一种核桃饼粕多酚纯化物在制备治疗肠道菌群失调药物中的用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及核桃饼粕多酚纯化物在制备治疗肠道菌群失调药物中的用途。

背景技术：

随着人类社会的发展和物质生活的极大丰富，肥胖问题在全球范围内越来越普遍，无论是发达国家还是发展中国家，肥胖的发生率都呈现明显上升的趋势，肥胖问题已成为世界瞩目的公共卫生问题肥胖不仅影响形体美，更重要的是容易诱发糖尿病、心血管疾病、脂肪肝和癌症等疾病，成为困扰人类健康的最受关注的疾病之一。肠道菌群属于人类共生微生物，与机体处于一种动态平衡状态，形成了相互调节、互相制约且相互依存的系统，被誉为人体的“第二基因组。正常情况下，肠道菌群与人体内外环境保持着平衡状态，肠道正常菌群在激活人体免疫系统、帮助人体消化和吸收营养、抵御外来病原菌的入侵和产生重要代谢产物以及生物活性成分等方面有许多不可替代的作用。而有研究显示肠道菌群也可以控制脂肪代谢、引发全身性的慢性低度炎症，作为环境因素诱发肥胖症和胰岛素抵抗。不断有研究证实，高脂饮食对肠道微生物菌群的改变有重要影响，而肠道正常菌群可能参与诱发饮食引起的肥胖的产生。因此，通过调节肠道菌群使之正常化，是预防和治疗诸如肥胖、高脂血症等疾病的重要研究方向之一。

核桃系胡桃科(juglandaceae)核桃属(juglanlinn.)、山核桃属(carya)、缘核桃属(annamocarya)等乔木植物，其果用主要有j.regia、j.sigillata、j.nigra,j.cathayensis、c.cathayensis、c.illinoensis、a.sinensis等。核桃是一种集蛋白质、脂肪、纤维素、维生素等营养要素于一身的优良干果类食品，营养丰富，经济价值高。祖国医学认为核桃性温、味甘、无毒，有健胃、补血、润肺、养神等功效，核桃仁被收载于中国药典。核桃除了直接食用外，部分做为油料用于榨取核桃油。核桃饼粕为核桃仁压榨核桃油后的副产物，其含有丰富的酚类化合物(6.75％)和优质蛋白质。近年来，核桃饼粕蛋白质因其产品具有抗氧化、抗心血管疾病、抗肥胖、抗糖尿病等多种生理功能，部分核桃饼粕作为生产核桃多肽的原料，被广泛应用于医药研究方面。但核桃饼粕富含的酚类化合物并没有引起太多的重视，大部分核桃饼粕目前仍然作为动物饲料使用，附加值较低。

酚类化合物在植物中广泛存在，是植物界最为重要的次生代谢物质之一，其各项生理及营养功能已被大量研究证实，发展趋势和应用前景广阔。日常饮食中有目的经常摄食富含多酚活性成分的食物能够降低各种自由基导致的慢性病风险，例如心血管疾病、癌症、心脏病等。多酚类化合物因天然存在于多种植物中，资源广泛，生理功能强大，应用前景广阔，而深受国内外学者的广泛关注。目前，植物多酚一般应用于医疗行业作为保健品、防止治疗心血管疾病等药物，以及美容护肤品、食品行业的抗氧化剂等产品。

许多体外抗氧化试验已证实，核桃多酚优异的抗氧化及自由基清除能力，对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用，维持细胞膜的流动性和蛋白质的构型构象，防止辐射诱发的脱氧核糖核酸(dna)断裂，具有抗突变、抗肿瘤、抗癌症、抗衰老、降血脂等作用。进一步开发核桃多酚的用途，特别是开发作为榨油副产品的核桃饼粕多酚的用途，不仅原料成本低，也能够提高核桃饼粕的附加值，而且也是当下以肠道菌群为靶点防治代谢性慢性病的研究热点之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种核桃饼粕多酚纯化物在制备治疗肠道菌群失调药物中的用途。

本发明的目的是这样实现的：核桃饼粕多酚纯化物在制备治疗肠道菌群失调药物中的用途，所述肠道菌群失调是由高脂饮食导致的部分菌群相对丰度显著降低和部分菌群相对丰度显著增加。

