一种高纯度抗蛇毒血清制备方法与流程

本发明涉及一种生物制剂的制备方法，具体是指用于制备抗蛇毒血清的一种高纯度抗蛇毒血清制备方法。

背景技术：

说明：抗蛇毒血清f(ab’)2制剂为用于治疗人体毒蛇咬伤的生物制剂，抗蛇毒血清f(ab’)2制剂的纯度指标对于蛇毒伤患人体过敏副反应的影响较大，《中国药典》第三部2015年版，要求抗蛇毒血清f(ab’)2制剂的纯度指标不低于60％；抗毒抗体为免疫球蛋白(igg)上的片段；超免马血浆为从由蛇毒免疫后的活体马匹体内采集的马血制备的血浆制剂；本文的抗蛇毒血清f(ab’)2从超免马血浆中提取，超免马血浆中的免疫球蛋白(igg)中含有抗蛇毒抗体；

现有技术采用超免马血浆经胃蛋白酶消化、硫酸铵纯化、明矾吸附的工艺方法制备抗蛇毒血清f(ab’)2，该方法制备工艺复杂，所获取的抗蛇毒血清f(ab’)2的纯度指标为60～70％，纯度难以进一步提高；因此，现有技术存在纯度难以提高、蛇毒伤患过敏副反应大的问题与不足。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题与不足，本发明采用胃蛋白酶消化，正辛酸沉淀分离、离子层析提纯的制备工艺，利用正辛酸对免疫球蛋白(igg)之外的异杂蛋白都有致沉淀的特性，通过正辛酸进行沉淀排除异杂蛋白，再通过离子层析进行提纯，使抗蛇毒血清f(ab’)2的纯度得以提高的技术方案，提供一种高纯度抗蛇毒血清制备方法，旨在使抗蛇毒血清f(ab’)2制剂，达到提高纯度指标、降低蛇毒伤患过敏副反应的目的。

本发明的目的是这样实现的：一种高纯度抗蛇毒血清制备方法，包括材料和制备工艺，其中：

所述的材料为：

原浆：超免马血浆；

稀释剂：注射用水；

αph调节剂：稀盐酸1mol/l；

βph调节剂：氢氧化钠溶液，1mol/l；

γph调节剂：磷酸氢二钠溶液0.5mol/l；

酶解剂：胃蛋白酶，比活性1∶15000，10mmmol/l，盐酸活化；

沉淀剂：正辛酸，分析纯；

填料：离子交换层析填料，阴离子-琼脂糖deae-sepharose；

过滤膜：聚醚砜薄膜0.45μ；

超滤膜：聚醚砜薄膜30kd；

除菌膜：聚醚砜薄膜0.2μ；

a缓冲液：磷酸盐溶液50mmol/l+氯化钠溶液60mmol/l配制；

b缓冲液：磷酸盐溶液50mmol/l+氯化钠溶液1mol/l配制；

洗柱液：磷酸盐缓冲液0.2mol/l，磷酸盐+注射用水配制；

所述的制备工艺为酶解切断、沉淀分离、灭活过滤、层析提纯和脱盐除菌；

步骤一、酶解切断

将所述原浆置于搅拌机中，用1.2～2倍体积的所述稀释剂对所述原浆进行稀释搅拌，搅拌转速10～50转/分钟，搅拌用时15分钟，获得稀浆，之后，用所述αph调节剂将所述稀浆的ph值调节至ph3.0～3.4；获得酸浆；之后，所述酸浆温度控制在30～32℃，按所述原浆体积的0.5g/l的比例向搅拌机中加入所述酶解剂，进行搅拌混合酶解消化，搅拌转速10～100转/分钟，搅拌混合酶解消化用时5～6小时，酶解切断igg分子在重链间的二硫键c端，获得酶解浆；

步骤二、沉淀分离

在转速200～300转/分钟的持续搅拌状态下，在30分钟内将所述酶解浆温度降温至20～30℃，用所述βph调节剂将ph值调节至ph6.5±0.2，之后，按所述酶解浆3～5％的体积百分比向所述酶解浆内加入所述沉淀剂，再用所述βph调节剂将ph值调节至5.5±0.2进行搅拌沉淀反应，搅拌沉淀反应用时1小时，获得沉淀浆；之后，将所述沉淀浆移至离心机进行离心分离，离心转速3000～4000转/分钟，离心用时20分钟，停机，取之离心机上部澄清清液，获得a清液；

