柴胡活性成分在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及抗三阴性乳腺癌活性成分，具体地说是中药材柴胡中抗三阴性乳腺癌活性成分的发现及应用，所述的活性成分包括柴胡精细组分、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，及它们药学上可接受的钠盐或钾盐化合物。

背景技术：

柴胡(radixbupleuri)为伞形科(umbelliferae)柴胡属(bupleuruml.)植物，是我国一种古老的药用植物，始载于《神农本草经》，列为上品。本品具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气的功效。临床上用于感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调等证。药用部位为伞形科植物柴胡(bupleurumchinensedc.)或狭叶柴胡(bupleurumscorzonerifoliumwilld.)的干燥根。主产于东北、华北、内蒙古、河南、陕西及甘肃等省区。柴胡的主要有效成分为柴胡皂昔、挥发油、黄酮、多糖及其他，具有显著的抗肿瘤、抗炎、免疫调节、降血脂及保肝作用。近年来，研究发现柴胡提取物通过影响肝癌细胞线粒体中代谢酶的活性来抑制人肝癌细胞smmc-7721的增殖；柴胡皂苷类化合物能够显著抑制肝癌细胞hepg2和非小细胞肺癌细胞a549的增殖。可见，柴胡具有很好的抗肿瘤活性。

乳腺癌是全世界女性常见的恶性肿瘤之一，近年来的发病率在我国呈上升趋势，已成为女性恶性肿瘤的首位。三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer,tnbc)作为乳腺癌的一个亚型，是指雌激素受体(estrogenreceptor,er)、孕激素受体(progesteronereceptor，pr)和人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,her-2)表达均为阴性的乳腺癌，具有侵袭性高、转移性强及预后差等特点，是公认的最棘手的乳腺疾病，也是所有乳腺癌分类中生存率最低的。由于tnbc不同于普通的乳腺癌，所以目前治疗乳腺癌的方案对tnbc没有治疗效果，如目前治疗乳腺癌的有效药物曲妥单抗和他莫昔芬能够很好的治疗her-2和er过表达的乳腺癌患者，但对tnbc患者没有疗效，当前对tnbc的治疗仍以手术切除和化疗为主，缺乏针对治疗tnbc的有效药物。因此，发现柴胡中有效的抗tnbc活性成分具有重要的临床意义。在本发明中，我们将系统发现与研究柴胡中抗tnbc的活性成分。

目前关于本发明中提到的柴胡中抗tnbc的活性成分研究尚未报道。

技术实现要素：

本发明涉及抗三阴性乳腺癌活性成分，目的之一是提供具有抗三阴性乳腺癌作用的中药成分，所述的活性成分包括柴胡精细组分、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d及它们药学上可接受的钠盐或钾盐化合物；柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的化学结构如下，目的之二是发展从柴胡中发现抗三阴性乳腺癌活性成分的方法。

体外细胞实验表明，本发明中所述的柴胡精细组分与化合物柴胡皂苷a和柴胡皂苷d能够显著抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖，因此可以用于制备治疗和预防三阴性乳腺癌的药物。

精细组分和柴胡皂苷类化合物能显著抑制三阴性乳腺细胞的增殖；柴胡皂苷d比柴胡皂苷a具有更强的抑制活性。

三阴性乳腺细胞能够高表达β-catenin蛋白的三阴性乳腺癌细胞hcc1937，活性成分通过下调β-catenin蛋白的表达来抑制三阴性乳腺癌细胞hcc1937的增殖。

附图说明

图1柴胡精细组分f1-f21的高效液相色谱制备谱图；

图2柴胡精细组分f1-f21对三阴性乳腺癌细胞hcc1937增殖的抑制作用；

图3柴胡精细组分f20(a)和标准品柴胡皂苷d(d)的高效液相色谱分析谱图；

图4柴胡精细组分f20主峰的一级(a)和二级(c)质谱分析谱图及标准品柴胡皂苷d的一级(b)和二级(d)质谱分析谱图；

图5柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d对hcc1937细胞增殖的抑制作用，浓度单位为mol/l,简写为m；

图6柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d对正常细胞hek293t增殖的抑制作用，浓度单位为mol/l,简写为m；

图7柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d对hcc1937细胞中β-catenin蛋白表达的影响作用。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：柴胡精细组分的高效液相色谱制备