本发明的核桃饼粕多酚纯化物经高脂饲料诱导大鼠肥胖模型实验结果表明，补充核桃饼粕多酚纯化物能逆转因高脂饮食导致的菌群如norankofbacteroidaless24-7group、unclassifiedoflachnospiraceae、allobaculum、ruminiclostridium、bacteroidaless24-7group、ruminococcaceae、prevotellaceae、erysipelotrichaceaeveillonellacea、helicobacteraceae、clostridiales、clostridia、erysipelotrichales、campylobacteriales、erysipelotrichia和/或epsilonproteobacteria等丰度显著降低和bacteroides、escherichia-shigella、phascolarctobacterium、lachnoclostridium、oscillibacter、fusobacterium、norankoflachnospiraceae、enterobacteriaceae、bacteroidales、acidaminnococcaceae、fusobacteriaceae、pasteurellaceae、enterobacteriale、selenomonadales、fusobacteriales、bacillales、bacteroidia、gammaproteobacteria、negativicutes、betaproteobacteria和/或fusobacteriia等丰度显著增加导致的肠道菌群失调，可明显改变肠道菌群的组成，使体内失衡的肠道菌群趋于正常，进而调节肠道菌群紊乱所导致的脂代谢异常，对实验动物的tc、tg、ldl-c有显著的降低作用。本发明的核桃饼粕多酚纯化物在核桃饼粕经过乙醇粗提后，将醇提液经无水乙醇沉淀多糖和蛋白质，从而避免在后续的纯化过程中造成大孔树脂中毒(较多的糖类、蛋白质等杂质导致大孔树脂吸附能力下降，甚至消失)，以此提高纯化效率。本发明治疗肠道菌群失调药物包括包含核桃饼粕多酚纯化物的核心及肠溶衣层，通过肠溶性的肠溶衣层保护包含核桃饼粕多酚纯化物的核心，能够避免核桃饼粕多酚纯化物在胃酸中提前溶解，而保证在肠内快速溶解，实现肠内靶向控制释放，从而提高药效和减少不良反应。

附图说明

图1为实验例造模成功后核桃饼粕多酚纯化物对高脂饮食大鼠体重的影响；

图2为实验例造模成功后第0、6、14周各组大鼠肠道微生物在属分类水平的群落热图；

图2中：方格内有“·”则表示热度小于1.5。

具体实施方式

下面结合附图和实验例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。

本发明核桃饼粕多酚纯化物在制备治疗肠道菌群失调药物中的用途，所述肠道菌群失调是由高脂饮食导致部分菌群相对丰度显著降低和部分菌群相对丰度显著增加。

所述相对丰度显著降低的部分菌群包括norankofbacteroidaless24-7group、unclassifiedoflachnospiraceae、allobaculum、ruminiclostridium、bacteroidaless24-7group、ruminococcaceae、prevotellaceae、erysipelotrichaceaeveillonellacea、helicobacteraceae、clostridiales、clostridia、erysipelotrichales、campylobacteriales、erysipelotrichia和/或epsilonproteobacteria。

所述相对丰度显著增加的部分菌群包括bacteroides、escherichia-shigella、phascolarctobacterium、lachnoclostridium、oscillibacter、fusobacterium、norankoflachnospiraceae、enterobacteriaceae、bacteroidales、acidaminnococcaceae、fusobacteriaceae、pasteurellaceae、enterobacteriale、selenomonadales、fusobacteriales、bacillales、bacteroidia、gammaproteobacteria、negativicutes、betaproteobacteria和/或fusobacteriia。

所述核桃饼粕多酚纯化物为核桃饼粕经乙醇粗提后经大孔树脂洗脱纯化的提取物，所述核桃饼粕多酚纯化物中总多酚含量按质量百分比不少于70％。

所述核桃饼粕多酚纯化物的制备具体操作如下：

将核桃壳洗净、晾干后粉碎过20～40目筛，筛下物用45～55％乙醇水溶液以液固体积质量比40～60:1在75～80℃温度条件下，按1～1.5h/次回流提取1～2次，合并滤液；将合并滤液采用大孔树脂按上液样ph值为3.5～4.0、上样液质量浓度3.5～4.5mg/ml、上样流速0.8～1.2bv/h、上柱液体积1.6～1.8bv、洗脱液乙醇体积分数70～80％、洗脱流速3～4bv/h和洗脱体积为2.5～3.5bv进行洗脱，冷冻干燥或喷雾干燥得到所述核桃饼粕多酚纯化物。