步骤三、灭活过滤

将所述a清液移至搅拌机内进行搅拌加热灭活，灭活温度57±1℃，搅拌转速10～50转/分钟，灭活用时1小时，之后，降温至25～30℃，降温用时30分钟，获得灭活液；之后，将所述灭活液移至过滤器中，用所述过滤膜进行过滤，收集滤液，获得b清液；

步骤四、层析提纯

用所述γph调节剂将所述b清液的ph值调节至ph5.8～6.2，用所述稀释剂将所述b清液的电导率调节至≤13ms/cm，获得层析液；使用离子交换层析仪对所述层析液进行层析提纯；

离子交换层析仪操作：

洗柱，将所述填料置于离子交换层析仪的层析柱内，之后，用所述稀释剂对所述层析柱进行洗柱，之后，再用所述洗柱液进行洗柱，直至离子交换层析仪出口的ph值呈ph6～8；之后，用所述a缓冲液对离子交换层析仪进行柱平衡处理，直至离子交换层析仪显示基线平衡；

将所述层析液泵入离子交换层析仪进行层析，泵入流速20～30mm/min，待uv280紫外吸收峰大于100mau时开始收集出口清液，在所述层析液泵毕之后，泵入所述a缓冲液对所述层析柱进行冲洗，用于冲洗的a缓冲液的用量为所述层析液原始体积的1/10～1/15，且继续收集出口清液，冲洗毕，再用所述层析柱1个柱床体积的所述b缓冲液泵入所述层析柱，对层析柱进行淋洗，且继续收集出口清液，至uv280紫外吸收峰值小于100mau时停止收集，获得层析液；

步骤五、脱盐除菌

将所述层析液移至超滤器中用所述超滤膜进行脱盐浓缩，之后，再移至过滤器中用所述除菌膜进行除菌过滤，获得高纯度抗蛇毒血清制品。

检测，参阅附图1，2，用本发明所制备的高纯度抗蛇毒血清制品，经高效液相色谱仪检测，抗蛇毒血清f(ab’)2的纯度大于80％。

工作原理及有益效果

由于正辛酸对免疫球蛋白(igg)之外的异杂蛋白都具有致沉淀的特性，采用正辛酸进行对所述酶解浆进行沉淀，因此，最大限度排除异杂蛋白，获得含高纯度抗蛇毒血清f(ab’)2成分的a清液，再通过离子层析进行提纯，使抗蛇毒血清制品的抗蛇毒血清f(ab’)2的纯度得以进一步的提高。

用本发明所制备的高纯度抗蛇毒血清制品的抗蛇毒血清f(ab’)2纯度大于80％，符合《中国药典》关于抗蛇毒血清f(ab’)2的纯度不低于60％的要求；应用时，大大降低了蛇毒伤患过敏副反应风险。

上述，本发明采用胃蛋白酶消化，正辛酸沉淀分离、离子层析提纯的制备工艺，利用正辛酸对免疫球蛋白(igg)之外的异杂蛋白都有致沉淀的特性，通过正辛酸进行沉淀排除异杂蛋白，再通过离子层析进行提纯，使抗蛇毒血清f(ab’)2的纯度得以提高的技术方案，克服了现有技术存在纯度难以提高、蛇毒伤患过敏副反应大的问题与不足，所提供一种高纯度抗蛇毒血清制备方法，使抗蛇毒血清f(ab’)2制剂，达到了提高纯度指标、降低蛇毒伤患过敏副反应的目的。

附图说明

附图为用本发明的一种高纯度抗蛇毒血清制备方法所制备的高纯度抗蛇毒血清制剂的不同批次的检测报告，检测仪器为高效液相色谱仪，图中表格内的面积％栏所显示的数据为纯度指标；

图1是检测报告1，纯度指标为84.127％；

图2是检测报告2，纯度指标为87.755％。

实施例说明

以下通过具体实施例对本发明的一种高纯度抗蛇毒血清制备方法作进一步详细说明，所属领域的技术人员可以参照实施例制得抗蛇毒血清f(ab’)2纯度大于80％的高纯度抗蛇毒血清制品，但不应理解为对本发明的任何限制。

具体实施方式

制备条件、设备

环境气压：一个大气压；环境温度：室温；

制备设施、设备：洁净室(c+a级)、搅拌机、离心机、离子交换层析仪、超滤器(30kd)、过滤器、ph计、烧杯、玻璃容器；聚醚砜薄膜0.45μ；聚醚砜薄膜0.2μ、聚醚砜薄膜30kd；