柴胡药材购于中国河南，三阴性乳腺癌细胞系hcc1937和人胚肾细胞hek293t购于中国科学院上海细胞库；细胞增殖和细胞毒性检测(cck)试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；96孔板购于corning；倒置显微镜购于olympus；全波长酶标仪购于thermo；柴胡皂苷a和柴胡皂苷d购于上海源叶生物技术有限公司。

柴胡药材经中国中医科学院西苑医院鉴定为正品。柴胡精细组分的制备方法为：称取药材粉末100g，加入1000ml乙醇-水(70：30，v/v)，浸泡48h；将上清液经滤纸过滤、旋蒸浓缩并冻干得11.57g样品；取6.7g冻干样品用33ml的70％乙醇重溶，配制成固含量为200mg/ml的溶液；溶液经6mlspe柱预处理，使用70％乙醇平衡、上样及洗脱，收集所有透过液，旋蒸浓缩并冻干得spe预处理样品；将spe预处理样品使用70％乙醇溶解成246mg/ml的溶液，过0.45μm的有机膜；使用c18me色谱柱(7μm,50×268mm,zk2016040901,300g)进行精细组分的制备，流动相为a-甲醇和b-水(含0.1％甲酸)，流速为80ml/min，检测波长为254nm，上样量为6ml样品液，梯度条件为0-5min，5％a；5-45min，5％-95％a；45-55min，95％a。按色谱峰手动收集馏分，收集方式见图1，共收集21份柴胡精细组分，命名为f1-f21。其中f1对应的时间段为0～6min，流动相条件为5％～7.25％a；f2对应的时间段为6～8min，流动相条件为7.25％～11.75％a；f3对应的时间段为8～10min，流动相条件为11.75％～16.25％a；f4对应的时间段为10～12min，流动相条件为16.25％～20.75％a；f5对应的时间段为12～14min，流动相条件为20.75％～25.25％a；f6对应的时间段为14～16min，流动相条件为25.25％～29.75％a；f7对应的时间段为16～18min，流动相条件为29.75％～34.25％a；f8对应的时间段为18～20min，流动相条件为34.25％～38.75％a；f9对应的时间段为20～22min，流动相条件为38.75％～43.25％a；f10对应的时间段为22～24min，流动相条件为43.25％～47.75％a；f11对应的时间段为24～26min，流动相条件为47.75％～52.25％a；f12对应的时间段为26～28min，流动相条件为52.25％～56.75％a；f13对应的时间段为28～30min，流动相条件为56.75％～61.25％a；f14对应的时间段为30～32.5min，流动相条件为61.25％～66.875％a；f15对应的时间段为32.5～35min，流动相条件为66.88％～72.5％a；f16对应的时间段为35～37.5min，流动相条件为72.5％～78.13％；f17对应的时间段为37.5～40mina，流动相条件为78.13％～83.75％a；f18对应的时间段为40～42.5min，流动相条件为83.75％～89.38％a；f19对应的时间段为42.5～45min，流动相条件为89.38％～95％a；f20对应的时间段为45～47.5min，流动相条件为95％～95％a；f21对应的时间段为47.5～60min，流动相条件为95％～95％a。

实施例2：柴胡精细组分对三阴性乳腺癌细胞hcc1937增殖的抑制作用

将柴胡精细组分使用二甲基亚砜(dmso)溶解成25mg/ml的溶液，使用rpmi-1640完全培养基配成50μg/ml，备用。将处于对数生长期的hcc1937细胞接种于96孔板中，密度分别为10000个/孔，接种体积为100μl/well。培养24h之后，分别加入浓度为50μg/ml的实施例1获得的不同的柴胡精细组分，每孔100μl。处理24h之后，吸出培养基，加入含10％cck的rpmi-1640培养基，显色2h后，使用酶标仪在450nm波长下测od值。根据od值，计算柴胡精细组分对hcc1937细胞的抑制率，结果见图2。从图中可以看出精细组分f13和f20对hcc1937的增殖具有显著抑制活性，其中f20的抑制活性最强，抑制率可达90％以上。因此，高效液相色谱制备的柴胡精细组分f13和f20具有抗三阴性乳腺癌的作用，且精细组分f20的抗三阴性乳腺癌作用强于精细组分f13。