所述合并滤液中滤液合并后浓缩为1mg/ml固含物的浓缩液，在浓缩液中按1：0.1～0.3的浓缩液：无水乙醇的体积比加入入无水乙醇，搅拌混匀后静置20～30min，然后以4500rpm转速离心10～20min取上清液，上清液回收乙醇后按上述进行大孔树脂提纯。

所述治疗肠道菌群失调药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、酒剂或口服液。

所述治疗肠道菌群失调药物由上述核桃饼粕多酚纯化物和药学上可接受的载体组成。

所述药学上可接受的载体包括填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂、矫味剂中的一种或药学上可接受的任意组合。

所述治疗肠道菌群失调药物包括包含核桃饼粕多酚纯化物的核心及包含甲基丙烯酸共聚物、羟丙甲纤维素酞酸酯、醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯、醋酸纤维素酞酸酯、聚醋酸乙烯酞酸酯中的一种或任意组合的聚合物成分的肠溶衣层。

所述肠溶衣层中的聚合物成分是由甲基丙烯酸和选自丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯中的一种或任意组合的单体形成的甲基丙烯酸共聚物。

实验例：

采用饲喂高脂饲料的sd雄性大鼠建立肥胖症模型，观察本发明的核桃饼粕多酚纯化物(wmp)对肥胖模型大鼠的体重及血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白(ldl-c)、肝重、肝脏脂质水平的影响。

1、药效学实验

1)实验动物和试剂

spf级雄性sd大鼠60只，雄性，体重240～160g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。合格证号syxk(滇)k2011-0011。基础饲料购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司。

辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司)，总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hdl-c)试剂盒及低密度脂蛋白(ldl-c)(中生北控生物科技股份有限公司)，谷草转氨酶(ast)及谷丙转氨酶(alt)(购自南京建成生物科技股份有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。

桃饼粕多酚的提取和纯化：核桃饼粕干燥粉碎过20目筛，称取一定量的核桃饼粕粉，按照乙醇浓度50％、提取温度78℃、料液比1：50、80min回流提取工艺提取核桃饼粕，得到核桃饼粕多酚粗提物；核桃饼粕多酚粗提物经hpd-100大孔树脂纯化：上样液ph4.0、上样浓度为4mg/ml、上样液流速为1ml/min、上样液的体积为1.8bv、洗脱液乙醇浓度为75％、洗脱的流速为4bv/h、洗脱的体积为3bv。

多酚含量的测定：用福林酚法，以没食子为对照品，以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，绘制标准曲线并测定核桃饼粕提取物中多酚的含量，得到核桃饼粕多酚纯化物(wmp)中总多酚含量按质量百分比为78.3％。

2)动物处理方法

sd雄性大鼠，温度22±2℃，湿度40～60％，昼夜各12h，自由饮水，自由进食普通饲料一周后，随机挑选8只作为正常组(空白对照组)，饲喂基础饲料，其余大鼠用高脂饲料喂养6周后，空腹12h，眼内眦取血测定tc、tg，考查造模是否成功。造模成功后，随机把造模成功的大鼠分为5组，即模型组、阳性药组(辛伐他丁40mg/kg)、wmp高剂量组(800mg/kg)、wmp中剂量组(600mg/kg)、wmp低剂量组(400mg/kg)，正常组与模型组均给予等剂量的生理盐水，各组均饲喂高脂饲料。实验期间各组大鼠均自由进食进水，每天按计量灌胃给药一次，给药体积按0.5ml/100g。实验期间每周进行一次空腹体重测定，每周固定时间进行进食量和饮水量的测定。