实施例、

品名：抗蛇毒血清f(ab’)2纯度大于80％的高纯度抗蛇毒血清制剂；

材料：

原浆：超免马血浆；

稀释剂：注射用水；

αph调节剂：稀盐酸1mol/l；

βph调节剂：氢氧化钠溶液，1mol/l；

γph调节剂：磷酸氢二钠溶液0.5mol/l；

酶解剂：胃蛋白酶，比活性1∶15000，10mmmol/l，盐酸活化；

沉淀剂：正辛酸，分析纯；

填料：离子交换层析填料，阴离子-琼脂糖deae-sepharose；

过滤膜：聚醚砜薄膜0.45μ；

超滤膜：聚醚砜薄膜30kd；

除菌膜：聚醚砜薄膜0.2μ；

a缓冲液：磷酸盐溶液50mmol/l+氯化钠溶液60mmol/l配制；

b缓冲液：磷酸盐溶液50mmol/l+氯化钠溶液1mol/l配制；

洗柱液：磷酸盐缓冲液0.2mol/l，磷酸盐+注射用水配制；

制备工艺依次为，酶解切断、沉淀分离、灭活过滤、层析提纯和脱盐除菌；

步骤一、酶解切断

将所述原浆置于搅拌机中，用1.2～2倍体积的所述稀释剂对所述原浆进行稀释搅拌，搅拌转速10～50转/分钟，搅拌用时15分钟，获得稀浆，之后，用所述αph调节剂将所述稀浆的ph值调节至ph3.0～3.4；获得酸浆；之后，所述酸浆温度控制在30～32℃，按所述原浆体积的0.5g/l的比例向搅拌机中加入所述酶解剂，进行搅拌混合酶解消化，搅拌转速10～100转/分钟，搅拌混合酶解消化用时5～6小时，酶解切断igg分子在重链间的二硫键c端，获得酶解浆；

步骤二、沉淀分离

在转速200～300转/分钟的持续搅拌状态下，在30分钟内将所述酶解浆温度降温至20～30℃，用所述βph调节剂将ph值调节至ph6.5±0.2，之后，按所述酶解浆3～5％的体积百分比向所述酶解浆内加入所述沉淀剂，再用所述βph调节剂将ph值调节至5.5±0.2进行搅拌沉淀反应，搅拌沉淀反应用时1小时，获得沉淀浆；之后，将所述沉淀浆移至离心机进行离心分离，离心转速3000～4000转/分钟，离心用时20分钟，停机，取之离心机上部澄清清液，获得a清液；

步骤三、灭活过滤

将所述a清液移至搅拌机内进行搅拌加热灭活，灭活温度57±1℃，搅拌转速10～50转/分钟，灭活用时1小时，之后，降温至25～30℃，降温用时30分钟，获得灭活液；之后，将所述灭活液移至过滤器中，用所述过滤膜进行过滤，收集滤液，获得b清液；

步骤四、层析提纯

用所述γph调节剂将所述b清液的ph值调节至ph5.8～6.2，用所述稀释剂将所述b清液的电导率调节至≤13ms/cm，获得层析液；使用离子交换层析仪对所述层析液进行层析提纯；

离子交换层析仪操作：

洗柱，将所述填料置于离子交换层析仪的层析柱内，之后，用所述稀释剂对所述层析柱进行洗柱，之后，再用所述洗柱液进行洗柱，直至离子交换层析仪出口的ph值呈ph6～8；之后，用所述a缓冲液对离子交换层析仪进行柱平衡处理，直至离子交换层析仪显示基线平衡；

将所述层析液泵入离子交换层析仪进行层析，泵入流速20～30mm/min，待uv280紫外吸收峰大于100mau时开始收集出口清液，在所述层析液泵毕之后，泵入所述a缓冲液对所述层析柱进行冲洗，用于冲洗的a缓冲液的用量为所述层析液原始体积的1/10～1/15，且继续收集出口清液，冲洗毕，再用所述层析柱1个柱床体积的所述b缓冲液泵入所述层析柱，对层析柱进行淋洗，且继续收集出口清液，至uv280紫外吸收峰值小于100mau时停止收集，获得层析液；

步骤五、脱盐除菌

将所述层析液移至超滤器中用所述超滤膜进行脱盐浓缩，之后，再移至过滤器中用所述除菌膜进行除菌过滤，获得抗蛇毒血清f(ab’)2纯度大于80％的高纯度抗蛇毒血清制剂。