大孔吸附树脂(xad-1180)以1.2～1.5bv/h流速通过大孔吸附树脂，随后，1)用大孔吸附树脂1倍量的纯化水冲柱，2)用1倍量的60％乙醇浸泡树脂30分钟，3)用3倍量80％乙醇以1.0～1.2bv/h流速洗柱，合并60％乙醇浸泡液和80％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，浓缩液中甜瓜籽多肽含量为7～12mg/ml，以牛血清白蛋白计；(6)-25～-15℃冷冻储存所述的多肽提取液。所述的骨瓜提取物溶液的制备的步骤为：(1)将冷冻的骨多肽提取液、甜瓜籽多肽提取液解冻，按骨多肽与甜瓜籽多肽的重量比2：1混合；(2)用相对截留分子量1万道尔顿的超滤器超滤，检验多肽含量，药液放入冷库，-25～-15℃冷冻储存。所述的骨瓜提取物注射液的制备步骤为：(1)浓配：将药液解冻，药液倒入浓配罐加入所需的注射用水，搅拌10分钟；(2)稀配：药液打入稀配罐，加注射用水至配置量，药液搅拌10分钟以上，得注射液中间品；(3)灌封：将检测合格后的注射液中间品进行除菌过滤，滤器孔径为0.22μm，将药液打入除菌暂存罐，保持在20℃以下并进行灌封；(4)灭菌：121℃灭菌30分钟；(5)灯检、贴签、包装、入库。骨瓜提取物注射液是新鲜或冷冻的猪四肢骨和葫芦科植物甜瓜籽的干燥成熟种子分别经过单独提取后，混合制成的灭菌水溶液。猪骨提取物溶液、甜瓜籽提取物溶液中去除大分子蛋白和其他杂质是该制备工艺的关键，去除杂质的方式不同决定了产品的质量。该品种其他厂家去除杂质方法是对提取溶液调节酸性、碱性或加入乙醇，产生沉淀，过滤去除蛋白质沉淀物，纯化采用超滤工艺。本专利特点在于除了使用上述工艺外，引入大孔吸附树脂进行蛋白质与多肽的分离纯化，确定了大孔吸附树脂型号、上料温度、上料浓度、上柱速度、洗脱液、洗脱速度，降低了高分子物质，提高了药物的稳定性。我公司对骨瓜提取物注射液的处方、制备工艺进行了长期研究，研究证明：本专利所制备的样品常温储存36个月，各项检测指标变化小，质量稳定，各项指标符合质量标准，有效期可以定为36个月，比其他工艺制备的成品有效期24个月延长12个月。附图说明图1、对照品(细胞色素c)色谱图。图2、猪骨提取液通过树脂xad-1180分离纯化后的样品色谱图。图3、猪骨提取液通过树脂xad-7hp分离纯化后的样品色谱图。图4、猪骨提取液通过树脂xad-76分离纯化后的样品色谱图。图5、对照品(细胞色素c)色谱图。图6、甜瓜籽提取液通过树脂xad-1180分离纯化后的样品色谱图。图7、甜瓜籽提取液通过树脂xad-7hp分离纯化后的样品色谱图。图8、甜瓜籽提取液通过树脂xad-76分离纯化后的样品色谱图。具体实施方式实施例1、热压提取工艺优化将猪四肢骨剔去残肉，断开去脂，用水冲洗，控去水分，砸碎，按1:1量加水，分别于121℃(0.12mpa)热压30分钟、60分钟、120分钟取样，过滤，测定多肽含量；取甜瓜籽粉碎后同法实验，检验结果见表1。表1、热压提取时间实验结果提取时间猪骨性状骨多肽含量(mg/ml)甜瓜籽多肽含量(mg/ml)30分钟坚硬0.480.5660分钟坚硬0.690.58120分钟酥软0.720.59热压猪四肢骨和甜瓜籽，既要提取有效成分，又要防止提取液中杂质过多。由上表1可知：猪四肢骨提取121℃(0.12mpa)热压120分钟，猪四肢骨酥软，过多杂质进入提取液，增加杂质处理难度；热压60、120分钟，含量基本相同，没有太多提高，所以猪四肢骨提取以热压60分钟为适宜条件。甜瓜籽提取热压30、60、120分钟含量没有明显增加，所以甜瓜籽提取以热压30分钟为适宜条件。按照上述选择的热压条件，猪四肢骨、甜瓜籽按1:1量加水，分别再提取4次，测定多肽含量，实验结果见表2。表2、热压提取次数实验结果提取次数骨多肽含量(mg/ml)甜瓜籽多肽含量(mg/ml)第一次0.690.56第二次0.530.34第三次0.310.15第四次0.120.08由上表可知：热压提取三次适宜，第四次提取含量显著下降。综合以上实验：猪四肢骨提取以121℃热压60分钟，3次提取适宜。甜瓜籽提取以121℃热压30分钟，3次提取适宜。