高脂饲料：10％蔗糖、15％蛋白粉、10％猪油、1.5％胆固醇、1％猪胆盐、0.5％食盐、62％普通饲料。

分别在给药的0、6、14周取大鼠的粪便，采用454焦磷酸测序技术对肠道菌群进行分析，连续给药14周后，禁食不禁水12h，称体质量，体长，用10％水合氯醛(1ml/kg，腹腔注射)麻醉后，腹主动脉取血，室温静置60min，待血液凝固后4℃低温下以2500～3000r/min离心10min，小心吸出上层血清，分装，置于-20℃保存待测，按照试剂盒说明书测定血清tc、tg、ldl-c。

实验数据用(x±s)表示，采用graphpadprism5.0统计软件分析处理数据，所有数据进行单因素方差分析，以p＜0.05为差异具有显著统计学意义。

2、对体重及血脂影响结果与分析

1)wmp对高脂饮食诱导的大鼠体重的影响

连续给药14周后，检查体重、lee’s指数、脂肪重量，结果表明：给药14周后各组大鼠的体重、李氏指数的变化如图1所示，与正常组相比，模型组的体重显著增加(p<0.01)，表现出典型的肥胖体征，体重增加18.42％。与模型组相比，wmp组(600mg/kg和800mg/kg)显著降低了大鼠的体重，体重分别降低了16.18％、16.69％、17.75％，说明wmp显著改善了高脂饮食大鼠的体重。

2)wmp对高脂饮食诱导的大鼠血脂水平的影响

给药14周后各组大鼠的血脂的变化见表1，与正常组相比，高脂饮食大鼠血清的tc、tg、ldl-c极显著增加(p<0.01)，说明wmp有明显促进大鼠体内血脂水平上升的作用。与模型组相比，wmp组(400mg/kg、600mg/kg、800mg/kg)和辛伐他汀组，均显著降低血清tc、tg、ldl-c水平，tc分别降低了36.77％、31.84％、30.78％、30.9％，tg分别降低了81.13％、61.48％、82.51％、80.31％。ldl-c分别降低了55.1％、39.94％、40.77％、45.89％。说明wmp有显著的调节血脂的作用。

表1.wmp对高脂饮食大鼠血清tc、tg、ldl-c、hdl-c的影响

注：模型组与正常组相比，###p<0.01；辛伐他汀组、wmp组与模型组相比，**p<0.05，***p<0.01。

3、对肠道菌群影响结果与分析

采集实验大鼠正常组(ng)、模型组(mg)、wmp高剂量组(以下简称wmp)的第0、6、14周的大鼠粪便，将不同组别和不同时间的肠道菌群进行差异分析。

1)样品的alpha多样性比较

本实验结果发现，在这3不同时间点内，模型组的群落多样性低于正常组，在6周时shannon和simpson指数差异最显著(p<0.001或p<0.05)，wmp组与模型组比较，shannon指数上升，simpson指数下降，在14周时差异最大，但均无显著性差异。肠道微生物菌群丰度的变化在对环境样本中微生物丰度的评估中，主要采用ace指数

与chao指数。ace指数或chao指数越大，说明群落丰度越高，模型组与正常组比较，ace指数与chao指数均有所下降，但无显著性差异；wmp组与模型组比较，ace指数与chao指数均上升，但3组之间比较无显著性差异。以上结果表明，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肠道细菌出现多样性减少及细菌基因丰度改变，给wmp后肠道微生物多样性得到一定程度的改善。

表2wmp对高脂饮食大鼠肠道微生物多样性的影响

2)样品beta多样性比较

为了进一步展示样品间物种多样性差异，采用主成分分析(principalcomponentanalysis)的方法展示各个样品间的差异大小，ng组在0、6、14周3个时期都聚集在一起，主成分变化很小，而mg组在各时期的主成分分离，在6周到14周在pc3和pc1方向都有变化，wmp组6周时与mg组主成分相近，但在14周与ng聚集，说明wmp能使高脂饮食引起的肠道菌群主成分朝正常组恢复，调节了肠道菌群的失衡。

3)样品物种差异分析

如图2所示，在属水平上的热图，可观察多个样本间的群落组成分布。主要分为两组，一组主要有wmp6组和mg0、mg6、mg14组聚集为，另一组由wmp14和ng0、ng6、ng14组聚集。给药14周后，那个ng14组和wmp14组有的肠道菌群高度的相似性，说明wmp能够使高脂饮食诱导的肠道菌群失调恢复正常。