实施例3：柴胡精细组分f20主峰化学成分的表征与鉴定

通过高效液相色谱分析柴胡精细组分f20与柴胡皂苷化合物a、b2、c和d，发现在205nm检测波长下精细组分f20和柴胡皂苷d具有相同的保留时间，保留时间为10.45min，分析结果见图3。通过高分辨质谱的鉴定，获得精细组分f20主峰的分子离子峰825.4723及二级碎片离子峰779.4639、617.4111和471.3523，与柴胡皂苷d的分子离子峰825.4739及二级碎片离子峰779.4632、617.4109和471.3514一致，结果见图4。因此，可推断柴胡精细组分f20中含有柴胡皂苷d。

实施例4：柴胡皂苷a、b2、c和d的抗三阴性乳腺癌作用研究

在制备的柴胡精细组分中，f20具有最强的抗三阴性乳腺癌活性，经色谱-质谱表征与鉴定表明f20中含有柴胡皂苷d，可推断柴胡皂苷类的化合物具有抗三阴性乳腺癌的活性，因此在这里同时研究与比较了柴胡皂苷a、b2、c和d的抗三阴性乳腺癌作用。首先将处于对数生长期的hcc1937细胞接种于96孔板中，密度分别为10000个/孔，接种体积为100μl/well。培养24h之后，分别加入浓度为200μmol/ml、100μmol/ml、50μmol/ml、25μmol/ml、12.5μmol/ml、6.25μmol/ml、3.125μmol/ml、1.5625μmol/ml和0.78125μmol/ml的柴胡皂苷a、b2、c和d，每孔100μl。处理24h之后，吸出培养基，加入含10％cck的rpmi-1640培养基，显色2h后，使用酶标仪在450nm波长下测od值。根据od值，计算化合物对hcc1937细胞的抑制率，结果见图5。从图中可以看出柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对hcc1937的增殖具有显著抑制活性，其剂量抑制曲线呈现单相“s”型，对应的ic50值分别为30.38±4.14μm和25.13±0.42μm。可见，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的抗三阴性乳腺癌活性强于柴胡皂苷b2和柴胡皂苷c。

实施例5：柴胡皂苷a、b2、c和d的安全性研究

传统的抗肿瘤药物，常常具有较强的副作用，而中药活性成分具有较高的安全性。通过研究柴胡皂苷a、b2、c和d对人胚肾细胞hek293t作用，评价柴胡皂苷a、b2、c和d的安全性。首先将处于对数生长期的hek293t细胞接种于96孔板中，密度分别为30000个/孔，接种体积为100μl/well。培养24h之后，加入浓度为200μmol/ml、100μmol/ml、50μmol/ml、25μmol/ml、12.5μmol/ml、6.25μmol/ml、3.125μmol/ml、1.5625μmol/ml和0.78125μmol/ml的柴胡皂苷a、b2、c和d，每孔100μl。处理24h之后，吸出培养基，加入含10％cck的dmem培养基，显色2h后，使用酶标仪在450nm波长下测od值。根据od值，计算化合物对hek293t细胞的抑制率，结果见图6。从图中可以计算获得柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的ic50值分别为56.67±6.99μm和44.42±5.70μm，通过与它们的抗三阴性乳腺癌活性相比，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用更强，正常细胞对柴胡皂苷a和柴胡皂苷d具有更高的耐受性。

实施例6：柴胡皂苷a、b2、c和d抗三阴性乳腺癌的作用机制研究

首先将处于对数生长期的hcc1937细胞接种于培养皿(规格为6cm)中，密度为8×10⁵个。培养24h之后，加入浓度为20μmol/ml、80μmol/ml、80μmol/ml和10μmol/ml的柴胡皂苷a、b2、c和d，处理24h之后，加入细胞裂解液，提取全细胞蛋白，通过蛋白含量测定试剂盒测定蛋白浓度，取15μg的蛋白上样至sds-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)，电泳分离后转至pvdf膜，用5％bsa进行蛋白封闭后，加入一抗过夜，β-actin和β-catenin的浓度比例为1:1000，加入二抗后，通过elc发光检测蛋白含量，结果见图7。从图中可以看出柴胡皂苷a和柴胡皂苷d能够降低β-catenin蛋白的表达且表现出显著性差异。因此，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d通过下调β-catenin蛋白来抑制三阴性乳腺癌细胞hcc1937的增殖。