实施例2、提取液除去杂蛋白质工艺大分子蛋白质经过酸沉淀、碱沉淀、速冻后自然缓化，破坏蛋白质电荷及水化层的稳定性，使蛋白质溶解度降低，凝聚成沉淀除掉。选择酸沉淀、碱沉淀ph值范围是工艺条件选择的重点。按实施例1选定热压条件提取猪骨、甜瓜籽，滤液过滤，猪骨提取液低温静置，撇去油脂。分别向两种滤液中加入2mol/l的盐酸调整ph值，使ph值分别在3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，煮沸30分钟，静置12～24小时，取上清液滤纸过滤。按照质量标准中蛋白质检查项方法进行检验，取样滤液1ml，加磺基水杨酸钠溶液(浓度0.3g/ml)3ml，不得发生浑浊。观察结果见表3。表3、在酸性范围除掉蛋白质效果实验ph值3.03.54.04.55.0猪骨提取液微浑浊微浑浊浑浊浑浊浑浊甜瓜籽提取液微浑浊微浑浊浑浊浑浊浑浊实验结果显示：随着ph值降低，蛋白质析出增加，酸沉淀效果越好。ph值3.0～3.5时，沉淀效果比较好，但仍有微量蛋白质没有除去，没有达到质量标准要求。取上述ph值3.0～3.5酸沉淀的过滤液，加入5mol/l的naoh溶液，调节ph8.5～9.0，加热煮沸，冷却，-35～-25℃速冻一周以上。自然缓化至20～30℃，取上清液，按照质量标准中蛋白质检查项方法进行检验，取样滤液1ml，加磺基水杨酸钠溶液(浓度0.3g/ml)3ml，不得发生浑浊。结果见表4。表4、在碱性范围除掉蛋白质效果实验ph值8.59.0猪骨提取液溶液澄明溶液澄明甜瓜籽提取液溶液澄明溶液澄明实验结果显示：酸沉淀ph值范围选定3.0～3.5，碱沉淀ph值范围选定8.5～9.0，沉淀去除蛋白质的效果比较好。实施例3、大孔吸附树脂分离纯化研究猪骨、甜瓜籽提取液要尽可能分离去掉大分子蛋白质，保留有效成分多肽，就要利用蛋白质和多肽在分子量、分子结构不同进行大孔吸附树脂的选择。蛋白质分子中是由多条肽链通过氢键、离子键、范德华力形成稳定的二、三、四级立体结构，蛋白质分子结构复杂，分子量大。而多肽分子量小，分子结构简单，肽链中游离的羧基、胺基，使得多肽在水、乙醇溶液中均溶解。根据分子量大小、溶解性质及被分离物质结构所携带基团性质，选择强极性大孔吸附树脂进行分离纯化实验。由于大孔吸附树脂生产厂家多、型号复杂，没有统一质量标准，所以需要通过实验来确定具体使用树脂型号及操作参数，在吸附能力相同时尽可能选择比表面积大的树脂型号，以增加吸附量。实验选择美国门罗哈斯公司生产的amberlitetmxad系列大孔吸附树脂xad-1180、xad-7hp、xad-761进行实验。表5、amberlitetmxad系列大孔吸附树脂参数树脂型号极性平均孔径(μm)比表面积(m2/g)xad-1180强极性0.40700xad-7hp强极性0.45500xad-761强极性0.60200按实施例1选定热压条件提取猪骨、甜瓜籽，按实施例2选定ph值范围对提取液酸沉淀、碱沉淀，加热煮沸，冷却，-35～-25℃速冻一周以上，自然缓化至20～30℃，取上清液(多肽类物质以牛血清白蛋白计，含量为2～5mg/ml)用2mol/l盐酸调节ph值在6.0～6.5，多肽溶液以1.2～1.5bv/h流速通过大孔吸附树脂，然后，用大孔吸附树脂1倍量的纯化水冲柱，1倍量的60％乙醇浸泡树脂30分钟，3倍量80％乙醇以1.0～1.2bv/h流速洗柱，合并收集60％乙醇浸泡液和80％乙醇洗脱液，回收溶液中的乙醇至溶液无乙醇味为止。取上述样品，进行高分子物质检查。取样品适量，加水制成每1ml含多肽1mg的溶液，作为供试品溶液；另取细胞色素c注射液适量，加水制成每1ml中含5mg的溶液，作为对照溶液。依照高效液相色谱法测定，采用凝胶色谱柱(如tskgelg2000sw,protenpak600)；流动相配方：磷酸氢二钾13.93g、磷酸二氢钾5.32g、异丙醇50ml，加水至1000ml，用磷酸调节ph值至7.0；流速：0.8ml/min，检测波长：280nm。对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中，各峰的保留时间均应大于对照溶液主峰的保留时间。实验结果见表6、7。表6、猪骨提取液供试品高分子物质检查实验结果树脂型号实验结果结论-对照样品(细胞色素c)的色谱图(图1)-xad-1180各峰的保留时间均大于对照溶液主峰的保留时间(图2)合格xad-7hp各峰的保留时间均大于对照溶液主峰的保留时间(图3)合格xad-76有保留时间小于对照溶液主峰保留时间的峰出现(图4)不合格表7、甜瓜籽提取液供试品高分子物质检查实验结果树脂型号实验结果结论-对照样品(细胞色素c)的色谱图(图5)-xad-1180各峰的保留时间均大于对照溶液主峰的保留时间(图6)合格xad-7hp各峰的保留时间均大于对照溶液主峰的保留时间(图7)合格xad-76有保留时间小于对照溶液主峰保留时间的峰出现(图8)不合格实验结果显示，树脂型号xad-1180、xad-7hp均可用于多肽与蛋白质分离纯化，考虑到型号xad-1180的比表面积大于xad-7hp，吸附能力更强，选用xad-1180型号大孔吸附树脂树脂。实施例4、骨瓜提取物溶液ph值稳定性实验及成品灭菌参数实验1、ph值稳定性试验根据“骨瓜提取物注射液”国家质量标准ph值5.5～7.0的规定，在ph值5.5～7.0范围内考察制备的骨瓜提取物溶液的稳定性。取骨瓜提取物溶液，加水稀释至含多肽5mg/ml，分别调节ph值为5.5、6.0、6.5、7.0，于80℃保温24小时，比较加热前与加热保温后溶液的性状、ph值、多肽含量，结果见表8。表8、ph值稳定性实验实验结果表明，取骨瓜提取物溶液在ph值5.5～7.0范围稳定，为本品的适宜ph值范围。2、成品灭菌参数实验考察制备出的骨瓜提取物注射液在不同灭菌条件下的稳定性。取骨瓜提取物溶液，加注射用水稀释至含多肽5mg/ml，灌装于5ml安瓿中，融封，分别于100℃、115℃、121℃条件下灭菌30分钟，比较灭菌前后溶液的性状、ph值、多肽含量，结果见表9。表9、灭菌条件实验结果实验条件性状ph值多肽含量(mg/ml)灭菌前淡黄色澄明液体6.25.32100℃30分钟淡黄色澄明液体6.25.31115℃30分钟淡黄色澄明液体6.25.33121℃30分钟淡黄色澄明液体6.25.32实验结果表明，骨瓜提取物注射液在各种灭菌条件下均无明显变化，考虑到多肽类药液是细菌良好的培养基，细菌易繁殖，所以选择灭菌条件为121℃，灭菌30分钟。实施例5、配伍、温度、光线影响因素及批量生产的样品长期稳定性考察取骨瓜提取物注射液4支加入到250ml5％葡萄糖注射液中；另外取4支，加入到250ml0.9％氯化钠注射液中。室温放置，分别于0、1、2、3、4、6小时观察溶液性状，同时取样测量多肽含量。实验结果表明，本品与5％葡萄糖注射液和0.9％氯化钠注射液配伍稳定，6小时以内，可以满足临床用药要求。将骨瓜提取物注射液样品分别置于60℃、5℃、照度4500lx条件下放置，于第0天、第5天、第10天取样，检测外观性状、ph值、澄清度、含量，并与初始0天结果比较。实验结果表明，本品在高温(60℃)、低温(5℃)、强光(4500lx)条件下，放置10天，各项指标与初始结果比较，均无明显变化，制剂稳定性较好。上述工艺条件筛选为小批量工艺筛选。2013年按照权利要求书中所述的制备方法在车间进行规格10ml:50mg，6.8万支，批号为s131001、s131002两批批量生产；规格5ml:25mg，10万支，批号为s131003一批批量生产。我们将骨瓜提取物注射液在生产车间进行批量生产，考察处方、制备方法重现性和稳定性，以此验证工艺和产品质量的稳定性。依据《中国药典》附录《原料药物与制剂稳定性试验指导原则》长期稳定性试验要求，供试品三批，市售包装，在稳定30℃±2℃，相对湿度65％±5％的条件下放置，在0、3、6、9、12、18、24、36个月检查性状、ph值、含量。成品质量标准要求：性状为微黄色至淡黄色的澄明液体，ph值在5.5～7.0，含量为每1ml中含多肽按牛血清白蛋白计，不得低于5.0mg。两个规格批量生产的样品进行三年长期稳定性试验，性状、ph值、含量均符合质量标准，各项检测指标变化小，性质稳定，表明骨瓜提取物注射液处方构成合理、制备工艺稳定可靠。最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用做的本发明保护范围的限定。当前第1页12